3.2: Estándares internos

1. manejo de muestras correcta: Lo que una solución

1. Toma un vaso limpio y masa la cantidad correcta de la muestra en él. Registro real utilizado masa. En este ejemplo, se hace una solución de la adenina en un matraz aforado para uso como estándar interno para el análisis siguiente. La masa de la adenina es 100 mg. Hacer masa no directamente en un matraz aforado ya que tiene un cuello largo y la adenina no puede añadir o quitar fácilmente.
2. Añadir aproximadamente 25 mL de solvente (en este caso dimetilsulfóxido (DMSO)) en el vaso y dejar mezclar para disolver. En este ejemplo, la solución final se hace en un matraz aforado de 50 mL, así que sólo añadir unos 25 mL por lo que se puede enjuagar el vaso y la solución para el volumen final.
3. Una vez que el sólido se disuelva, verter la solución en el matraz aforado.
4. Enjuague el vaso y la barra de agitación con pequeñas cantidades de solvente, aproximadamente 10 mL y verter el enjuague al matraz volumétrico. Repetir dos veces más. Esto ayuda a asegurar a la transferencia de la solución adecuada.

2. preparación de una curva de calibración estándar interno

1. Preparar las muestras estándar deseadas para el análisis de cromatografía de gases. En este ejemplo, la cafeína se extrae del café usando acetonitrilo y entonces adenina se utiliza como estándar interno para la medición.
2. Para las muestras de cafeína, pesar la cantidad de muestra necesaria para hacer 1 mg/mL de muestra. Si se utiliza un matraz aforado de 10 mL, es de 10 mg.
3. Pesar el analito en un vaso de precipitados, agregar unos mL de disolvente (metanol aquí) para disolver y luego trasvasar al matraz volumétrico utilizando 3 enjuagues.
4. Hacer 3 más estándares en una manera similar con 0.2, 0.5 y 2 mg/mL cafeína.
5. Poner 1 mL de cada cafeína estándar en un frasco de la muestra.
6. Añadir 0,2 mL de estándar interno de la adenina de 2 mg/mL en cada frasco de la muestra.
7. Ejecutar el experimento de cromatografía de gases con cada estándar de cafeína. De cada cromatograma, calcular la relación de zonas de pico para el cafeína vs el estándar.
8. Hacer un diagrama de la relación de área vs la tasa de concentración. La pendiente de esa trama es el factor de respuesta.

3. preparación de una muestra Real con estándar interno para cromatografía de gases

1. Preparar la muestra deseada para el análisis de cromatografía de gases. En este ejemplo, se extrae la cafeína de café con acetrontrile.
2. Para la muestra de café, masa 2 g de café en un vaso de precipitados de 100 mL. Registrar el peso exacto del café.
3. Añadir 20 mL de acetonitrilo en el vaso.
4. Déjelo reposar 20 minutos, revolviendo frecuentemente.
5. El café molido hacia fuera usando un papel de filtro en un embudo de filtro.
6. Enjuague el filtro de papel de 3 x con pequeñas cantidades de acetonitrilo (5 mL).
7. Medir el volumen final del filtrado. Debe ser alrededor de 35 mL.

4. ejecutar la muestra y calcular la concentración

1. Tomar 1 mL de la muestra de extracto de café y agregar 0.2 mL del estándar interno en un frasco. Coloque el frasco en el estante del muestreador automático.
2. Realizar un análisis de GC de la muestra. Asegúrese de que las condiciones de la GC son tales que la cafeína y la adenina por separado. En este ejemplo, isotermos separaciones se realizan a 200 º C.
3. Después del análisis, calcular el área de pico para el pico de estándar interno y el pico del analito. Sus proporciones, calcular la cantidad de cafeína en la muestra.

5. resultados: Análisis de GC de cafeína con estándar interno

1. Análisis de GC de la cafeína se muestran en la figura 1. Adenina se utiliza como estándar interno. La relación de zonas de pico puede ser medida y trazado vs la relación de las concentraciones. La pendiente de la parcela es el factor de respuesta (en este caso 1.8).
2. La figura 2 muestra un cromatograma de una muestra de café con estándar interno de adenina. La relación entre el área de pico es 1,78. Utilizando el factor de respuesta y la concentración conocida de la adenina (0,33 mg/mL), se calcula la concentración de cafeína en la muestra desconocida a 0,33 mg/ml.

