3: Curvas de calibración

1. hacer los estándares: diluciones seriadas

1. Hacer una solución madre concentrada de la norma. Normalmente, el compuesto es exactamente pesado y transfieren cuantitativamente a un matraz volumétrico. Añadir solvente, mezcla por lo que la muestra se disuelve, luego llene hasta la línea con el solvente adecuado.
2. Realizar diluciones seriadas. Tomar otro matraz volumétrico y pipetear la cantidad de estándar necesario para la dilución, luego llenar hasta la línea con solvente y mezclar. Una dilución diez veces es por lo general, de un matraz aforado de 10 mL, añadir 1 mL de la dilución anterior.
3. Continuar según sea necesario para más diluciones, uso de la solución anterior para diluir para hacer la siguiente muestra. Para una curva de calibración buena, se necesitan al menos 5 concentraciones.

2. ejecutar los ejemplos de la curva de calibración y lo desconocido

1. Ejecutar los ejemplos con el espectrofotómetro de UV-Vis para determinar la respuesta instrumental necesaria para la curva de calibración.
2. Tomar la lectura con la primera muestra. Es una buena idea para ejecutar las muestras en orden aleatorio (es decir, no más alto al más bajo o más bajo a más alto) en caso de que hay algún error sistemático. Con el fin de obtener una estimación del ruido, repita la lectura en cualquier muestra dada x 3 – 5.
3. Ejecutar los ejemplos estándar adicionales, repetir las mediciones para cada muestra obtener una estimación del ruido. Registrar los datos para hacer una trama más adelante.
4. Ejecutar las muestras desconocidas. Utilizar como condiciones similares a la ejecución de las normas como sea posible. Así, la matriz de la muestra o el tampón debe ser el mismo, el pH debe ser el mismo, y la concentración debe ser en la gama de los estándares de ejecutar.

3. hacer la curva de calibración

1. Registrar los datos en una hoja de cálculo y utilizar un programa de computadora para representar la concentración de datos vs. Si se tomaron medidas al menos por triplicado para cada punto, se pueden trazar la barras de error de la desviación estándar de las mediciones para estimar el error de cada punto. Para algunas curvas, los datos necesario trazar un eje como un registro para obtener una línea. La ecuación que gobierna la curva de calibración se conoce generalmente antes de tiempo, por lo que una parcela de registro se utiliza cuando hay un registro en la ecuación.
2. Examinar la curva de calibración. ¿Parece lineal? ¿Tiene una parte que se ve no lineal (es decir, alcanzado el límite de la respuesta instrumental)? Para comprobar, ajustar todos los datos para una regresión lineal utilizando el software. Si el coeficiente de determinación (R²) no es alta, quitar algunos de los puntos al principio o al final de la curva que no aparecen caber la línea y realizar otra vez la regresión lineal. No es aceptable para quitar los puntos en el centro sólo porque tienen una barra de error grande. De este análisis, decidir qué porción de la curva es lineal.
3. La salida del lineal debe ser una ecuación de la formato y = mx + b, donde m es la pendiente y b es el intercepto de y. Las unidades de la pendiente son la unidad de eje y o concentración, en este ejemplo (figura 1) absorbancia/μM. Las unidades de la intersección son las unidades del eje y. Se obtiene un coeficiente de determinación (R²). Cuanto mayor sea el R² mejor el ajuste; un ajuste perfecto da un R² de 1. El programa también puede ser capaz de dar una estimación del error de la pendiente y el intercepto.

