2.6: Extracción de ADN de la comunidad de colonias bacterianas

1. bacteriana comunitaria la extracción de ADN

1. Para comenzar el procedimiento, pesar 100 g de suelo tamizado. Agregue esto a un recipiente de polipropileno y añadir 100 mL de tampón de extracción compuesta por Tris buffer modificado con EDTA para promover la liberación de bacterias de la matriz del suelo, luego agitar a mano.
2. A continuación, pesar 100 g de perlas de vidrio y agregar al recipiente de mezcla. Agitar la muestra durante 5 min mediante una tira a dispositivo o agitador de muñeca-acción mecánica para 15 minutos agregar 10 mL 20% sodio dodecil sulfato, o SDS, a la mezcla, luego agitar durante un minuto adicional. Incubar a una temperatura elevada de 60-65 ° C durante 60 minutos.
3. Igualmente distribuir la muestra entre los diferentes tubos de 50 mL y centrifugar 10 min a 6.000 x g. transferir el sobrenadante de los tubos a un único contenedor estéril. A continuación, repetir la extracción en el sedimento del suelo como se describió anteriormente, utilizando un nuevo volumen de tampón de extracción.
4. A continuación, añadir el volumen de sobrenadante transformado, aproximadamente 200 mL a un tubo de 50 mL limpio llenado a mitad de volumen con una solución 30% glicol de polietileno y 1,6 M de cloruro de sodio. Invertir las botellas varias veces con la mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. muestras de centrifugar a 10.000 x g por 20 min a la pelotilla de la DNA.
5. Retire el sobrenadante con cuidado el tubo de centrífuga, dejando atrás el pellet de ácidos nucleicos parcialmente purificada. Añadir 20 mL de Buffer TE y 1,5 mL de una solución de acetato de potasio de 7.5 M para Resuspender el precipitado, entonces el vórtice. Coloque la suspensión en hielo por 5 min centrifugar a 16.000 x g durante 30 min a 4 ° C para precipitar las proteínas y los polisacáridos.
6. A continuación, agregue una RNasa y proteinasa K a la muestra, mezclar suavemente con la mano y dejar reposar para el momento. Añadir un volumen equivalente de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico (mezcla de proporción de 25:24:1) a la suspensión para extraer y mezclar suavemente con la mano. Centrifugar la preparación durante 10 minutos a 13.000 x g. Retire con cuidado el recipiente de la centrífuga y nota las dos capas.
7. La parte inferior, la capa más pesada se compone de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico y extrae desechos, y la capa superior es la acuosa y contiene el ADN. Colocar la fase acuosa en un recipiente estéril, agregar un volumen equivalente de isopropanol e invierta suavemente para iniciar la precipitación de ADN. Incubar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h. pelotilla de la DNA purificada por centrifugación a 16.000 x g por 30 minutos Retire con cuidado el sobrenadante como ADN concentrado puede o puede no ser visible en la parte inferior de la nave y luego resuspender en 1 mL de tampón TE.
8. Utilizando un espectrofotómetro o un Fluorímetro de cuantificación de ADN/ARN, medir el nivel de la DNA extraída de la muestra. Se estima la cantidad de ADN de la lectura de nm 260. Una lectura de absorbancia de 1.0 equivale a 50 μg de DNA por mL de solución. Si la concentración es demasiado alta para lecturas precisas, diluir la suspensión de 1 a 10, o 1 a 100 con agua de grado molecular.
9. La pureza del ADN se calcula la relación de la lectura a 260 nm que a 280 nm. Un valor > 1,7 indica que relativamente puro ADN. El valor teórico máximo es 2.0.

La extracción de ADN de la comunidad bacteriana es un proceso mediante el cual se obtiene ADN de múltiples especies bacterianas dentro de una comunidad durante un solo procedimiento de extracción.

