1.6: Pruebas para alimentos modificados genéticamente

1. extracción de ADN de muestras de alimentos

1. Añadir 500 μl de la matriz de mezcla PCR comprado a cada uno de los 2 tubos de tapón de rosca con una pipeta de transferencia o micropipeta de volumen ajustable de 200-1.000 μl. Pipetee hacia arriba y hacia abajo con la pipeta entre cada alícuota para mezclar uniformemente la matriz de la polimerización en cadena.
2. Etiquetar un tubo de tapón de rosca "sin transgénicos" y otra "prueba".
3. Pesar 0,5 g de alimentos no-GMO certificados y poner en el mortero.
4. Añadir 2,5 mL de agua destilada y moler con mortero por 2 min formar una mezcla.
5. Añadir otros 2,5 mL de agua destilada y continuar la molienda con mortero hasta que la mezcla se convierte en lo suficientemente suave para pipeta.
6. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de suelo al tubo de tapón de rosca conteniendo 500 μl de premezcla de PCR con la etiqueta "no-OGM" usando la marca de 50-μL en una pipeta graduada. Tapar el tubo.
7. Repita los pasos 1.3 – 1.6 para preparar la muestra de alimento.
8. Extraiga con pipeta 50 μl de mezcla de alimentos de prueba de suelo al tubo de tapón de rosca etiquetado como "prueba". Tapar el tubo.
9. Vortex no-GMO alimentos y prueba PCR tubos para tubos de 1 min y coloque en baño de agua de 95 ° C durante 5 minutos. Si no se dispone de ningún vórtice, flick el tubo varias veces para mezclar antes de colocar en baño de agua.
10. Colocar tubos en una centrífuga durante 5 minutos. Debe formar una pelotilla sólida en la parte inferior del tubo. Si el pellet no está formado después de 5 min, centrifugar nuevamente por intervalos de 2 min hasta que se forme de la pelotilla.
11. Tubos pueden ser utilizados inmediatamente para PCR o almacenados en el refrigerador hasta por 1 semana.

2. Ajuste de reacciones de PCR

1. Número de tubos de PCR 1 – 6 y les inicial. El número debe corresponder a los siguientes contenidos del tubo aparece en la tabla 1.
2. Coloque cada tubo PCR marcado en un porta de microtubo con las tapas abiertas.
3. Usando una punta nueva para cada adición, agregar 20 μl de la cartilla que se indica en la tabla 1 para cada tubo PCR. Tubos con tapón.
4. Usando una punta nueva para cada tubo, agregar 20 μl de la muestra de ADN indicada en la tabla 1 para cada tubo de PCR, asegurándose de que la pipeta solo partir del sobrenadante y evitando el sedimento sólido en la parte inferior de los tubos.
5. Después de cada muestra de ADN se pipetea en el tubo correspondiente de polimerización en cadena, utilice la pipeta para mezclar ADN y cartilla pipeteando suavemente de arriba abajo; volver a tapar los tubos.
6. Colocar tubos PCR en termociclador y programa al cycler para:
   Desnaturalizar inicial: 1 ciclo a 94 ° C por 2 min.
   Amplificación: 40 ciclos a 94 ° C por 1 min (desnaturalizar), 59 ° C por 1 min (recocido) y 72 ° C por 2 min (extensión).
   Extensión final: 1 ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
   Hold: 4 ° C indefinidamente.

3 Preparación del Gel de agarosa al 3%

1. Con laboratorio o cinta adhesiva, cinta firmemente de los extremos abiertos de la bandeja de gel. Asegúrese de cinta está sellada en los bordes de la bandeja para evitar que la agarosa fundida escaparse hacia fuera.
2. Pesar 3 g de agarosa en un erlenmeyer de 250 mL o más grande.
3. Añadir 100 mL de tampón de x TAE 1 (comprado o preparado de concentrado).
4. Usando una placa magnética con una barra de agitación, calentar el vaso de precipitados hasta que la agarosa se disuelva completamente en el búfer y la solución hierve y se vuelve claro. Alternativamente, puede utilizarse un horno de microondas por colocar la taza en el horno y calefacción para intervalos de 30 s, usando una varilla de agitación para mezclar cada 10 s, repitiendo hasta que la mezcla está hirviendo y vueltas claro.
5. Invertir un matraz Erlenmeyer de 50 mL dentro de la abertura del frasco de 250 mL para actuar como un reflujo, impidiendo la evaporación de solución de agarosa.
6. Deje que la solución de agarosa enfriar a 60 ° C y verter 30-50 mL en cada bandeja de gel con cinta.
7. Coloque un peine de gel en el primer par de muescas para crear pozos de gel.
8. Deje el gel se enfríe completamente antes de retirar la cinta y peine. Gel se solidifique y vuelta de claro a turbio cuando listo, aproximadamente 10-20 minutos.