4. resultados: Curva de calibración de absorbancia del colorante azul #1

1. La curva de calibración de absorbancia del colorante azul #1 (en 631 nm) se muestra a continuación (figura 1). La respuesta es lineal de 0 a 10 μm. sobre que concentración de la señal comienza a nivel de porque la respuesta está fuera del rango lineal del espectrofotómetro UV-Vis.
2. Calcular el LOD. De la pendiente de la curva de calibración, es el LOD 3*S.D. (ruido) / m. Para esta curva de calibración, el ruido se obtuvo tomando una desviación estándar de mediciones repetidas y 0.021. El LDD sería 3*0.021/.109=0.58 μm.
3. Calcular la LDC El LOQ es 10*S.D. (ruido) / m. Para esta curva de calibración, LOQ es 10*0.021/.109 = 1.93 μm.
4. Calcular la concentración del desconocido. Utilice la ecuación de la línea para calcular la concentración de la muestra desconocida. La curva de calibración sólo es válida si el desconocido cae en el rango lineal de las muestras estándar. Si las lecturas son demasiado altas, la dilución puede ser necesaria. En este ejemplo, la bebida de deportes desconocidos fue diluido 1:1. La absorbancia fue 0.243 y esto correspondió a una concentración de 2.02 μm. Así la concentración final de colorante azul #1 en los en los deportes de bebida era 4.04 μm.

Figura 1. Curvas de calibración de absorbancia UV-Vis de colorante azul. Izquierda: se midió la absorbancia de diferentes concentraciones de colorante azul #1. Las respuestas de nivel después de 10 μm, cuando la absorbancia es más de 1. Las barras de error son de medidas repetidas de la misma muestra y desviación estándar. Derecho: La parte lineal de la curva de calibración se cabe con una línea y = 0,109 * x + 0.0286. En negro se muestran los datos desconocidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las curvas de calibración se utilizan para comprender la respuesta instrumental a un analito y para predecir la concentración de analito en una muestra.

Una curva de calibración se crea preparando primero un conjunto de soluciones estándar con concentraciones conocidas del analito. La respuesta del instrumento se mide para cada uno y se traza frente a la concentración de la solución estándar. La parte lineal de este gráfico se puede utilizar para predecir la concentración de una muestra del analito, correlacionando su respuesta a la concentración.

En este vídeo se presentarán las curvas de calibración y su uso, demostrando la preparación de un conjunto de patrones, seguido del análisis de una muestra con concentración desconocida.

Se utiliza un conjunto de soluciones estándar para preparar la curva de calibración. Estas soluciones consisten en un rango de concentraciones que abarcan la concentración aproximada del analito.

Las soluciones estándar a menudo se preparan con una dilución en serie. Una dilución en serie se realiza preparando primero una solución madre del analito. A continuación, la solución madre se diluye en una cantidad conocida, a menudo de un orden de magnitud. A continuación, la nueva solución se diluye de la misma manera, y así sucesivamente. Esto da como resultado un conjunto de soluciones con concentraciones que van desde varios órdenes de magnitud.

La curva de calibración es un gráfico de la señal instrumental frente a la concentración. La gráfica de los estándares debe ser lineal y se puede ajustar con la ecuación y=mx+b. Las partes no lineales de la gráfica deben descartarse, ya que estos rangos de concentración están fuera del límite de linealidad.

La ecuación de la línea de mejor ajuste se puede utilizar para determinar la concentración de la muestra, utilizando la señal del instrumento para correlacionarla con la concentración. Las muestras con mediciones que se encuentran fuera del rango lineal de la parcela deben diluirse para estar en el rango lineal.

El límite de detección del instrumento, o la medición más baja que se puede determinar estadísticamente sobre el ruido, también se puede calcular a partir de la curva de calibración. Una muestra en blanco se mide varias veces. El límite de detección se define generalmente como el promedio de la señal en blanco más 3 veces su desviación estándar.

Por último, también se puede calcular el límite de cuantificación. El límite de cuantificación es la cantidad más baja de analito que se puede cuantificar con precisión. Esto se calcula como 10 desviaciones estándar por encima de la señal en blanco.

Ahora que ha aprendido los conceptos básicos de una curva de calibración, veamos cómo preparar y usar una en el laboratorio.

