2.12: Crecimiento de cristales para el análisis de difracción de rayos x

1. preparación del tubo de cristal y filtro

1. Coloque un tubo NMR en un matraz Erlenmeyer.
2. Preparar un filtro de la pipeta.
   1. Construir el filtro, colocando un pedazo de paño sin pelusa (1 pulgada por 1 pulgada) en la pipeta y luego utilizar una barra para el paño firmemente de la cuña en la porción del cuello de botella de la pipeta (figura 1).
   2. Hacer dos filtros pipeta para cada tubo de cristal necesarios.

2. Añadir la muestra al tubo de cristal

1. Disolver el compuesto (tetraphenylporphyrin, 10 mg) en 0,75 mL de solvente (diclorometano).
2. Con una pipeta, suavemente agregue la mezcla a la parte superior del tubo, al pasar por el filtro.
   1. Las partículas se filtran para evitar la creación de sitios de nucleación, que puede dar lugar a pequeños cristales múltiples en lugar de las deseada monocristales grandes.
3. Una vez que la muestra ha sido colocada en el tubo de cristal, muy lenta y suavemente, agregue el anti-solvente (1.5 mL de metanol) en el tubo a través de una nueva pipeta de filtro. Deje que el solvente el que lentamente la capa sobre la solución previamente agregada (Figura 2). No use una bombilla para empujar el solvente a través de la pipeta, en lugar de otro permitir que el solvente a fluir a través del filtro por sí mismo.
   1. Asegúrese de que solvente de densidad más alta se agrega al tubo de cristal primero.
   2. Compruebe que los dos solventes son miscibles entre sí. Esto se hace antes de la adición del solvente.
4. Sellar el tubo con un tapón de NMR.

3. cristal crecimiento

1. Sin causar los dos solventes a la mezcla, coloque los tubos de cristal en un gabinete donde no será perturbados.
2. Tiempo de cristalización varía con cada compuesto - típicamente el cristal de los tubos deben dejarse imperturbados por una semana.
3. Después de una semana, inspeccionar los tubos de crecimiento cristalino.
   1. Crecimiento de cristales normalmente se produce en la interfase de los dos disolventes.
   2. Inspeccione visualmente los tubos para pruebas de crecimiento de cristales. Tenga cuidado de no facilitar la mezcla de los solventes, en caso de que el compuesto requiere tiempo adicional para la formación de cristales.
   3. Si parece que se ha producido crecimiento cristalino, más Inspeccione los tubos utilizando un microscopio.

4. cristal selección

1. Difracción de rayos x de cristales deben han definido bien caras.
2. Cristales que se han agrupados deben evitarse si es posible.
3. Deja los cristales en el tubo de cristal hasta que esté listo para cosechar el cristal, inmediatamente antes de colocar el cristal en el difractómetro.
   1. Mantener los cristales en el tubo se asegurará de que los cristales quedan solvatados. La solvatación puede causar los cristales de crack y obstaculizar la difracción del cristal.

Figura 1. Una imagen del filtro pipeta. Un pequeño trozo de paño libre de pelusa ha sido encajado firmemente en el embotellamiento de la pipeta. Las soluciones se pasan aunque estos filtros pipeta antes de ser introducido en el tubo de cristal.

Figura 2. Una vez que la solución que contiene compuestos específicos se coloca en el tubo de cristal, anti-solvent es capas lentamente en la parte superior pasando por un nuevo filtro de pipeta.

Se requiere un solo cristal para la determinación de su estructura. La calidad del cristal influye en gran medida en la calidad y precisión de la determinación estructural.

Un solo cristal es un sólido en el que la disposición de las moléculas se repite en las tres dimensiones. La disposición espacial de los átomos dentro del sólido cristalino se puede determinar mediante cristalografía de rayos X. En esta técnica, una muestra cristalina pura es envuelta por un haz de rayos X. El cristal difracta los rayos X en un patrón distintivo relacionado con la estructura y la composición molecular de los cristales. Si un cristal se forma demasiado rápido, las moléculas pueden estar desordenadas, las impurezas pueden incorporarse al cristal o se pueden formar dos o más cristales fusionados en lugar de un solo cristal. Por lo tanto, se necesitan métodos especializados con énfasis en el crecimiento lento para producir cristales de calidad suficiente para la cristalografía de rayos X.

Este video ilustrará las características deseadas de los cristales con calidad de rayos X, demostrará un procedimiento para cultivarlos e introducirá algunas aplicaciones de esta técnica en química.

Los electrones dispersan los rayos X emitiendo una onda esférica de rayos X cuando son golpeados. Si los átomos están en una disposición ordenada, la interferencia constructiva entre las ondas produce un patrón de difracción característico en un detector de rayos X. El cristal se gira dentro del haz para recoger patrones de difracción desde múltiples ángulos. Con suficientes patrones de difracción, se puede derivar la estructura molecular.

