Name: Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprende a preparar suspensiones de células únicas de bazo de ratón usando el disociador gentleMACS. Este método automatizado produce células viables para análisis de citometría de flujo y estudios inmunológicos.

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Introducción a los Equipos <ol><li> Tejido es ligeramente disociado, con violeta tubos C en viable una sola célula suspensiones. </li><li> El tampón PBS / BSA EDTA se utiliza para disociar las células. El buffer se prepara añadiendo una parte de la solución de archivo BSA a 20 partes de autoMACS Solución de enjuague que contiene EDTA. </li><li> El MACS separación pre-filtros se utilizan para que las muestras de tejido disociado están libres de todos los grupos de células, la promoción de la separación MACS éxito y su posterior análisis. </li></ol> Disociar las células del bazo <ol><li> El bazo entero se disscociated en una sola célula suspensiones de esplenocitos con el disociador gentleMACS. </li><li> Para comenzar el procedimiento, el tubo de carga C con un volumen de tampón de acuerdo a la masa del bazo. Un bazo sano de un adulto joven hembra BALB / c ratón pesa alrededor de 80-120 mg. Cada 1 a 2 bazos de esta masa requiere de 3 ml de solución tampón. El bazo de los animales más viejos o los animales con infecciones suelen ser mayores y se deben sopesar en el buffer. Los volúmenes de almacenamiento intermedio debe ser reducido en consecuencia. No excedan de un volumen total de memoria intermedia de 10 ml. </li><li> Añadir el bazo diseccionados para el metro C con 3 ml de solución tampón. </li><li> Asegúrese de que la tapa del tubo C es apretado y conectar el tubo de C a la disociador con la tapa hacia abajo. </li><li> Encienda el disociador. Por 1-2 el bazo, seleccione m_spleen_01 programa. El programa tendrá 56 segundos para completar. Si el número de bazo es mayor, use el programa m_spleen_04, este programa puede ser utilizado para un máximo de 720 mg de tejido esplénico. </li><li> Después de completar el programa de los tejidos del bazo nativos se disocia en una suspensión de esplenocitos. </li><li> Centrifugar la suspensión de células enteras en 300xg a temperatura ambiente durante unos 30 segundos. Esto asegurará que el rotor y el estator se libera de todas las células que se recogen en la parte inferior del tubo C. </li><li> Retire la muestra a través del tabique sellado de apertura en la tapa del tubo con una pipeta de C 1000 microlitros. </li></ol> Filtración de paso <ol><li> Para comenzar la etapa de filtración, aplicar el tejido disociado al filtro de pre-separación o un colador de células con un tamaño de micras de poro 30. El filtro debe ajustarse a un tubo de 15 ml por 1-2 el bazo o un tubo de 50 ml por más de 2 bazos. </li><li> Deje que la suspensión de células pasan a través. A continuación, lavar el filtro mediante la aplicación de 5 ml de solución tampón. </li><li> Ahora, centrifugar el tubo con la suspensión celular a 300xg, a temperatura ambiente durante 10 minutos para recoger todos los esplenocitos en un pellet de células del bazo. </li><li> Ahora, que tenemos una bolita de esplenocitos disociado, que debe aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en una cantidad adecuada de tampón. </li></ol> La disociación del bazo con el disociador gentleMACS dará un alto porcentaje de esplenocitos viables, lo cual es demostrado por citometría de flujo utilizando el analizador de MACSQuant. Las células muertas se tiñen con yoduro de propidio. En el ejemplo proporcionado, la dispersión frontal lado gráfico de puntos muestra los esplenocitos preparado.

Todos los protocolos y hojas de datos están disponibles en<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; Http://www.miltenyibiotec.com.</a&gt;.

