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Analytical Chemistry

Estándares internos

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Internal Standards

3.1: Sample Preparation for Analytical Characterization

3.7: X-ray Fluorescence (XRF)

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09:18 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton – Universidad de Virginia

El objetivo de muchos análisis químicos es un análisis cuantitativo, donde se determina la cantidad de una sustancia en una muestra. Para calcular con precisión la concentración de un desconocido de una muestra, preparación de muestras cuidadosa es la clave. Cada vez que una muestra es manejada o transferida, de la muestra puede ser perdido. Sin embargo, existen estrategias para minimizar la pérdida de muestra. También existen estrategias para sobrellevar la pérdida de muestra y todavía hacer mediciones precisas de la concentración.

Para minimizar la pérdida de muestra, lo ideal es minimizar el número de medidas de manejo y transferencia de muestra. Por ejemplo, reuniendo una muestra sólida directamente en un matraz que se determinara una solución reduce un paso de la transferencia. Si es necesario trasladar de un matraz a otro y se hace una dilución, luego triple enjuague la cristalería ayuda a garantizar que la muestra se transfiere. Otras estrategias son más específicos de la muestra. Por ejemplo, las muestras que se adsorben al vidrio, como las proteínas, podrían manejarse mejor en tubos desechables de polipropileno. Los tubos no son hidrofílicos, por lo que si una pequeña cantidad de muestra debe pipetearse en agua, es mejor ya haber agregado el agua al tubo, por lo que la muestra puede pipetearse directamente en el solvente. Sería mejor concentrarse en lugar de secar completamente una muestra, debido a las pérdidas de insolubilities después de la rehidratación.

Otra fuente de pérdida de muestra es a través de manipulaciones de la muestra incompleto. Por ejemplo, si se utiliza un procedimiento de derivatización y la derivatización es incompleta, entonces el monto total de la muestra no se observa. Errores como este son errores sistemáticos y pueden ser resuelto por corregir el problema, como cambiar el procedimiento de derivatización. Otra causa de error sistemático en las mediciones es efectos de matriz. Estos pueden interferir con la medición de determinadas sustancias y realizar calibraciones en la misma matriz como la muestra puede reducir este efecto.

Análisis cuantitativo se realiza típicamente usando estándares internos o externos. Para los estándares externos, se realiza una curva de calibración midiendo diferentes concentraciones conocidas del analito de interés. Luego, la muestra se ejecuta por separado de la norma. Normas internas, el estándar está en la misma muestra como el analito de interés, lo que permite la medida a adoptarse simultáneamente. Por lo general, se agrega una especie diferente llamada estándar interno y la relación de la respuesta para esa norma interna y el analito se calcula. La idea es que la relación de la respuesta, llamada el factor de respuesta, es proporcional a su concentración. Mientras que el método debe ser capaz de distinguir entre el analito de interés y del estándar interno, las pérdidas de muestra que se producen después de que se agregó el estándar interno deben ser similares para ambas sustancias y por lo tanto el cociente de la respuesta permanece igual. Un caso especial del uso de estándares internos es el método de adiciones estándar, donde cantidades crecientes de la sustancia a analisar se agrega a la solución y la cantidad original de analito es calculado por la espalda. Estándares internos pueden utilizarse en electroquímica y cromatografía y espectroscopia.

Principles

Un patrón interno es una sustancia en una cantidad constante a una muestra, en blanco y estándar en el análisis. Estándar interno puede compensar errores sistemáticos y aleatorios. Por ejemplo, si hay fluctuaciones de instrumento que causan errores aleatorios en la medición, estas fluctuaciones deben ser las mismas para el estándar interno y el analito y así no cambia la relación de las señales. De errores sistemáticos, tales como efectos de matriz del disolvente, siempre y cuando el efecto es igual para el estándar y el analito, la proporción es otra vez.

La desventaja de estándares internos es que es difícil encontrar un estándar interno apropiado. El estándar interno debe tener una señal de que es similar al analito, pero lo suficientemente diferentes como para que se puede distinguir por el instrumento. También, el estándar interno no debe estar presente en la matriz de la muestra, para que la norma adicional es la única fuente de la norma. Ocasionalmente, un componente importante de una muestra de que es constante en la concentración puede ser utilizado como el estándar interno en vez de una norma adicional, pero la concentración debe ser conocida para ese componente. El estándar interno también no debe suprimir o mejorar la señal del analito.