Primero, prepare una solución madre concentrada del patrón. Pese con precisión el patrón y transfiéralo a un matraz aforado. Agregue una pequeña cantidad de solvente y mezcle para que la muestra se disuelva. A continuación, rellene hasta la línea con disolvente. Es importante utilizar el mismo disolvente que la muestra.

Para preparar los patrones, pipetear la cantidad requerida en el matraz aforado. A continuación, llene el matraz hasta la línea con disolvente y mezcle.

Continúe elaborando los estándares pipeteando a partir de la solución madre y diluyendo. Para una buena curva de calibración, se necesitan al menos 5 concentraciones.

Ahora, ejecute muestras con el instrumento analítico, en este caso un espectrofotómetro UV-Vis, para determinar la respuesta instrumental necesaria para la curva de calibración.

Toma la medida del primer estándar. Ejecute los estándares en orden aleatorio, en caso de que haya errores sistemáticos. Mida cada estándar 3 veces para obtener una estimación del ruido.

Mide el resto de los estándares, repitiendo las medidas para cada uno. Registre todos los datos.

Por último, ejecute el ejemplo. Utilice la misma matriz de muestra y las mismas condiciones de medición que se utilizaron para los estándares. Asegúrese de que la muestra esté dentro del rango de los estándares y el límite del instrumento.

Para construir la curva de calibración, utilice un programa informático para trazar los datos como señal frente a concentración. Utilice la desviación estándar de las mediciones repetidas para cada punto de datos para crear barras de error.

Elimine las partes de la curva que no sean lineales y, a continuación, realice una regresión lineal y determine la línea de mejor ajuste. La salida debe ser una ecuación de la forma y = m x + b. Un valor R2 cercano a 1 denota un buen ajuste.

Esta es la curva de calibración para el tinte azul #1, medida a 631 nm. La respuesta es lineal entre 0 y 15 mM.

Calcule la concentración de la muestra utilizando la ecuación de la línea de mejor ajuste. La absorbancia de la muestra fue de 0,141 y correspondió a una concentración de 6,02 mM.

Ahora que ha visto cómo se puede utilizar una curva de calibración con un espectrofotómetro UV-Vis, echemos un vistazo a algunas otras aplicaciones útiles.

Las curvas de calibración se utilizan a menudo con aplicaciones de electroquímica, ya que la señal del electrodo debe calibrarse a la concentración de iones en la solución. En este ejemplo, se recopilaron datos para un electrodo selectivo de iones para fluoruro.

Los datos de concentración deben trazarse en la escala logarítmica para obtener una línea. Esta curva de calibración se puede utilizar para medir la concentración de flúor en una solución, como la pasta de dientes o el agua potable.

La cromatografía líquida de alta resolución, o HPLC, es una técnica de separación y análisis que se utiliza mucho en química analítica. La HPLC separa los componentes de una mezcla en función del tiempo necesario para que las moléculas recorran la longitud de la columna de cromatografía. Este tiempo varía en función de una serie de propiedades químicas de las moléculas.

La elución de las moléculas se mide mediante un detector, lo que da como resultado un cromatograma. El área del pico se puede correlacionar con la concentración utilizando una curva de calibración simple de una gama de soluciones estándar, como en este ejemplo de ingredientes populares de refrescos.

En algunos casos, donde la matriz de la solución interfiere con la medición del soluto, una curva de calibración clásica puede ser inexacta. En esos casos, se prepara una curva de calibración modificada. Para ello, se añade a la muestra una gama de volúmenes de solución estándar. Se crea el gráfico de señal a concentración, donde la intersección x es igual a la concentración original de la solución de muestra. Para obtener más detalles sobre esta técnica, vea el video de educación científica de JoVE, "El método de la adición estándar".

Acabas de ver la introducción de JoVE a la curva de calibración. Ahora debe comprender dónde se usa la curva de calibración, cómo crearla y cómo usarla para calcular las concentraciones de muestras.

Como siempre, ¡gracias por mirar!