Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS
11 de diciembre de 2008
Este video describe un simple ahorro de tiempo para la técnica de la disociación del tejido automatizado utilizando el disociador gentleMACS para preparar una sola célula suspensiones de esplenocitos de ratón.
En este protocolo en video, verá cómo disociar bazo de ratón utilizando Gentle Max, un dispositivo automático de banco que puede desintegrar mecánicamente tejidos mediante tubos especiales para producir suspensiones celulares viables. Tras la disociación, los bazos se filtran con filtros de separación Max Pres, se centrifugan y se suspenden para aplicaciones posteriores. Hola, me llamo Melanie mlu.
Soy científico en Milton Biotech aquí en BE Lab Park, Alemania. Hoy les mostraré la preparación de una suspensión de células individuales a partir del bazo de ratón utilizando la disociación GenX. La disociación GenX permite la preparación muy sencilla y rápida de una suspensión de células individuales.
Así que comencemos. Para evitar disociaciones manuales tediosas y a menudo dolorosas, el disociador gentle max permite disociar tejidos de manera muy eficiente bajo condiciones controladas y reproducibles. El tejido se disocia suavemente utilizando tubos C violeta en suspensiones viables de células individuales.
El tubo C proporciona una abertura sellada con septum en el centro de la tapa, lo que permite pipetear desde el tubo manteniendo siempre la esterilidad. Para suspender las células disociadas, deberá utilizar el tampón adecuado de P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. El tampón se prepara añadiendo una parte de solución stock de BSA a 20 partes de solución de AutoMax con EDTA.
Mediante los filtros de separación Max Pres, las muestras de tejido se separan de todos los agregados celulares, favoreciendo una separación máxima exitosa y el análisis subsiguiente. Para comenzar el procedimiento, cargamos el tubo C con un volumen de tampón. Según la masa de los bazo, un bazo sano de un ratón hembra de biopsia de seis a siete semanas de edad pesa aproximadamente entre 80 y 120 miligramos.
Cada uno o dos bazo de esta masa requiere tres mililitros de tampón. No exceda un volumen total de 10 mililitros. Ahora podemos agregar nuestro bazo diseccionado al tubo C que contiene tres mililitros de tampón. Los bazo de animales mayores o de animales con infecciones suelen ser más grandes y deben pesarse en tampón.
Los volúmenes de tampón deben ajustarse proporcionalmente, pero nuevamente no deben exceder un volumen total de 10 mililitros. Asegúrese ahora de que la tapa del tubo C esté bien ajustada y conecte el tubo C al dispositivo de disociación. Con la tapa hacia abajo, encienda el dispositivo de disociación para uno o dos bazo(s) y seleccione el Programa M bazo oh uno. El programa tardará 56 segundos en completarse; si el número de bazo(s) es mayor, utilice el Programa M bazo oh cuatro.
Este programa puede utilizarse con hasta 720 miligramos de tejido esplénico. Tras la finalización del programa, el tejido esplénico nativo se disocia en una suspensión de células PLE, que tiene este aspecto; centrifugue brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo. Esto garantizará que el rotor y el estator queden libres de todas las células, las cuales se recogen en el fondo del tubo C.
Extraemos la muestra a través de la abertura sellada con septo en la tapa del tubo C utilizando un pipeteador de mil microlitros. Para iniciar el paso de filtración, aplicamos el tejido disociado al filtro de preseparación o a un colador con un tamaño de poro de 30 micrones. El colador debe encajar en un tubo de 15 mililitros para uno o dos bazo, o en un tubo de 50 mililitros para más de dos bazo.
Deje que la suspensión celular pase a través del filtro y luego lave el filtro aplicando cinco mililitros de tampón. Ahora, centrifugue el tubo con la suspensión celular a 300 Gs a temperatura ambiente durante 10 minutos para recoger todas las células en un sedimento de células esplénicas. Ahora que tenemos un sedimento de células disociadas, debemos aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en una cantidad adecuada de tampón para la disociación esplénica.
El uso del max gentle producirá un alto porcentaje de cito PLE viables, lo cual se demuestra mediante citometría de flujo utilizando el quant max. Las células muertas se tiñen con yoduro de propidio y el ejemplo proporcionado. El gráfico de dispersión lateral y directa muestra cito SP preparados. Vale.
Le he mostrado cómo disociar el tejido esplénico utilizando esta disociación suave X. Cuando realice este procedimiento, es importante ajustar la cantidad de tampón al tamaño de la muestra y elegir el programa Gentle X adecuado. Bien, eso es todo.