4. electroforesis de los productos PCR

1. Un gel de agarosa 3% hecha de antemano sobre una bandeja de gel o utilice una bandeja de gel que se ha utilizado para lanzar un gel de agarosa 3% vertido.
2. Deslice la bandeja de gel en la cámara de electroforesis con los pozos más cercanos al extremo del cátodo (negro).
3. Vierta 1 buffer de x TAE en la cámara, lo suficiente para tener 2 mm de tampón sobre la parte superior de la bandeja de gel.
4. Obtener tubos PCR de Termociclador y lugar en soporte para microtubo.
5. Utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, añadir 10 μl de compra anaranjado G carga del tinte (LD) para cada muestra y mezclar bien.
6. Carga 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel en el orden indican (tabla 2).
7. Electroforesis del gel del funcionamiento durante 30 min a 100 V.
8. Retire la bandeja de gel de gel cámara y deslice para quitar de la bandeja. Coloque el gel en una bandeja de tinción.
9. Sumergir el gel en la mancha de gel ADN adquirida durante 5 min., agitando cuidadosamente la bandeja para ayudar a distribuir la tinción en el gel.
10. Transferir el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua corriente (40-55 ° C) para aproximadamente 10 s.
11. Desmanchar por 3 x el lavado en agua caliente del grifo durante 6 min con suave agitación para obtener mejores resultados. Si es necesario, continuar la extracción en agua caliente hasta que se alcanza el contraste deseado.

Tabla 1. Lista de los números de tubo adecuado, imprimaciones y muestras de ADN.

Tabla 2. El orden adecuado para cargar 20 μl de la regla de peso molecular y 20 μl de cada muestra en el gel.

Los alimentos genéticamente modificados son productos que contienen un ingrediente o ingredientes cuyo ADN ha sido específicamente alterado. La presencia de estas modificaciones se puede detectar mediante una técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa.

La modificación genética de los alimentos ha sido un tema controvertido debido a las preocupaciones debatidas sobre la salud y la seguridad ambiental. La capacidad de detectar ADN genéticamente alterado en muestras de alimentos de interés permite la toma de decisiones informadas sobre la seguridad y los peligros potenciales del uso de organismos genéticamente modificados, o OGM, en los suministros de alimentos.

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, se utiliza para amplificar el ADN de los alimentos para determinar la presencia o ausencia de secuencias modificadas genéticamente. A continuación, la electroforesis en gel extrae el ADN amplificado a través de una matriz de gel de agarosa y separa las bandas de ADN de diferentes tamaños que corresponden a marcadores modificados o no modificados. A continuación, se comparan con las bandas de control de los alimentos que se sabe que contienen OGM o que se sabe que no contienen modificaciones.

Este video ilustrará los principios detrás de la detección de ADN genéticamente modificado a partir de muestras de alimentos, cómo extraer ADN y amplificar los marcadores utilizados en el proceso de modificación genética, y cómo se puede establecer la presencia o ausencia de OGM en muestras de alimentos.

La reacción en cadena de la polimerasa identifica secuencias de ADN que se han insertado en el alimento modificado genéticamente. El ADN es una molécula relativamente estable, por lo que los fragmentos de ADN viables adecuados para la amplificación pueden aislarse incluso de productos altamente procesados, como chips de maíz o hamburguesas de verduras. Se utiliza un pequeño número de secuencias de ADN reguladoras para controlar la expresión de los genes insertados, por lo que estas secuencias están presentes en la mayoría de los cultivos transgénicos. Este procedimiento identifica dos de los más utilizados, el gen promotor 35S y el gen terminador de la nopalina sintasa. La secuencia 35S es un promotor fuerte, y cuando se une a un gen insertado impulsará niveles altos y constantes de expresión. Se incluye el terminador de nopalina sintasa para detener la transcripción del gen insertado en el punto final deseado.