En cromatografía, una de las mayores fuentes de error es a menudo la inyección. Si se utilizan inyecciones de manual, puede haber errores en la carga de la jeringa correctamente. Volúmenes son normalmente pequeños (~ 1 μl) por lo que hay incertidumbres en reproducible inyectar un volumen este pequeño, a menudo un par de porcentaje desviación estándar relativa (RSD). En cromatografía de gases (GC), la muestra se inyecta en un puerto caliente y evaporación desde la punta de la aguja puede provocar variaciones en el volumen inyectado. Samplers de auto ayudan con el error en la carga de la jeringa y el error de inyectar rápidamente para evitar la evaporación en GC, pero el error puede ser de 1 – 2% RSD. Con cromatografía, área pico se utiliza generalmente en lugar de altura, como los picos más ancho y más corto con el tiempo pero el área de pico es constante. Por lo tanto, normas internas, relaciones de zonas de pico se utilizan en cromatografía en lugar de alturas del pico.

Para una calibración con estándar interno, se calcula un factor de respuesta. El factor de respuesta (R) es la relación de los picos en comparación con la relación de las concentraciones donde X es el analito y es el estándar interno.

Para la cromatografía se utiliza área (A). El factor de respuesta se puede calcular de una parcela de calibración de un /A_Xvs_es C_X/C_es, donde el factor de respuesta es la pendiente y el intercepto de y se asume que es 0. Una vez conocido el factor de respuesta para los estándares, la respuesta del desconocido puede calcularse la relación de área medido en el experimento.

Procedure

1. manejo de muestras correcta: Lo que una solución

Toma un vaso limpio y masa la cantidad correcta de la muestra en él. Registro real utilizado masa. En este ejemplo, se hace una solución de la adenina en un matraz aforado para uso como estándar interno para el análisis siguiente. La masa de la adenina es 100 mg. Hacer masa no directamente en un matraz aforado ya que tiene un cuello largo y la adenina no puede añadir o quitar fácilmente.
Añadir aproximadamente 25 mL de solvente (en este caso dimetilsulfóxido (DMSO)) en el vaso y dejar mezclar para disolver. En este ejemplo, la solución final se hace en un matraz aforado de 50 mL, así que sólo añadir unos 25 mL por lo que se puede enjuagar el vaso y la solución para el volumen final.
Una vez que el sólido se disuelva, verter la solución en el matraz aforado.
Enjuague el vaso y la barra de agitación con pequeñas cantidades de solvente, aproximadamente 10 mL y verter el enjuague al matraz volumétrico. Repetir dos veces más. Esto ayuda a asegurar a la transferencia de la solución adecuada.

2. preparación de una curva de calibración estándar interno

Preparar las muestras estándar deseadas para el análisis de cromatografía de gases. En este ejemplo, la cafeína se extrae del café usando acetonitrilo y entonces adenina se utiliza como estándar interno para la medición.
Para las muestras de cafeína, pesar la cantidad de muestra necesaria para hacer 1 mg/mL de muestra. Si se utiliza un matraz aforado de 10 mL, es de 10 mg.
Pesar el analito en un vaso de precipitados, agregar unos mL de disolvente (metanol aquí) para disolver y luego trasvasar al matraz volumétrico utilizando 3 enjuagues.
Hacer 3 más estándares en una manera similar con 0.2, 0.5 y 2 mg/mL cafeína.
Poner 1 mL de cada cafeína estándar en un frasco de la muestra.
Añadir 0,2 mL de estándar interno de la adenina de 2 mg/mL en cada frasco de la muestra.
Ejecutar el experimento de cromatografía de gases con cada estándar de cafeína. De cada cromatograma, calcular la relación de zonas de pico para el cafeína vs el estándar.
Hacer un diagrama de la relación de área vs la tasa de concentración. La pendiente de esa trama es el factor de respuesta.

