Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa
3 de noviembre de 2008
Función de la membrana de proteínas está regulada por la composición lipídica de la membrana celular. Este artículo detalla cómo video-para formar un parche a través de electrodos de dos capas de parches, así como el uso de canales de gramicidina como reporteros de propiedades de la membrana alterado.
Hola, soy la Dra. Ola Anderson del Departamento de Fisiología y Biofísica del Weill Cornell Medical College en la ciudad de Nueva York. Mi nombre es Olson. Soy estudiante de biomedicina computacional en el laboratorio de Olive Anderson.
Y soy Shail Collingwood, técnico de investigación también del laboratorio de Anderson. Hoy les mostraremos cómo formar una bicapa, una biocapa, cómo aislar una pequeña membrana utilizando el electrodo de perforación de biocapa, cómo registrar la actividad de canales individuales y cómo analizar los resultados, utilizando así los canales Gramin como sondas de las propiedades de la bicapa lipídica. En un video anterior, les mostramos cómo prepararse para estos experimentos.
Les mostramos cómo preparar la cámara que utilizamos y cómo preparar el electrodo de perforación de bicapa que usamos para aislar la pequeña capa de membrana donde registramos la actividad del canal. Así que vamos a perforar algunas bicapas. Para comenzar a preparar los experimentos de bicapa, agregue 2,5 mililitros de solución electrolítica equilibrada en temperatura a cada compartimento de la cámara previamente pintada. La solución que generalmente usamos es cloruro de sodio uno molar más diez milimolar.
Hecha la amortiguación a pH siete, ajuste el microscopio y la fuente de luz de modo que el orificio en el teflón quede centrado en su campo de visión y bien iluminado. Introduzca la micropipeta de vidrio en un porta-microelectrodo. Conecte una jeringa al porta con un trozo de tubo de tigón.
Llene la pipeta en el porta-electrodo mediante succión. Tenga cuidado de evitar burbujas, ya que podrían interrumpir la conexión eléctrica entre el pellet de plata en el porta-electrodo y la punta de la pipeta. Aplique una pequeña cantidad de vaselina al tornillo, luego colóquelo en el porta-electrodo microscópico.
La vaselina ayuda a crear un sello hermético al aire. Conecte el porta-electrodos al cabezal del amplificador de parche en la jaula de Faraday. Coloque la punta de la micropipeta centrada y justo detrás del orificio en la partición de teflón.
Coloque el electrodo de plata enrollado en la cámara frontal. Fíjelo en su lugar con arcilla modeladora y conéctelo al circuito de comando de voltaje. Finalmente, equilibre los electrodos.
Esto es crítico porque los dos electrodos, el del frente y el del portaelectrodo micro, pueden tener potenciales de media celda ligeramente diferentes. El potencial de media celda es la diferencia entre el metal de plata y el electrodo y la solución electrolítica adyacente al recubrimiento de cloruro de plata. Equilibre los electrodos ajustando el desplazamiento manual de modo que la corriente que fluye entre los dos compartimentos fluctúe entre menos 200 y más 200 picoamperios en el registro de parche.
El potencial de desplazamiento cambiará con el tiempo, por lo que equilibrará los electrodos a intervalos regulares durante todo el experimento para formar la membrana de bicapa lipídica. Limpie una pipeta de pastilla pulida con llama con la solución fch según se describe en el video adjunto. Sumerja la pipeta limpia en la solución lipídica de recubrimiento y deje que ascienda aproximadamente un milímetro hacia el interior de la pipeta.
Coloque la punta de la pipeta justo frente al orificio en la partición de teflón y pinte suavemente una burbuja de la solución lipídica sobre el orificio. Cuando se tiene éxito, se forma una burbuja lipídica brillantemente coloreada a través del orificio, con una forma de toro o dona de lípido que la une a la partición de teflón. Deje que la membrana se adelgace, lo cual puede facilitarse aplicando un potencial de 100 a 200 milivoltios a través de la membrana.
Coloque la punta de la micropipeta de vidrio en el Taurus y déjela reposar durante unos minutos para lograr un mejor sellado entre la pipeta y la bicapa. En este momento, está listo para aislar un parche de membrana utilizando una micropipeta de vidrio. Ahora dope la membrana con gramin.
Esta solución de gramin se preparó a partir de un stock de un micromolar que se diluyó a uno a 10 nanomolares. En óxido de sulfuro de dimetilo, generalmente se añaden uno a 10 microlitros de la dilución a cada lado de la membrana para que la concentración final esté en el rango de picomolares. Utilice las barras magnéticas de agitación para agitar la solución durante aproximadamente dos minutos y espere otros 10 minutos antes de formar una nueva membrana pequeña para registrar la actividad de canales individuales.
Este tiempo de peso permite que la gramicidina se incorpore a la membrana. Verifique la actividad del canal aplicando un voltaje. Por lo general, deseamos aproximadamente un evento de canal por segundo.
