Cultivo y enumeración de bacterias a partir de muestras de suelo

Determinar un conteo preciso de bacterias ambientales es fundamental para evaluar la salud de un ecosistema de suelo. Esto se puede lograr mediante el cultivo de colonias bacterianas con diluciones adecuadas.

Las bacterias del suelo son una parte importante de un ecosistema de suelo saludable, ya que desempeñan un papel en la descomposición, la fijación de nitrógeno y el ciclo de nutrientes. Los suelos superficiales son un sustrato de partículas orgánicas e inorgánicas que forman una matriz compleja que rodea los poros y que se llenan de aire o agua. Estas condiciones crean un ecosistema ideal para las bacterias, ya que los suelos superficiales suelen contener más de un millón de bacterias por gramo.

Debido a esta alta concentración de bacterias, es necesaria la dilución antes de colocar en el medio de crecimiento. Las diluciones en serie pueden reducir la concentración de la muestra de suelo original a niveles lo suficientemente bajos como para que se cultiven colonias individuales en placas de medios, lo que permite el cálculo de los recuentos iniciales de bacterias en la muestra de suelo.

Este video ilustrará cómo preparar diluciones en serie de muestras de suelo, cómo colocar estas muestras bacterianas en placas y cómo calcular los recuentos de bacterias en el suelo a partir de las placas de dilución.

Las bacterias son organismos procariotas simples, pero muy diversos en términos de especies y ecosistema. Los actinomicetos son un subconjunto de bacterias que con frecuencia se consideran un grupo único debido a su estructura filamentosa, donde crecen unidas para formar hifas.

Por lo general, los actinomicetos representan el 10% de la población bacteriana total en el suelo. Las bacterias y los actinomicetos son abundantes en casi todos los ambientes de la Tierra, pero se encuentran en una diversidad y abundancia incomparables en el suelo.

Las bacterias del suelo se enumeran, y potencialmente se cultivan e identifican mediante placas de dilución. Aquí, una muestra de suelo se diluye en serie en agua y luego se dispersa en placas de crecimiento de agar. A continuación, se cuentan las colonias resultantes. Este valor, junto con el factor de dilución, se utiliza para dilucidar la concentración inicial de bacterias en el suelo.

La siembra de dilución es un método común, económico y sencillo para la enumeración de bacterias, pero sufre varios inconvenientes. No se debe permitir que el suelo se asiente durante las diluciones, lo que podría provocar un crecimiento sesgado. Algunas bacterias del suelo no se cultivan en las placas o crecen demasiado lentamente para ser observadas. Además, este método supone que las colonias se forman a partir de una sola bacteria, pero pueden surgir de grupos de múltiples células.

Ciertas especies bacterianas crecen mejor en diferentes medios de crecimiento. Un sustrato común para cultivar una amplia gama de bacterias es una placa de levadura de agar-peptona. Los actinomicetos crecen preferentemente en placas a base de glicerol-caseína, que se adaptan mejor al crecimiento de estas bacterias filamentosas.

Ahora que entiendes el concepto detrás de la enumeración de bacterias, veamos cómo se lleva a cabo este proceso en el laboratorio.

Para comenzar el procedimiento, pese 10 g de muestra de suelo y agregue a 95 mL de agua desionizada. Agite bien la suspensión y etiquétela como "A". Antes de que el suelo se asiente, retire 1 mL de la suspensión con una pipeta estéril y transfiéralo a 9 mL de agua desionizada. Vórtice a fondo, y etiquételo como "B".

Repita este paso de dilución 3 veces, cada vez con 1 mL de la suspensión anterior y 9 mL de agua desionizada. Etiquételos secuencialmente como tubos C, D y E. Esto da como resultado diluciones en serie de 10-1 a 10-5 gramos de suelo por mL.

Para cultivar colonias bacterianas, tome 3 placas de agar de peptona y levadura preparadas previamente y etiquételas como C, D y E. Vierta las muestras correspondientes y pipetee 0,1 ml en cada placa. Dado que las UFC se informan por mL, el uso de 0.1 mL aumenta aún más la dilución en un factor de diez.

A continuación, sumerja un esparcidor de vidrio en etanol. Coloque el esparcidor en una llama durante unos segundos para encender y quemar el etanol. Esto esterilizará el esparcidor.

Sostenga el esparcidor sobre la primera placa hasta que se apague la llama. Abra la placa rápidamente, sosteniendo la tapa cerca. Toque el esparcidor con el agar lejos del inóculo para que se enfríe, y luego extienda la gota de inóculo por la superficie hasta que desaparezcan los rastros de líquido libre. Vuelva a colocar la tapa del plato.