Los análisis tradicionales de las comunidades microbianas en el suelo generalmente han involucrado ensayos culturales, utilizando la metodología de dilución y siembra en diferentes medios selectivos. Sin embargo, muchas bacterias crecen mal en condiciones de laboratorio o en las condiciones específicas del medio de crecimiento seleccionadas, lo que significa que pueden pasarse por alto o estar muy infrarrepresentadas.

Recientemente, la extracción de ADN comunitario de muestras bacterianas del suelo ha permitido un muestreo más completo de las comunidades bacterianas. Se cree que este enfoque no basado en la cultura es más representativo de las comunidades reales presentes que los métodos tradicionales basados en la cultura.

Este video demostrará un método sin cultivo de extracción de ADN de la comunidad bacteriana, cómo verificar la calidad y cantidad de ADN extraído y explorará cómo se puede utilizar este ADN para estudiar la diversidad bacteriana.

La extracción de ADN del suelo se puede llevar a cabo de dos maneras. En el método de fraccionamiento, las células se separan primero de la matriz del suelo antes de la extracción del material genético. A continuación, la muestra se somete a ciclos sucesivos de mezcla y centrifugación lenta para recoger las células intactas en un pellet.

A continuación, se añaden lisozimas a las células y se incuba la suspensión. Las lisozimas son enzimas que rompen las paredes celulares bacterianas. Una vez que la estructura de la pared celular se ha visto comprometida, el ADN puede ser liberado para su purificación. Sin embargo, se ha demostrado que un segundo método de extracción de ADN comunitario, el método in situ, produce una mayor concentración de ADN.

Aquí, una masa de suelo se combina con un volumen equivalente de tampón de extracción Tris-EDTA y perlas de vidrio, y se mezcla agresivamente para facilitar la separación de las células de las partículas del suelo. A continuación, se añade un detergente, generalmente dodecil sulfato de sodio, o SDS, y la muestra se mezcla aún más para promover la lisis de las células y la liberación de su contenido, incluido el ADN.

A continuación, se lleva a cabo una incubación a alta temperatura para lisar las células bacterianas restantes. Las muestras se centrifugan y se realiza una extracción e incubación de polietilenglicol en el sobrenadante para precipitar el ADN, que luego se centrifuga en un pellet.

El ADN se resuspende en tampón TE y acetato de potasio con el fin de lavar aún más el ADN de proteínas y polisacáridos, luego se lleva a cabo la centrifugación para pellet estos componentes indeseables. El sobrenadante acuoso que contiene el ADN se elimina y se somete a una extracción de fenol-cloroformo y precipitación de isopropanol para limpiar y concentrar aún más el ADN. Después de un período de incubación a temperatura ambiente de dos horas, el ADN se centrifuga y se resuspende en TE Buffer para su almacenamiento hasta el análisis.

Ahora que estamos familiarizados con los conceptos y procesos detrás de la extracción de ADN de la comunidad bacteriana, echemos un vistazo a cómo se lleva a cabo en el laboratorio.

Para comenzar el procedimiento, pese 100 g de tierra tamizada. Agregue esto a un recipiente de polipropileno y agregue 100 mL de tampón de extracción compuesto por tampón Tris modificado con EDTA para promover la liberación de bacterias de la matriz del suelo, luego agite con la mano.

A continuación, pese 100 g de perlas de vidrio y agréguelas al recipiente de mezcla. Agite la muestra durante 5 minutos utilizando un dispositivo de batido de cuentas o un agitador mecánico de muñeca. Agregue 10 ml de dodecil sulfato de sodio al 20%, o SDS, a la mezcla, luego agite durante un minuto más. Incubar a alta temperatura durante 60 min.

Distribuya uniformemente la muestra entre tubos separados de 50 mL y centrifugue durante 10 min... a 6.000 x g. Transfiera el sobrenadante de los tubos a un solo recipiente estéril. A continuación, repita la extracción en el pellet de suelo como se ha descrito anteriormente, utilizando un volumen fresco de tampón de extracción.

A continuación, agregue el volumen total de sobrenadante procesado a un tubo limpio de 50 ml lleno hasta la mitad del volumen con una solución de polietilenglicol al 30% y cloruro de sodio 1,6 M. Invierta los biberones varias veces a mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Centrifugar muestras a 10.000 x g durante 20 min... para granular el ADN.

