Cultivo y enumeración de bacterias a partir de muestras de suelo

1. preparación de diluciones de suelo

1. Para comenzar el procedimiento, pesar 10 g de muestra de suelo y añadir a 95 mL de agua desionizada. Agite bien la suspensión y la etiqueta como "A".
2. Antes de que el suelo se instala, extraiga 1 mL de la suspensión con una pipeta estéril y transferir a un espacio en blanco de 9 mL de agua desionizada. Vórtice y la etiqueta "B".
3. Repita este paso de dilución tres veces, cada vez con 1 mL de la suspensión anterior y un 9 mL desionizada en blanco. Etiquetar estos secuencialmente como tubos de C, D y E. Esto se traduce en diluciones seriadas de 10^-1 a través de 10^-5 gramos de suelo por mL

2. hacer el extendido placas para cultivo bacteriano

1. Para hacer crecer colonias de bacterias, tomar tres placas de agar levadura peptona preparados y etiqueta como C, D y E. agitar las muestras C, D y E y pipeta de 0.1 mL en cada placa. Esto aumenta el valor de la dilución más, por un factor de diez (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. A continuación, sumerja un separador de cristal en etanol. Coloque el separador en una llama durante unos segundos para encender y quemar el etanol. Esto esterilizará el separador.
3. Mantenga el separador por encima de la primera placa hasta que la llama se extingue. Abra la placa rápidamente, manteniendo la tapa cerca de. Toque el separador para el agar de inóculo (inóculo = utilizadas para iniciar un cultivo de células) a enfriar y luego la gota de inóculo alrededor de la superficie del agar hasta que desaparezcan los rastros de líquido libre. Vuelva a colocar la tapa de la placa.
4. Volver a la llama el separador y repita el proceso con el próximo funcionamiento de la placa, rápidamente para que no se contamine el agar con organismos aerotransportados
5. Incubar las placas de las bacterias a temperatura ambiente durante 1 semana. Asegúrese de que las placas son invertidas durante la incubación para evitar gotas de humedad de la condensación caigan sobre la superficie del agar.

3. hacer el extendido placas para actinomicetos

1. Para crecer actinomicetos, tomar tres platos preparados glicerol-caseína y etiquetarlos como B, C y D. utilizando las técnicas mostradas anteriormente, coloque la placa 0,1 mL de las suspensiones B, C y D. Las diluciones más bajas se utilizan porque actinomicetos están típicamente presentes como 1/10^th de la población bacteriana (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incubar las placas de Actinomiceto (invertidas) a temperatura ambiente durante 2 semanas.

4. bacterias y cuentas de Actinomiceto

1. Después de la incubación, examinar todas las placas bacterias cuidadosamente y tenga en cuenta las diferencias en forma y tamaño de la Colonia. Cuando se cultiva en agar, las bacterias producen colonias viscosos desde incoloro a color naranja brillante, amarillo o rosa. Por el contrario, actinomycete colonias son calcáreos, firme, correosa y se romperán bajo presión, donde otras colonias de bacterias se manchan. Esto permite distinguir por el tacto con un asa estéril colonias.
2. Cuente y anote el número de colonias bacterianas, incluyendo cualquier actinomicetos. Sólo contar las placas con 30-200 colonias por placa.

5. aislamiento de cultivos puros

1. Seleccione las colonias bacterianas individuales de cualquiera de las placas. Más colonias se pueden seleccionar si hay especial interés en el suelo. Utilice una placa de alta dilución, ya que tiende a tener colonias puras que se separan bien. Seleccionar sólo las colonias que están muy separadas de colonias vecinas y parecen morfológicamente distintos unos de otros.
2. Esterilice el asa por inmersión en alcohol y flamearlo. Rápidamente Abra la caja Petri de interés y toque el lazo a un lugar pelado en el agar para enfriarlo. Luego, extraer una pequeña cantidad de una colonia de interés en el bucle.
3. Tomar una placa de peptona-levadura fresca, hacer una racha de unos pocos centímetros de un lado. Esterilizar y enfriar otra vez, y hacer una raya que cruza la franja inicial sólo en la primera pasada. Repita este proceso dos veces más de la misma manera. Este talento "dilución" produce en las células en el lazo de ser separados uno del otro. Coloque la placa en un lugar oscuro a incubar a temperatura ambiente durante dos semanas.