Para evitar disociaciones manual tedioso ya menudo dolorosa, el disociador gentleMACS permite disociar los tejidos de manera muy eficiente en condiciones controladas y reproducibles. El procedimiento de disociación del tejido es suave con las células y las suspensiones de producción de células con una tasa alta viabilidad. El disociador gentleMACS en combinación con C Tubos está diseñado para la preparación de una sola célula suspensiones de varios tejidos. El instrumento está equipado con una serie de programas pre-establecidos para disociar de bazo de ratón, hígado, pulmón, o en el tejido neural. La gama de programas y protocolos serán continuamente expandido para incluir otros tejidos.

<table><tbody><tr><td>Kit de inicio gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tubos C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tubos de 13 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solución de lavado autoMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solución stock de BSA MACS&amp;#174;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Filtros previos a la separación</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Analizador MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>Solución de yoduro de propidio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentlemacs

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Una sola célula suspensiones son un requisito previo para realizar experimentos en la separación celular, el análisis de células y cultivos celulares. Para evitar disociaciones manual tedioso ya menudo dolorosa la disociador gentleMACS permite disociar los tejidos de manera muy eficiente en condiciones controladas y reproducibles. El disociador gentleMACS óptima se puede disociar de bazo de ratón, la combinación de ahorro de tiempo y de normalización por el usuario de seguridad. Este vídeo se describe cómo disociar el bazo del ratón con el disociador gentleMACS, un sistema automatizado de sobremesa dispositivo mecánico que puede alterar los tejidos que utilizan tubos especiales para producir suspensiones de células viables. Después de la disociación, el bazo se filtra, se centrifuga y se resuspende para otras aplicaciones.

Este video describe un simple ahorro de tiempo para la técnica de la disociación del tejido automatizado utilizando el disociador gentleMACS para preparar una sola célula suspensiones de esplenocitos de ratón.

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Las suspensiones de células individuales son un requisito previo para los experimentos de separación, análisis y cultivo celular. Para evitar la tediosa y a menudo dolorosa manipulación manual...

En este protocolo en video, verá cómo disociar bazo de ratón utilizando Gentle Max, un dispositivo automático de banco que puede desintegrar mecánicamente tejidos mediante tubos especiales para producir suspensiones celulares viables. Tras la disociación, los bazos se filtran con filtros de separación Max Pres, se centrifugan y se suspenden para aplicaciones posteriores. Hola, me llamo Melanie mlu.Soy científico en Milton Biotech aquí en BE Lab Park, Alemania. Hoy les mostraré la preparación de una suspensión de células individuales a partir del bazo de ratón utilizando la disociación GenX. La disociación GenX permite la preparación muy sencilla y rápida de una suspensión de células individuales.Así que comencemos. Para evitar disociaciones manuales tediosas y a menudo dolorosas, el disociador gentle max permite disociar tejidos de manera muy eficiente bajo condiciones controladas y reproducibles. El tejido se disocia suavemente utilizando tubos C violeta en suspensiones viables de células individuales.El tubo C proporciona una abertura sellada con septum en el centro de la tapa, lo que permite pipetear desde el tubo manteniendo siempre la esterilidad. Para suspender las células disociadas, deberá utilizar el tampón adecuado de P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. El tampón se prepara añadiendo una parte de solución stock de BSA a 20 partes de solución de AutoMax con EDTA.Mediante los filtros de separación Max Pres, las muestras de tejido se separan de todos los agregados celulares, favoreciendo una separación máxima exitosa y el análisis subsiguiente. Para comenzar el procedimiento, cargamos el tubo C con un volumen de tampón. Según la masa de los bazo, un bazo sano de un ratón hembra de biopsia de seis a siete semanas de edad pesa aproximadamente entre 80 y 120 miligramos.Cada uno o dos bazo de esta masa requiere tres mililitros de tampón. No exceda un volumen total de 10 mililitros. Ahora podemos agregar nuestro bazo diseccionado al tubo C que contiene tres mililitros de tampón. Los bazo de animales mayores o de animales con infecciones suelen ser más grandes y deben pesarse en tampón.Los volúmenes de tampón deben ajustarse proporcionalmente, pero nuevamente no deben exceder un volumen total de 10 mililitros. Asegúrese ahora de que la tapa del tubo C esté bien ajustada y conecte el tubo C al dispositivo de disociación. Con la tapa hacia abajo, encienda el dispositivo de disociación para uno o dos bazo(s) y seleccione el Programa M bazo oh uno. El programa tardará 56 segundos en completarse; si el número de bazo(s) es mayor, utilice el Programa M bazo oh cuatro.Este programa puede utilizarse con hasta 720 miligramos de tejido esplénico. Tras la finalización del programa, el tejido esplénico nativo se disocia en una suspensión de células PLE, que tiene este aspecto; centrifugue brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo. Esto garantizará que el rotor y el estator queden libres de todas las células, las cuales se recogen en el fondo del tubo C.Extraemos la muestra a través de la abertura sellada con septo en la tapa del tubo C utilizando un pipeteador de mil microlitros. Para iniciar el paso de filtración, aplicamos el tejido disociado al filtro de preseparación o a un colador con un tamaño de poro de 30 micrones. El colador debe encajar en un tubo de 15 mililitros para uno o dos bazo, o en un tubo de 50 mililitros para más de dos bazo.Deje que la suspensión celular pase a través del filtro y luego lave el filtro aplicando cinco mililitros de tampón. Ahora, centrifugue el tubo con la suspensión celular a 300 Gs a temperatura ambiente durante 10 minutos para recoger todas las células en un sedimento de células esplénicas. Ahora que tenemos un sedimento de células disociadas, debemos aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en una cantidad adecuada de tampón para la disociación esplénica.El uso del max gentle producirá un alto porcentaje de cito PLE viables, lo cual se demuestra mediante citometría de flujo utilizando el quant max. Las células muertas se tiñen con yoduro de propidio y el ejemplo proporcionado. El gráfico de dispersión lateral y directa muestra cito SP preparados. Vale.Le he mostrado cómo disociar el tejido esplénico utilizando esta disociación suave X. Cuando realice este procedimiento, es importante ajustar la cantidad de tampón al tamaño de la muestra y elegir el programa Gentle X adecuado. Bien, eso es todo.Buena suerte con su experimento.