La PCR implica ciclos repetitivos de calentamiento y enfriamiento en un termociclador, una máquina que controla estrictamente la temperatura de los tubos de reacción de PCR. Calentar la muestra a 94 ? C hace que las hebras de ADN se desnaturalicen y se separen. Enfriamiento rápido entre 45 y 65 ? C permite que los cebadores recocen las hebras de ADN separadas. Finalmente, recalentar a 72 ? C permite que la enzima polimerasa Taq extienda los cebadores y complete la duplicación de la región objetivo.

El cebador vegetal comprado se agrega a cada muestra y se amplificará en muestras que contengan ADN de planta. Las plantillas positivas de OGM para 35S y NOS se utilizan para proporcionar un control positivo de los OGM. Un certificado no transgénico se utiliza como control negativo. Si alguna de estas reacciones de control muestra bandas inesperadas, no se puede confiar en los resultados de las muestras de prueba.

El ADN amplificado se pasa a través de un gel de agarosa por electroforesis. Los productos de PCR se mezclan con un tinte y se cargan en pocillos. El ADN está cargado negativamente, y cuando se carga en el gel en el extremo del cátodo de la cámara, se moverá hacia el extremo del ánodo cuando se aplique corriente. Los fragmentos de ADN más grandes no pueden moverse tan fácilmente a través de la matriz de gel, por lo que permanecerán más cerca del cátodo, mientras que las secuencias más pequeñas se mueven hacia el extremo del ánodo, lo que resulta en la separación de ADN de diferentes tamaños en bandas distintas.

Después de la electroforesis, la tinción en gel ayuda a visualizar las bandas de ADN separadas.

Ahora que estamos familiarizados con los principios detrás de la detección de OGM y el uso de la PCR y la electroforesis para la identificación de OGM, echemos un vistazo a cómo se puede llevar a cabo esto en el laboratorio.

Una vez identificados los productos alimenticios de interés, se puede iniciar el análisis. Para extraer el ADN, tome dos tubos de rosca limpios y transfiera a cada uno de ellos 500 ? L de reactivo de aislamiento de ADN comprado, asegurándose de pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo entre las alícuotas para mezclar uniformemente el reactivo. Etiquete uno de los tubos como "no transgénico" y el otro como "Prueba".

A continuación, pese 0,5 g de alimentos certificados como no transgénicos y colóquelos en un mortero limpio. Agregue 2,5 ml de agua destilada y muela con el mortero durante 2 minutos para formar una papilla. Agregue otros 2,5 ml de agua destilada y continúe moliendo la lechada hasta que esté lo suficientemente suave como para pipetear.

Pipeta 50 ? L de la suspensión conocida como no OGM al tubo con tapón de rosca marcado como "no OGM" que contiene el reactivo de aislamiento de ADN. Ahora agregue 50 ? L de la suspensión de la muestra de alimentos de prueba al tubo con tapón de rosca marcado como "Prueba". Agite los dos tubos que contienen las muestras de alimento y el reactivo de ADN durante 1 min. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua a 95 ? C durante 5 min. Finalmente, coloque los tubos en una centrífuga durante 5 min. Tras el examen, se debe formar una bolita sólida en el fondo del tubo. Si no se forma un pellet después de 5 min, centrifugue nuevamente durante intervalos de 2 min hasta que se forme un pellet. Las muestras ahora se pueden usar inmediatamente para PCR o almacenarse en un refrigerador hasta por 1 semana.

En primer lugar, los seis tubos de PCR. Estos números corresponderán al contenido del tubo que se indica en la tabla. Coloque cada uno de los tubos de PCR etiquetados en un soporte de microtubos con las tapas abiertas.

Usando una punta nueva para cada adición, agregue 20 ? L cebador indicado en la Tabla a cada tubo de PCR. A continuación, agregue 20 ? L de las muestras de ADN indicadas en la Tabla a cada tubo de PCR. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar. En el caso de las muestras granuladas, asegúrese de pipetear únicamente con el sobrenadante y evite la gránula sólida en la parte inferior de los tubos. Finalmente, coloque los tubos de PCR en un termociclador y prográmelo para que pase por los pasos de calentamiento y enfriamiento indicados en la tabla.