Retire el sobrenadante con cuidado del tubo de centrífuga, dejando atrás la pastilla de ácido nucleico parcialmente purificada. Agregue 20 mL de tampón TE y 1,5 mL de una solución de acetato de potasio de 7,5 M para resuspender el pellet, luego vórtice. Coloque la suspensión sobre hielo durante 5 min. Centrífuga a 16.000 x g durante 30 min a 4 ? C para precipitar proteínas y polisacáridos.

A continuación, agregue una ARNasa y una proteinasa K a la muestra, mezcle suavemente con la mano y deje reposar por un momento. Añadir un volumen equivalente de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a la suspensión a extraer, y mezclar suavemente a mano. Centrifugar la preparación durante 10 min a 13.000 x g. Retire con cuidado el recipiente de la centrífuga y observe las dos capas.

La capa inferior, más pesada, está compuesta por el fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y los residuos extraídos, y la capa superior es la acuosa y contiene el ADN. Coloque la fase acuosa en un recipiente estéril, agregue un volumen equivalente de isopropanol e invierta suavemente para iniciar la precipitación del ADN. Incubar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h. Granular el ADN purificado por centrifugación a 16.000 x g durante 30 min. Retire con cuidado el sobrenadante, ya que el ADN granulado puede o no ser visible en el fondo del recipiente, y luego vuelva a suspender en 1 ml de tampón TE.

Usando un espectrofotómetro o un fluorímetro de cuantificación de ADN/ARN, mida el nivel de ADN extraído de la muestra. Los fluorímetros de ADN/ARN emitirán niveles de ADN en unidades de nanogramos por mililitro. Si la concentración es demasiado alta para lecturas precisas, diluya la suspensión de 1 a 10, o de 1 a 100 con agua de grado molecular.

Una vez que se obtiene el ADN de una comunidad bacteriana, este se puede utilizar de varias maneras diferentes. Aquí se exploran algunas de esas aplicaciones.

Los análisis espectrofotográficos del ADN extraído del ADN de la comunidad pueden proporcionar una visión del número de células bacterianas presentes en una muestra de suelo determinada. La cantidad estimada de ADN en ng por mL de solución se puede relacionar con el volumen total de ADN extraído en solución, para dar la cantidad total de ADN por g de suelo. Conociendo el valor teórico del ADN por célula, se puede calcular el número total de células por g de suelo.

Para aplicaciones más específicas, el ADN extraído de las comunidades bacterianas puede someterse a PCR para determinar si una especie en particular está presente dentro de la comunidad. Por ejemplo, los científicos pueden querer identificar si las muestras de suelo contienen patógenos específicos, como Clostridium perfringens o Bacillus anthracis.

Finalmente, para obtener una comprensión más completa de las bacterias presentes en una comunidad, las muestras de ADN se pueden someter a una caracterización "ómica" y bioinformática que permite un análisis más profundo de las bacterias originales dentro de la muestra. ? ¿Ómicas? Describe una gama de tecnologías que exploran las funciones, relaciones y acciones de las moléculas en organismos o comunidades. Esto incluye los estudios de los genes y su función, o ? ¿Genómica?, y ? ¿Proteómica?, el estudio de las proteínas y sus funciones. Por ejemplo, ¿la secuenciación de 16S? El ARN de las muestras puede permitir una determinación metagenómica de especies específicas dentro de la comunidad, lo que proporciona una estimación más detallada de la diversidad. Este enfoque puede dar a los científicos una mejor comprensión de la composición de las especies de una comunidad y de las funciones que pueden estar desempeñando.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la extracción de ADN de la comunidad bacteriana. Ahora debe comprender cómo extraer ADN de una comunidad bacteriana, cómo verificar la calidad de este ADN y cómo se puede usar este ADN para investigaciones de la composición de la comunidad bacteriana. ¡Gracias por mirar!