Vuelva a encender el esparcidor y repita el proceso con la siguiente placa, trabajando rápidamente para no contaminar la placa con organismos transportados por el aire. Invierta las placas para evitar que caigan gotas de humedad sobre el agar e incube las placas a temperatura ambiente durante una semana.

Para cultivar actinomicetos, tome tres placas de glicerol-caseína preparadas previamente y etiquételas como B, C y D. Usando las técnicas mostradas anteriormente, extienda la placa 0.1 mL de las suspensiones B, C y D. Las diluciones más bajas se utilizan porque los actinomicetos suelen estar presentes como 1/10 de la población bacteriana.

Por último, invierta estas placas y guárdelas a temperatura ambiente durante dos semanas.

Después de la incubación, examine cuidadosamente todas las placas de bacterias y observe las diferencias en el tamaño y la forma de la colonia. Cuando se cultivan en agar, las bacterias producen colonias viscosas que van desde incoloras hasta naranjas brillantes, amarillas o rosas. Por el contrario, las colonias de actinomicetos son calcáreas, firmes, coriáceas y se rompen bajo presión, mientras que otras colonias bacterianas se manchan. Esto permite que las colonias se distingan al tacto con un bucle estéril.

Cuente y registre el número de colonias bacterianas, incluidos los actinomicetos. Solo cuente las placas con 30-200 colonias por placa.

Para cultivar cultivos de bacterias individuales específicas, seleccione colonias discretas de cualquiera de las placas, eligiendo colonias que estén bien separadas de las colonias vecinas. Esterilice un bucle de esparcimiento, luego abra la placa y toque el bucle con un lugar vacío para que se enfríe. A continuación, elija una pequeña cantidad de la colonia de interés en el bucle.

Tomando un plato fresco de peptona y levadura, haga una raya de unos centímetros de largo en un lado. Esterilizar y enfriar nuevamente, luego haga una raya que cruce la raya inicial solo en la primera pasada. Repite este proceso dos veces más de la misma manera. Esta "dilución" de rayas da como resultado que las células del bucle se separen entre sí. Coloque la placa en un área oscura para incubar a temperatura ambiente durante dos semanas.

A partir de los recuentos de colonias bacterianas y actinomicetos, se pueden determinar las Unidades Formadoras de Colonias por gramo de suelo. El número de colonias por gramo de suelo es igual al número de colonias contadas en la placa, multiplicado por el recíproco de la dilución en placa. Por ejemplo, si se cuentan 46 colonias en una placa de dilución de 10-5 con un inoculante de 0,1 mL, entonces las UFC por gramo de suelo son iguales a 10-6 por 46, o 46 millones de UFC por gramo de suelo.

La realización de recuentos y cultivos bacterianos es un primer paso clave en muchas investigaciones o protocolos científicos.

Un suelo sano contiene entre 106 y 108 bacterias por gramo. La enumeración bacteriana del suelo se puede utilizar para determinar la salud de los suelos de interés, y los recuentos de menos de 106 y 108 bacterias por gramo indican un suelo poco saludable o pobre. Esto puede ser causado por la falta de nutrientes o materia orgánica, el estrés abiótico debido al pH extremo del suelo o la contaminación del suelo.

Muchos tipos de antibióticos utilizados en la medicina actual se identificaron por primera vez a partir de bacterias u hongos que habitan en el suelo. El aislamiento de cepas puras de cultivos en suelo puede ayudar potencialmente a los científicos a identificar nuevos compuestos antibióticos. Aquí, se pueden agregar bacterias de prueba o compuestos aislados de interés a placas cultivadas con céspedes bacterianos, y se pueden registrar sus efectos sobre el crecimiento del césped. Las manchas claras en el césped bacteriano donde el crecimiento fue inhibido por la bacteria o el compuesto de prueba pueden indicar actividad antibiótica.

Las plantas leguminosas, como los guisantes y los frijoles, dependen de relaciones simbióticas con las bacterias fijadoras de nitrógeno. Estas bacterias viven libremente en el suelo o dentro de nódulos en el sistema radicular y producen compuestos de nitrógeno que son utilizados por la planta. En suelos pobres, complementar los cultivos de leguminosas con bacterias fijadoras de nitrógeno cultivadas de los suelos puede estimular el crecimiento y la salud de las plantas. Esto puede dar lugar a plantas más grandes y resistentes, que a su vez proporcionan un mayor rendimiento de los cultivos.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la enumeración bacteriana. Ahora debe comprender cómo realizar diluciones de muestras de suelo, cómo colocar placas para el recuento de colonias y el aislamiento de colonias, y cómo calcular la cantidad de bacterias en muestras de suelo. ¡Gracias por mirar!