3. preparación de una muestra Real con estándar interno para cromatografía de gases

Preparar la muestra deseada para el análisis de cromatografía de gases. En este ejemplo, se extrae la cafeína de café con acetrontrile.
Para la muestra de café, masa 2 g de café en un vaso de precipitados de 100 mL. Registrar el peso exacto del café.
Añadir 20 mL de acetonitrilo en el vaso.
Déjelo reposar 20 minutos, revolviendo frecuentemente.
El café molido hacia fuera usando un papel de filtro en un embudo de filtro.
Enjuague el filtro de papel de 3 x con pequeñas cantidades de acetonitrilo (5 mL).
Medir el volumen final del filtrado. Debe ser alrededor de 35 mL.

4. ejecutar la muestra y calcular la concentración

Tomar 1 mL de la muestra de extracto de café y agregar 0.2 mL del estándar interno en un frasco. Coloque el frasco en el estante del muestreador automático.
Realizar un análisis de GC de la muestra. Asegúrese de que las condiciones de la GC son tales que la cafeína y la adenina por separado. En este ejemplo, isotermos separaciones se realizan a 200 º C.
Después del análisis, calcular el área de pico para el pico de estándar interno y el pico del analito. Sus proporciones, calcular la cantidad de cafeína en la muestra.

5. resultados: Análisis de GC de cafeína con estándar interno

Análisis de GC de la cafeína se muestran en la figura 1. Adenina se utiliza como estándar interno. La relación de zonas de pico puede ser medida y trazado vs la relación de las concentraciones. La pendiente de la parcela es el factor de respuesta (en este caso 1.8).
La figura 2 muestra un cromatograma de una muestra de café con estándar interno de adenina. La relación entre el área de pico es 1,78. Utilizando el factor de respuesta y la concentración conocida de la adenina (0,33 mg/mL), se calcula la concentración de cafeína en la muestra desconocida a 0,33 mg/ml.

Figura 1. Parcela de calibración utilizando un patrón interno. Una parcela de los cocientes de concentración de área ratios vs 3 muestras estándar de cafeína (1, 0,5 y 0,2 mg/mL) con estándar interno de adenina de 0,33 mg/mL añadido a cada uno. La pendiente de la recta es 1.8, que es el factor de respuesta.

Figura 2. Cromatograma de café con estándar interno adenina. Una parcela de la respuesta del detector FID a las muestras. Los tres picos principales son adenina (IS), cafeína y ácido palmítico.

Pérdida de la muestra puede ocurrir cada vez que una muestra es manejada o transferida, lo que precisa cálculos de concentración difícil.

Para asegurar la precisión, los efectos de pérdida de muestra deben reducirse al mínimo mediante la preparación cuidadosa y limitando el número de medidas de manejo y transferencia de muestra. Sin embargo, la pérdida de muestra puede también ocurrir debido a errores sistemáticos, tales como manipulación de la muestra incompleto, efectos de matriz y variaciones en el procedimiento analítico.

Estas fuentes de pérdida pueden explicarse mediante la adición de una concentración conocida de una especie similar pero no idéntico, del compuesto de interés. Esto se llama un patrón interno. Pérdidas de muestra que se producen para el estándar interno deben ser similares para el analito, lo que permite la concentración a calcularse con precisión.

Este video ilustra el uso de una técnica de laboratorio interno estándar y apropiada para tener en cuenta para la pérdida de muestra para determinar la concentración de un desconocido.

Un patrón interno es una sustancia en una cantidad conocida a estándares, muestras y espacios en blanco durante un análisis.

En cromatografía y espectroscopia, se calcula el cociente de la señal para el estándar interno y el analito. Esta relación, llamada el factor de respuesta, es proporcional a la relación entre el analito y concentraciones estándar.

Factor de respuesta, R, puede expresarse por la siguiente ecuación, donde una representa las señales analíticas de la muestra y el estándar interno y C representa las concentraciones de la muestra y el estándar interno.

Estándar interno puede compensar errores sistemáticos y aleatorios. Por ejemplo, los errores aleatorios, tales como inconsistencias al medir una muestra de—será el mismo para el estándar interno y el analito. Por lo tanto, no cambiará la relación de sus señales.

