Extracción de ADN de la comunidad de colonias bacterianas

1. bacteriana comunitaria la extracción de ADN

1. Para comenzar el procedimiento, pesar 100 g de suelo tamizado. Agregue esto a un recipiente de polipropileno y añadir 100 mL de tampón de extracción compuesta por Tris buffer modificado con EDTA para promover la liberación de bacterias de la matriz del suelo, luego agitar a mano.
2. A continuación, pesar 100 g de perlas de vidrio y agregar al recipiente de mezcla. Agitar la muestra durante 5 min mediante una tira a dispositivo o agitador de muñeca-acción mecánica para 15 minutos agregar 10 mL 20% sodio dodecil sulfato, o SDS, a la mezcla, luego agitar durante un minuto adicional. Incubar a una temperatura elevada de 60-65 ° C durante 60 minutos.
3. Igualmente distribuir la muestra entre los diferentes tubos de 50 mL y centrifugar 10 min a 6.000 x g. transferir el sobrenadante de los tubos a un único contenedor estéril. A continuación, repetir la extracción en el sedimento del suelo como se describió anteriormente, utilizando un nuevo volumen de tampón de extracción.
4. A continuación, añadir el volumen de sobrenadante transformado, aproximadamente 200 mL a un tubo de 50 mL limpio llenado a mitad de volumen con una solución 30% glicol de polietileno y 1,6 M de cloruro de sodio. Invertir las botellas varias veces con la mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. muestras de centrifugar a 10.000 x g por 20 min a la pelotilla de la DNA.
5. Retire el sobrenadante con cuidado el tubo de centrífuga, dejando atrás el pellet de ácidos nucleicos parcialmente purificada. Añadir 20 mL de Buffer TE y 1,5 mL de una solución de acetato de potasio de 7.5 M para Resuspender el precipitado, entonces el vórtice. Coloque la suspensión en hielo por 5 min centrifugar a 16.000 x g durante 30 min a 4 ° C para precipitar las proteínas y los polisacáridos.
6. A continuación, agregue una RNasa y proteinasa K a la muestra, mezclar suavemente con la mano y dejar reposar para el momento. Añadir un volumen equivalente de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico (mezcla de proporción de 25:24:1) a la suspensión para extraer y mezclar suavemente con la mano. Centrifugar la preparación durante 10 minutos a 13.000 x g. Retire con cuidado el recipiente de la centrífuga y nota las dos capas.
7. La parte inferior, la capa más pesada se compone de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico y extrae desechos, y la capa superior es la acuosa y contiene el ADN. Colocar la fase acuosa en un recipiente estéril, agregar un volumen equivalente de isopropanol e invierta suavemente para iniciar la precipitación de ADN. Incubar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h. pelotilla de la DNA purificada por centrifugación a 16.000 x g por 30 minutos Retire con cuidado el sobrenadante como ADN concentrado puede o puede no ser visible en la parte inferior de la nave y luego resuspender en 1 mL de tampón TE.
8. Utilizando un espectrofotómetro o un Fluorímetro de cuantificación de ADN/ARN, medir el nivel de la DNA extraída de la muestra. Se estima la cantidad de ADN de la lectura de nm 260. Una lectura de absorbancia de 1.0 equivale a 50 μg de DNA por mL de solución. Si la concentración es demasiado alta para lecturas precisas, diluir la suspensión de 1 a 10, o 1 a 100 con agua de grado molecular.
9. La pureza del ADN se calcula la relación de la lectura a 260 nm que a 280 nm. Un valor > 1,7 indica que relativamente puro ADN. El valor teórico máximo es 2.0.