Figura 1. Parcela de calibración utilizando un patrón interno. Una parcela de los cocientes de concentración de área ratios vs 3 muestras estándar de cafeína (1, 0,5 y 0,2 mg/mL) con estándar interno de adenina de 0,33 mg/mL añadido a cada uno. La pendiente de la recta es 1.8, que es el factor de respuesta.

Figura 2. Cromatograma de café con estándar interno adenina. Una parcela de la respuesta del detector FID a las muestras. Los tres picos principales son adenina (IS), cafeína y ácido palmítico.

La pérdida de muestra puede ocurrir cada vez que se manipula o transfiere una muestra, lo que dificulta los cálculos precisos de la concentración.

Para garantizar la precisión, los efectos de la pérdida de muestras deben minimizarse mediante una preparación cuidadosa de la muestra y limitando el número de pasos de manipulación y transferencia de muestras. Sin embargo, la pérdida de muestras también puede ocurrir debido a errores sistemáticos, como la manipulación incompleta de la muestra, los efectos de la matriz y las variaciones en el procedimiento analítico.

Estas fuentes de pérdida pueden explicarse añadiendo una concentración conocida de una especie similar, pero no idéntica, al compuesto de interés. A esto se le llama norma interna. Cualquier pérdida de muestra que ocurra en el patrón interno debe ser similar para el analito, lo que permite calcular la concentración con precisión.

Este video ilustrará el uso de un estándar interno y una técnica de laboratorio adecuada para tener en cuenta la pérdida de muestras al determinar la concentración de un desconocido.

Un patrón interno es una sustancia que se añade en una cantidad conocida a los estándares, muestras y blancos durante un análisis.

En cromatografía y espectroscopia, se calcula la relación entre la señal para el patrón interno y el analito. Esta relación, llamada factor de respuesta, es proporcional a la relación entre el analito y las concentraciones estándar.

El factor de respuesta, R, se puede expresar mediante la siguiente ecuación, donde A representa las señales analíticas de la muestra y el patrón interno y C representa las concentraciones de la muestra y el patrón interno.

Un estándar interno puede compensar tanto los errores sistemáticos como los aleatorios. Por ejemplo, los errores aleatorios, como las inconsistencias al medir una muestra, serán los mismos tanto para el patrón interno como para el analito. Por lo tanto, la proporción de sus señales no cambiará.

En el caso de errores sistemáticos, como los efectos de matriz en solución, la relación no se verá afectada siempre que el efecto de matriz sea igual tanto para el patrón como para el analito.

Si bien las normas internas proporcionan grandes beneficios, puede ser difícil elegir una que sea adecuada. Un patrón interno debe tener una señal que sea similar, pero no idéntica, al analito. Tampoco puede afectar la medición del analito de ninguna manera.

Por último, hay que conocer bien la concentración. Esto se logra asegurándose de que el patrón interno no esté presente de forma nativa en la muestra; Por lo tanto, la única fuente de ella en solución es la concentración conocida añadida.

En el siguiente experimento, se determinará la concentración de cafeína en una muestra desconocida mediante cromatografía de gases.

Esto se logra mediante la creación de una curva de calibración utilizando soluciones de cafeína conocidas, con adenina como patrón interno. La pendiente de la curva de calibración es igual al factor de respuesta.

Una vez que se conoce el factor de respuesta, la concentración de la incógnita se puede calcular a partir de la relación de área del cromatograma medida.

Ahora que comprende los conceptos básicos de las normas internas, echemos un vistazo al procedimiento.

Para comenzar el procedimiento, pese con precisión 100 mg del patrón interno, adenina, en un vaso de precipitados limpio.

A continuación, disuélvalo en aproximadamente 20 ml de dimetilsulfóxido y mezcle la solución.

Una vez que la adenina se haya disuelto, vierta la solución en un matraz aforado de 50 ml.

Enjuague el vaso de precipitados y la barra agitadora con 10 ml de DMSO y vierta el enjuague en el matraz. Repita este enjuague dos veces para asegurar una transferencia adecuada de la solución. Llene hasta la marca de calibración, lo que da como resultado un patrón interno con una concentración de 2 mg/mL.