De errores sistemáticos, tales como efectos de matriz en la solución, la relación será afectada como el efecto de la matriz es igual para el estándar y el analito.

Mientras que los estándares internos proporcionan grandes beneficios, puede ser difícil elegir uno que sea adecuado. Estándar interno debe tener una señal de que es similar pero no idéntico, al analito. También no afecta la medición del analito en forma alguna.

Por último, la concentración debe ser conocida. Esto se logra al asegurar que el estándar interno no es nativa presente en la muestra; así, la única fuente de la misma en la solución es la concentración conocida añadida.

En el siguiente experimento, se determinará la concentración de cafeína en una muestra desconocida por cromatografía de gases.

Esto se logra mediante la creación de una curva de calibración con soluciones conocidas de la cafeína, de adenina como estándar interno. La pendiente de la curva de calibración es igual al factor de respuesta.

Una vez conocido el factor de respuesta, se puede calcular la concentración de lo desconocido de su proporción del área del cromatograma medido.

Ahora que usted entiende los fundamentos de normas internas, echemos un vistazo en el procedimiento.

Para comenzar el procedimiento, pesar exactamente 100 mg de la adenina estándar, interno, en un vaso limpio.

A continuación, disolver en aproximadamente 20 mL de dimetilsulfóxido y mezclar la solución.

Una vez que la adenina se disuelva, verter la solución en un matraz aforado de 50 mL.

Enjuague el vaso y stir bar con 10 mL de DMSO y verter el enjuague al matraz. Repita este enjuague dos veces, para asegurar a la transferencia de la solución adecuada. Llene hasta la marca de calibración, dando por resultado un estándar interno con una concentración de 2 mg/mL.

A continuación, pesar 100 mg de cafeína en un vaso para preparar una solución madre. Disolver la cafeína con una pequeña cantidad de metanol. A continuación, utilice 3 enjuagues transferir esta solución a un matraz aforado de 25 mL fresco. Esta es la solución 4 mg/mL. Se usa para crear 3 niveles de cafeína.

A continuación, agregar 0,2 mL de la adenina estándar, interno, a cada matraz. Llene cada uno al final volumen con metanol. Transferencia de cada solución a un frasco de la muestra.

Ejecute cada estándar de cafeína a través de un cromatógrafo de gases. Calcular la relación de zonas de pico para la cafeína versus la adenina estándar.

En primer lugar, pesar 2 g de café en un vaso de precipitados de 100 mL y registrar el peso.

A continuación añadir 20 mL de metanol para extraer la cafeína del café. Deje que la solución a agitar durante 20 minutos.

Usando un embudo Büchner, filtrar el café. Enjuague el vaso con una pequeña cantidad de metanol y vierta este enjuague en el embudo. Repetir el enjuague dos veces.

Medir el volumen final del filtrado; debe ser aproximadamente de 35 mL.

Para preparar la muestra para análisis, añadir 1 mL del extracto de café a un frasco de la muestra. Luego, agregar 0,2 mL de estándar interno de adenina y coloque el frasco en el estante del muestreador automático del instrumento.

Realizar un análisis de cromatografía de gases de la muestra, garantizar que las condiciones son tales que la cafeína y la adenina son separados.

Después de completar el análisis, calcular el área de pico del estándar interno y el analito.

Una vez que todas las muestras han sido analizadas, puede determinarse la curva de calibración estándar para las soluciones de cafeína/adenina trazando las proporciones de las áreas de pico frente a los cocientes de las concentraciones. La pendiente de esta recta, que representa el factor de respuesta, fue de 1.8.

A continuación, se analizan los datos de la GC de la muestra de café extraído. Se calculó el cociente de las áreas de pico en 1.78. Utilizando el factor de respuesta y la concentración conocida de la adenina estándar, interno, la concentración de cafeína en la muestra desconocida se calculó en 0,33 mg/mL.

Diferentes tipos de reacciones, a través de varios discípulos científicos, utilizan estándares internos para minimizar los efectos de errores y pérdida de la muestra.

Los efectos de pérdida de muestra durante la preparación de la muestra pueden ser minimizados utilizando estándares internos, manteniendo su proporción de concentración casi constante.