Los cristales con calidad de rayos X generalmente forman formas simétricas y tienen caras lisas que reflejan la luz. Cuando se observan bajo un microscopio polarizador, serán transparentes, pero la mayoría se oscurecerá cuando se giren 90 grados. Esto indica una estructura muy ordenada. Para hacer crecer estos cristales, a menudo se utiliza la difusión líquido-líquido. Para ello se emplean dos disolventes miscibles: un disolvente de baja densidad, o precipitante, en el que el compuesto a recristalizar es insoluble; y un disolvente de alta densidad en el que el compuesto es soluble. Normalmente, la relación volumétrica entre el precipitante y el disolvente es de 2:1.

El precipitante de baja densidad se coloca en capas sobre una solución concentrada del compuesto en el solvente de alta densidad. Con el tiempo, el compuesto se vuelve menos soluble a medida que el precipitante se mezcla con la solución. Una interfaz de disolvente más pequeña da como resultado una tasa de difusión más lenta, lo que produce cristales más grandes y puros. Ahora que comprende los principios del cultivo de cristales de calidad de rayos X, repasemos un procedimiento para cultivarlos por difusión líquido-líquido.

Para comenzar, obtenga el equipo necesario que se encuentra en el protocolo de texto. Adquiera un solvente para el compuesto y un precipitante menos denso.

Para preparar un filtro de pipeta, coloque un pequeño trozo de Kimwipe en la parte superior de una pipeta de vidrio y presione suavemente el papel hasta la parte inferior del cuerpo de la pipeta con una varilla o el tallo de otra pipeta, teniendo cuidado de no perforar el papel. Prepare dos filtros de pipeta. Coloque uno en el tubo de RMN. Si es necesario, asegure el conjunto con una abrazadera de laboratorio y un soporte de anillo. Disolver unos 10 mg del compuesto a recristalizar en 0,75 mL de disolvente.

Ahora, agregue con cuidado la solución de muestra en el filtro de pipeta. Coloque una pera en la parte superior y apriétela lentamente para pasar la solución al tubo de RMN para eliminar las impurezas sólidas. No permita que la bombilla se vuelva a expandir mientras está conectada, ya que la succión desalojará el papel de filtro.

A continuación, retire el filtro de pipeta usado y coloque el segundo filtro en el tubo de RMN. Pipetee aproximadamente 1,5 mL de precipitante en el tubo. Deje que el solvente pase a través del filtro por gravedad. A partir de ahora, tenga cuidado de no alterar el filtro durante cualquier manipulación. Una vez que todo el precipitante se haya filtrado en el tubo, retire el filtro y tape el tubo. Colóquelo en un gabinete u otro lugar fácil de revisar donde no se agite.

Después de al menos un día, inspeccione los tubos para ver si hay crecimiento de cristales. Si no hay cristales o los cristales son muy pequeños, deje el tubo de muestra intacto. Si los cristales son visibles, compruebe su tamaño y forma sin alterar las capas de disolvente.

Si los cristales son grandes, bien definidos y no están agrupados, inspeccione los cristales bajo un microscopio para verificar su potencial de calidad de rayos X. No retire los cristales del tubo hasta que el difractómetro esté listo para comenzar la exploración. Si se incorporan moléculas de solvente a la estructura cristalina, permitir que el cristal se seque degradará el cristal. Utilizando cristalografía de rayos X, se verificó que la estructura molecular de estos cristales de color púrpura rojizo oscuro era tetrafenilporfirina.

La cristalografía de rayos X es una herramienta analítica esencial en química y bioquímica.

Los métodos de recristalización incluyen calentamiento y enfriamiento, difusión líquido-líquido, difusión de vapor y evaporación lenta. En la evaporación lenta de un solo sistema de solvente, el compuesto se disuelve en una pequeña cantidad de solvente y se coloca en un recipiente con un pequeño orificio en la tapa. A medida que el solvente se evapora, la concentración aumenta hasta que el compuesto comienza a cristalizarse.

La funcionalidad de las proteínas suele estar relacionada con su estructura. Sin embargo, las proteínas pueden ser muy difíciles de cristalizar. Se deben desarrollar técnicas especializadas para cultivar cristales de proteínas con calidad de rayos X. Aquí, una gota de solución de proteína se mezcla con una gota de precipitante y esta mezcla se sella en una cámara con precipitante puro. A medida que el vapor del solvente se difunde fuera de la gota, la solubilidad de la proteína en la gota disminuye y la proteína se cristaliza lentamente. Otra técnica mezcla la solución proteica y el precipitante con aceite mineral. Con estas técnicas, se puede cristalizar una variedad de proteínas para su análisis.

En la difracción de polvo, cada posible orientación espacial se representa en la muestra simultáneamente. La difracción de polvo no es tan informativa sobre la estructura como la difracción de rayos X de un solo cristal debido a la pérdida de datos de estructura tridimensional. En cambio, la difracción de polvo sobresale en el análisis de mezclas de sólidos cristalinos y en la evaluación de la cristalinidad de estructuras amorfas.

Acabas de ver la introducción de JoVE al cultivo de cristales para la cristalografía de rayos X. Ahora debería estar familiarizado con las propiedades de los cristales de calidad de rayos X, un procedimiento para cultivarlos y algunas aplicaciones de esta técnica en química.

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