Buena suerte con su experimento.
Descripción general
Este protocolo en video demuestra una técnica eficiente para la disociación automatizada de tejidos de bazo de ratón utilizando el disociador gentleMACS. El método produce suspensiones de células individuales viables adecuadas para aplicaciones posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- La disociación del tejido es fundamental para obtener suspensiones de células individuales.
- La disociación manual puede ser tediosa e ineficiente.
- El disociador gentleMACS proporciona un método reproducible y controlado.
- Las suspensiones de células viables son esenciales para aplicaciones posteriores.
Objetivo del estudio
- Demostrar una técnica que ahorra tiempo para la disociación de tejidos.
- Preparar suspensiones de células individuales a partir de bazo de ratón.
- Mejorar la eficiencia de la preparación de células para la investigación.
Métodos Utilizados
- Uso del disociador gentleMACS con tubos especializados.
- Preparación de la solución tampón para la suspensión del tejido.
- Filtración del tejido disociado utilizando filtros de separación Max Pres.
- Centrifugación para recoger pellets de células viables.
Resultados principales
- Disociación eficiente de bazo de ratón en suspensiones de células individuales.
- Alto porcentaje de células viables demostrado mediante citometría de flujo.
- Eliminación exitosa de agregados celulares para un análisis preciso.
- Reproducibilidad de los resultados en diferentes tamaños de muestra.
Conclusiones
- El disociador gentleMACS simplifica significativamente la disociación de tejidos.
- La preparación adecuada del tampón es fundamental para obtener resultados exitosos.
- Este método puede aplicarse a diversos tipos de tejidos para el análisis celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación automatizada de suspensiones de células individuales a partir del bazo de ratón mediante el Disociador gentleMACS aborda un cuello de botella crítico en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano e inmunología. La disociación estandarizada y reproducible permite una separación, análisis y cultivo celular confiables en pasos posteriores, lo que respalda la confianza predictiva en la validación de objetivos y el cribado. Esta capacidad reduce la variabilidad manual y acelera la transición desde el tejido hasta datos accionables de células individuales en diversos portafolios de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la generación rápida de suspensiones viables de células individuales para inmunofenotipado y ensayos funcionales.
- Apoya la desestimación biológica al proporcionar material de entrada consistente para la interrogación de vías y dianas.
- Facilita la preparación reproducible de muestras, reduciendo variables de confusión en estudios de validación de dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona suspensiones celulares estandarizadas para el desarrollo de ensayos y plataformas de cribado de alto rendimiento.
- Mejora la reproducibilidad del ensayo al minimizar la variabilidad de la disociación manual.
- Prepara muestras compatibles con citometría de flujo y clasificación celular, permitiendo resultados cuantitativos robustos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Proporciona suspensiones de células con alta viabilidad para estudios traslacionales de biomarcadores y caracterización inmunológica preclínica.
- Asegura la continuidad desde la recolección del tejido hasta los análisis funcionales y fenotípicos posteriores.
- Reduce el riesgo de pérdida o degradación de la muestra, favoreciendo una toma de decisiones preclínicas confiable.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la interfaz entre la recolección de tejidos y los ensayos celulares posteriores, conectando los flujos de trabajo de descubrimiento inicial, cribado e investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya las pruebas de hipótesis y estudios mecanicistas al proporcionar muestras de alta calidad de células individuales.
- Selección: Proporciona suspensiones celulares reproducibles y escalables listas para ensayos y evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa de viabilidad y fenotipo mediante citometría de flujo y lecturas relacionadas.
- Investigación Traducional: Se ajusta a las necesidades de perfiles de biomarcadores y células inmunitarias en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y automatizable de disociación adaptable a diferentes tipos de tejidos y estudios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios basados en células.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, la estandarización y el rendimiento en la preparación de muestras.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de continuar o descartar y reduce el desperdicio de recursos debido a preparaciones fallidas o inconsistentes.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al garantizar material de entrada confiable para múltiples programas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere familiaridad con protocolos automatizados de disociación de tejidos y preparación de tampones.
- Necesita acceso al disociador gentleMACS, tubos C y equipos compatibles de filtración y centrifugación.
- Exige la estandarización entre equipos del volumen de muestra y de tampón para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diferentes tamaños de bazo y potencialmente a otros tipos de tejidos con ajustes del protocolo.
- El volumen de tampón y la selección del programa deben ajustarse a la masa de la muestra para asegurar una disociación óptima.