En este ejemplo, lípidos bioactivos fueron extraídos de las células sometidas a lisis mediante un proceso de extracción líquido-líquido. Estándares internos de isótopos estables fueron agregados al principio de la extracción para tener en cuenta errores durante la preparación de la muestra.

Normas internas no sólo fueron fundamentales para la preparación de los lípidos bioactivos, sino también para el análisis. Los lípidos fueron separados utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento y analizado mediante espectrometría de masas.

En espectroscopia, estándares internos pueden ayudar a corregir errores aleatorios debido a los cambios en intensidad fuente de luz. Si una lámpara u otra fuente de luz tiene potencia variable, afecta la absorción y por lo tanto, la emisión de una muestra. Sin embargo, la relación de un estándar interno al analito permanecerá constante, incluso si la fuente de luz no lo hace.

En cromatografía, una de las mayores fuentes de error es la inyección. Auto muestreadores minimizar esto, pero el error puede ser de 1 – 2% desviación estándar relativa.

En este ejemplo, estándares de vapor que contiene un patrón interno se analizaron mediante cromatografía de gases para establecer una curva de calibración. Una vez esta completa, entonces se podía medir la muestra desconocida y contabilizan las pérdidas debido a la volatilidad de la muestra.

Sólo ha visto introducción de Zeus de estándares internos. Ahora debe comprender las mejores prácticas para reducir al mínimo pérdida de muestra, normas internas y los factores de respuesta.

¡Gracias por ver!

Applications and Summary

Estándares internos se utilizan en muchos campos, incluyendo la espectroscopia y cromatografía. En espectroscopia, estándares internos pueden ayudar a corregir errores aleatorios debido a los cambios en intensidad fuente de luz. Si una lámpara u otra fuente de luz tiene potencia variable, afecta la absorción y por lo tanto, la emisión de una muestra. Sin embargo, la relación de un estándar interno al analito permanecerá constante, incluso si la fuente de luz no lo hace. Un ejemplo de ello está utilizando litio (Li) como estándar interno para el análisis de sodio en una muestra de sangre por la espectroscopia de llama. Li es químicamente similar al sodio pero no forma nativa se encuentra en la sangre.

Para la cromatografía, estándares internos se utilizan en cromatografía de gases y cromatografía líquida. Para aplicaciones con espectrometría de masas como detector, el estándar interno puede ser un analito isotópicamente etiquetados, por lo que el peso molecular (MW) será diferente a los analitos de interés. Estándares internos se utilizan en análisis farmacéuticos o medioambientales.

Transcript

Sample loss can occur every time a sample is handled or transferred, thereby making accurate calculations of concentration difficult.

To ensure accuracy, the effects of sample loss must be minimized using careful sample preparation and by limiting the number of sample handling and transfer steps. However, sample loss can also occur due to systematic errors, such as incomplete sample manipulation, matrix effects, and variations in analytic procedure.

These sources of loss can be accounted for by adding a known concentration of a species similar, but not identical, to the compound of interest. This is called an internal standard. Any sample losses that occur to the internal standard should be similar for the analyte, allowing for the concentration to be accurately calculated.

This video will illustrate the use of an internal standard and proper lab technique to account for sample loss when determining the concentration of an unknown.

An internal standard is a substance added in a known amount to standards, samples, and blanks during an analysis.

In chromatography and spectroscopy, the ratio of the signal for the internal standard and the analyte is calculated. This ratio, called the response factor, is proportional to the ratio of the analyte and standard concentrations.

Response factor, R, can be expressed by the following equation, where A represents the analytical signals of the sample and internal standard and C represents the concentrations of the sample and internal standard.

An internal standard can compensate for both systematic and random errors. For example, random errors—such as inconsistencies when measuring a sample—will be the same for both the internal standard and the analyte. Therefore, the ratio of their signals will not change.

For systematic errors, such as matrix effects in solution, the ratio will be unaffected as long as the matrix effect is equal for both the standard and the analyte.

While internal standards provide great benefit, it can be difficult to choose one that is suitable. An internal standard must have a signal that is similar, but not identical, to the analyte. It also cannot affect the measurement of the analyte in any way.