Coloque un gel de agarosa al 3% en la cámara de electroforesis con los pocillos más cercanos al extremo del cátodo. Agregue tampón TAE en la cámara para cubrir 2 mm por encima de la bandeja de gel. Recoja los tubos de PCR del termociclador y colóquelos en un soporte de microtubos. Usando una punta de pipeta nueva cada vez, agregue 10 ? L de ADN comprado cargando tinte a cada muestra y mezcle bien.

Usando una punta nueva cada vez, cargue los pocillos del gel de agarosa con 20 ? L de la regla de peso molecular en un pocillo, y 20 ? L de cada muestra en pocillos subsiguientes, como se indica en esta tabla. Configure la cámara de electroforesis para que funcione a 100 V durante 30 minutos.

Una vez que el gel haya terminado de correr, desenchufe con cuidado la cámara de gel, retire la bandeja y deslice el gel en una bandeja de tinción. Sumerja el gel en la mancha de gel 100x comprada durante 5 minutos, agitando suavemente la bandeja para distribuir la mancha. Una vez manchado, transfiera el gel a un recipiente de lavado y enjuague con agua del grifo durante aproximadamente 10 s. Elimine las manchas lavando tres veces con agua tibia del grifo durante 3 minutos cada una, cada una agitando suavemente para obtener mejores resultados. Si es necesario, continúe decolorando en agua tibia hasta alcanzar el contraste deseado.

La presencia o ausencia de una banda de 200 pb en el carril 4 indica si el alimento de prueba contiene OMG. Los cebadores de plantas determinan si el ADN de la planta se extrajo con éxito de la muestra. El control de alimentos no transgénicos es un indicador de resultados falsos positivos, en caso de que se produzcan. Si el control de alimentos no transgénicos sale positivo, significa que la PCR estuvo contaminada en algún momento. El control de plantilla positivo para OGM es un indicador de falsos negativos. Si el control de plantilla positivo para OGM no se amplifica, hay un problema con la reacción de PCR y no se puede confiar en un resultado negativo para OGM del alimento de prueba.

Los geles se pueden colocar sobre un papel blanco o amarillo para proporcionar un fondo contrastante para resaltar las bandas de ADN, o se puede lograr un mayor contraste utilizando una caja de luz ultravioleta.

La capacidad de analizar alimentos o productos para detectar ingredientes modificados genéticamente es pertinente para una serie de aplicaciones científicas o reglamentarias.

Existe cierta evidencia de que el ADN transgénico de los cultivos genéticamente modificados puede introducirse en los genomas de las poblaciones de cultivos silvestres. Por ejemplo, los polinizadores pueden facilitar esta transferencia fertilizando plantas de tipo silvestre con polen de una fuente modificada genéticamente. Esto es preocupante, ya que los impactos de la propagación de estos genes insertados en los ecosistemas en su conjunto no se comprenden bien. Las pruebas de PCR de poblaciones silvestres pueden proporcionar datos sobre la posible propagación, o la contención exitosa, de las inserciones genéticas.

La falta de etiquetado o el etiquetado incorrecto de los ingredientes genéticamente modificados puede ser una preocupación para el consumidor. Esto puede deberse a la preferencia de consumo del consumidor, o a la posible introducción de alérgenos durante el proceso de transgénicos, aunque esto último es controvertido. En algunos países, se exige que los ingredientes modificados genéticamente figuren en los envases de los alimentos. Las juntas reguladoras de dichos países pueden utilizar las pruebas de PCR para comprobar la exactitud del etiquetado de los alimentos.

En los casos en que la modificación genética introducida en un cultivo confiere resistencia a los plaguicidas, algunos estudios han suscitado preocupación por la producción de "supermalezas". Esencialmente, puede tratarse de cualquier planta que no haya sido inicialmente objeto de modificación y que obtenga la resistencia a los plaguicidas a través de mecanismos como la introgresión o la hibridación. Estas plantas pueden ser capaces de propagarse con más éxito y ser más difíciles de controlar que las que no tienen el inserto. Las pruebas de PCR para la modificación genética pueden ayudar a resaltar y rastrear dichas poblaciones potenciales para determinar si esta propagación podría resultar problemática.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las pruebas de alimentos transgénicos. Ahora debe comprender los principios detrás de la identificación de alimentos modificados genéticamente mediante PCR, cómo extraer y amplificar el ADN de los alimentos y cómo determinar si su muestra de alimentos ha sido modificada genéticamente. ¡Gracias por mirar!