A continuación, pese 100 mg de cafeína en un vaso de precipitados para preparar una solución madre. Disuelve la cafeína con una pequeña cantidad de metanol. A continuación, utilice 3 enjuagues para transferir esta solución a un matraz aforado fresco de 25 ml. Esta es la solución madre de 4 mg/mL. Úsalo para crear 3 estándares de cafeína.

A continuación, añada 0,2 mL del patrón interno, adenina, a cada matraz. Llene cada uno hasta el volumen final con metanol. Transfiera cada solución a un vial de muestra.

Pase cada patrón de cafeína a través de un cromatógrafo de gases. Calcule la proporción de áreas pico para la cafeína en comparación con el estándar de adenina.

Primero, pese 2 g de café en un vaso de precipitados de 100 ml y registre el peso.

A continuación, agregue 20 ml de metanol para extraer la cafeína del café. Deje que la solución revuelva durante 20 minutos.

Usando un embudo B?chner, filtre los posos de café. Enjuague el vaso de precipitados con una pequeña cantidad de metanol y vierta este enjuague en el embudo. Repita el enjuague dos veces.

Mida el volumen final del filtrado; debe ser de aproximadamente 35 mL.

Para preparar la muestra para el análisis, agregue 1 mL del extracto de café a un vial de muestra. A continuación, añada 0,2 ml del patrón interno de adenina y coloque el vial en la gradilla del muestreador automático del instrumento.

Realice un análisis de cromatografía de gases de la muestra, asegurándose de que las condiciones sean tales que la cafeína y la adenina estén separadas.

Después de completar el análisis, calcule el área de pico tanto para el patrón interno como para el analito.

Una vez que se han analizado todas las muestras, se puede determinar la curva de calibración estándar para las soluciones de cafeína / adenina trazando las proporciones de las áreas pico frente a las proporciones de las concentraciones. La pendiente de esta línea, que representa el factor de respuesta, fue de 1,8.

A continuación, se analizan los datos de GC de la muestra de café extraída. Se calculó que la relación entre las áreas de pico era de 1,78. Utilizando el factor de respuesta y la concentración conocida del patrón interno, adenina, la concentración de cafeína en la muestra desconocida se calculó en 0,33 mg/mL.

Muchos tipos diferentes de reacciones, a través de varios discípulos científicos, utilizan estándares internos para minimizar los efectos de los errores y la pérdida de muestras.

Los efectos de la pérdida de muestra encontrados durante la preparación de la muestra se pueden minimizar utilizando estándares internos, manteniendo su relación de concentración casi constante.

En este ejemplo, los lípidos bioactivos se extrajeron de las células lisadas mediante un proceso de extracción líquido-líquido. Se añadieron patrones internos de isótopos estables al comienzo de la extracción para tener en cuenta los errores durante la preparación de la muestra.

Los patrones internos no solo fueron críticos para la preparación de los lípidos bioactivos, sino también para el análisis. Los lípidos se separaron mediante cromatografía líquida de alta resolución y se analizaron mediante espectrometría de masas.

En espectroscopia, los patrones internos pueden ayudar a corregir errores aleatorios debidos a cambios en la intensidad de la fuente de luz. Si una lámpara u otra fuente de luz tiene potencia variable, afectará la absorción y, en consecuencia, la emisión de una muestra. Sin embargo, la relación entre un patrón interno y un analito permanecerá constante, incluso si la fuente de luz no lo hace.

En cromatografía, una de las mayores fuentes de error es la inyección. Los muestreadores automáticos ayudan a minimizar esto, pero el error aún puede ser del 1,2% de desviación estándar relativa.

En este ejemplo, los patrones de vapor que contienen un patrón interno se analizaron mediante cromatografía de gases para establecer una curva de calibración. Una vez completado, se podía medir la muestra desconocida y contabilizar las pérdidas debidas a la volatilidad de la muestra.

Acabas de ver la introducción de JoVE a los estándares internos. Ahora debe comprender las prácticas recomendadas para minimizar la pérdida de muestras, los estándares internos y los factores de respuesta.

¡Gracias por mirar!