Finally, the concentration must be well known. This is achieved by ensuring that the internal standard is not natively present in the sample; thus, the only source of it in solution is the known concentration added.

In the following experiment, the concentration of caffeine in an unknown sample will be determined by gas chromatography.

This is achieved by creating a calibration curve using known caffeine solutions, with adenine as the internal standard. The slope of the calibration curve is equal to the response factor.

Once the response factor is known, the concentration of the unknown can be calculated from its measured chromatogram area ratio.

Now that you understand the basics of internal standards, let’s take a look at the procedure.

To begin the procedure, accurately weigh 100 mg of the internal standard, adenine, into a clean beaker.

Next, dissolve it in roughly 20 mL of dimethyl sulfoxide, and mix the solution.

Once the adenine has dissolved, pour the solution into a 50-mL volumetric flask.

Rinse the beaker and stir bar with 10 mL of DMSO, and pour the rinse into the flask. Repeat this rinse twice, to ensure proper solution transfer. Fill to the calibration mark, resulting in an internal standard with a concentration of 2 mg/mL.

Next, weigh 100 mg of caffeine into a beaker to prepare a stock solution. Dissolve the caffeine with a small amount of methanol. Then, use 3 rinses to transfer this solution to a fresh 25 mL volumetric flask. This is the 4 mg/mL stock solution. Use it to create 3 caffeine standards.

Next, add 0.2 mL of the internal standard, adenine, to each flask. Fill each to the final volume with methanol. Transfer each solution to a sample vial.

Run each caffeine standard through a gas chromatograph. Calculate the ratio of peak areas for the caffeine versus the adenine standard.

First, weigh 2 g of coffee into a 100-mL beaker, and record the weight.

Next, add 20 mL of methanol to extract the caffeine from the coffee. Allow the solution to stir for 20 min.

Using a Büchner funnel, filter out the coffee grounds. Rinse the beaker with a small amount of methanol, and pour this rinse into the funnel. Repeat the rinse twice.

Measure the final volume of the filtrate; it should be approximately 35 mL.

To prepare the sample for analysis, add 1 mL of the coffee extract to a sample vial. Then, add 0.2 mL of the adenine internal standard, and place the vial into the instrument’s auto-sampler rack.

Run a gas chromatography analysis of the sample, ensuring that the conditions are such that the caffeine and adenine are separate.

After completing the analysis, compute the peak area for both the internal standard and the analyte.

Once all the samples have been analyzed, the standard calibration curve can be determined for the caffeine/adenine solutions by plotting the ratios of the peak areas versus the ratios of the concentrations. The slope of this line, which represents the response factor, was 1.8.

Next, the GC data from the extracted coffee sample is analyzed. The ratio of the peak areas was calculated to be 1.78. Using the response factor and the known concentration of the internal standard, adenine, the concentration of caffeine in the unknown sample was calculated to be 0.33 mg/mL.

Many different types of reactions, across various scientific disciples, utilize internal standards to minimize the effects of errors and sample loss.

The effects of sample loss encountered during sample preparation can be minimized using internal standards, keeping their concentration ratio nearly constant.

In this example, bioactive lipids were extracted from lysed cells using a liquid-liquid extraction process. Stable isotope internal standards were added at the beginning of extraction to account for errors during sample preparation.

Internal standards were not only critical for the preparation of the bioactive lipids, but also for the analysis. The lipids were separated using high-performance liquid chromatography, and analyzed via mass spectrometry.

In spectroscopy, internal standards can help correct for random errors due to changes in light source intensity. If a lamp or other light source has variable power, it will affect the absorption and consequently, emission of a sample. However, the ratio of an internal standard to analyte will stay constant, even if the light source does not.

In chromatography, one of the largest sources of error is the injection. Auto-samplers help minimize this, but error can still be 1–2% relative standard deviation.

In this example, vapor standards containing an internal standard were analyzed using gas chromatography to establish a calibration curve. Once this was complete, the unknown sample could then be measured and the losses due to volatility of the sample accounted for.

You’ve just watched JoVE’s introduction to internal standards. You should now understand best practices for minimizing sample loss, internal standards, and response factors.

Thanks for watching!