preparation-single-cell-suspensions-from-mouse-spleen-with-gentlemacs

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe la preparación del factor de crecimiento de las células T utilizados para la expansión in vitro de antígenos específicos de las líneas de linfocitos T de rata.

La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para la agitación del tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido pulmonar se explica.

La preparación estandarizada de un solo suspensiones de células de tejido pulmonar de ratón con el disociador gentleMACS

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para aggitation tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido nerual se explica.

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Este video muestra un procedimiento para la transferencia adoptiva de células dendríticas presentadoras de antígenos (CD) tratadas con alto contenido de sal a ratones. Las células dendríticas (CD) murinas CD11c+ se exponen a un medio que contiene altas cantidades de sodio, formando aductos de proteína isolevuglandina (IsoLG) en las células. Estos aductos sirven como neoantígenos y se presentan en la superficie de las CD. Las células tratadas con alto contenido de sal se inyectan en ratones a...

Un método para el tratamiento con alto contenido de sal de células dendríticas y su transferencia adoptiva a ratones

El video muestra la preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de un tejido cerebral murino. Implica la digestión enzimática para liberar células del tejido cerebral, seguida de la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las células inmunitarias en función de sus densidades para obtener la suspensión unicelular.

Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

La citometría de flujo puede utilizarse para evaluar el estado de la cromatina dentro de las células T. Este protocolo permite a los científicos interpretan evidencia de descondensación de la cromatina durante la activación de las células T demostrada por un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de anticuerpos histona H3 fluorescentes...

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.

Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

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Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.

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Aquí, presentamos un protocolo para aislar exosomas derivados del bazo de ratón utilizando una combinación de digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación.

Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

Aprende a preparar suspensiones de células únicas de bazo de ratón usando el disociador gentleMACS. Este método automatizado produce células viables para análisis de citometría de flujo y estudios inmunológicos.

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

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