Los canales son visibles como cambios discretos hacia arriba y hacia abajo en la corriente de la membrana. Ahora está listo para comenzar el experimento real. Primero, registre los trazos de corriente control.
Equilibre el electrodo como se demostró anteriormente, forme una pequeña membrana o parche según se describe en el video adjunto. Aplique 200 milivoltios positivos y registre la actividad del canal individual. Debe recopilar entre 100 y 200 transiciones de corriente de canal individual.
Repita este paso con -200 milivoltios. Rompa el parche expulsando el electrolito a través de la punta de la pipeta. Utilizando el tornillo de nailon, reequilibre los electrodos, retire la pipeta hacia la cámara trasera, expulse el exceso de lípido y forme un nuevo parche.
También puede repetir estos pasos para obtener grabaciones a otros potenciales. Ahora está listo para registrar los trazos de corriente experimentales en el modificador de bicapa. En este caso, el antidepresivo fluoxetina se añade a ambos lados de la membrana.
La solución stock de fluoxetina debe diluirse hasta 25 milimolar en DMSO. Añada cinco microlitros de esta solución para alcanzar una concentración de 50 micromolar en la cámara. El DMSO puede afectar las propiedades del bicapa. Por lo tanto, es importante limitar la cantidad de DMSO en la solución a 25 microlitros (1 % o 150 milimolar).
Agite durante cinco minutos y espere 10 minutos para permitir que el modificador se equilibre entre la solución acuosa y la membrana. Ahora, registre la actividad del canal como se describió previamente en presencia del modificador. Repita estos pasos para registrar la actividad del canal a concentraciones crecientes del modificador.
Aprendemos mucho sobre los cambios en la bicapa al cuantificar la duración de los canales y las tasas de aparición. Para realizar este tipo de análisis, necesitamos detectar la formación y desaparición de canales. Aquí utilizamos un algoritmo basado en transiciones en el que la computadora calcula la derivada primera para determinar cambios rápidos en la corriente y los marca como eventos de canal.
Los eventos se almacenan como una serie temporal para ayudarnos a determinar las duraciones de los canales antes y después de la transición. También se almacenan los niveles de corriente y ayudan a determinar las amplitudes del canal a medida que avanza el experimento. La computadora construye un histograma de amplitud de transición de corriente, lo que permite seguir la adquisición de transiciones de corriente.
Además, le permite evaluar la calidad del experimento. Si las amplitudes de corriente en las transiciones varían ampliamente, tiene problemas. Si el histograma es estrecho, lo está haciendo bien.
Cuando haya acumulado más de 200 eventos de transición, calcule la corriente promedio y la desviación estándar para las transiciones en el pico principal. Puede estimar la tasa de aparición del canal simplemente dividiendo el número de transiciones en el histograma de amplitud de transición de corriente por el tiempo de observación. Recuerde también dividir por dos, porque un canal se cuenta dos veces en el histograma: una vez cuando aparece y otra cuando desaparece.
Analice la serie temporal de eventos de transición para obtener las distribuciones de duración del canal. La determinación de las duraciones es sencilla en trazas de corriente donde no hay más de un canal conductor en ningún momento. En este caso, la computadora detecta si cada transición corresponde a la aparición o desaparición de un canal, y un evento de desaparición solo puede pertenecer al evento de aparición anterior.
El tiempo entre las dos transiciones es la duración del canal. En casos donde las transiciones del canal ocurren demasiado cerca como para distinguirlas, debe asignar manualmente las apariciones y desapariciones. La asignación es más compleja si tiene dos o más canales conduciendo simultáneamente, porque ahora no sabe a qué aparición de canal pertenece cada desaparición.
Por esta razón, es preferible tener una baja actividad del canal. Puede resolver el problema de asignación utilizando un generador de números aleatorios para asignar apariciones a desapariciones. De este modo, se obtiene una serie de duraciones de vida del canal.
Esto se convierte en un histograma de duración de vida, que a su vez se convierte en una gráfica de supervivencia, para determinar la duración de vida promedio mediante el ajuste de una distribución exponencial simple a la gráfica de supervivencia utilizando un ajuste de curva por mínimos cuadrados no lineales y experimentos en los que la membrana grande no se rompe. Cuando se añade el modificador de bicapa, se puede comparar el efecto sobre las tasas de aparición del canal. Dicha comparación no está justificada si la membrana grande se rompe, ya que la función de las proteínas de membrana está regulada por la composición lipídica de la membrana celular.
Esta regulación se debe a una combinación de interacciones específicas entre lípidos y proteínas, así como a interacciones más generales entre la bicapa lipídica y las proteínas de membrana. Estas interacciones son particularmente importantes en la investigación farmacológica. Dado que muchos fármacos actuales disponibles en el mercado son anfifílicos y pueden alterar las propiedades de la bicapa lipídica, lo que a su vez puede provocar una función alterada de las proteínas de membrana.
Los canales gramin pueden utilizarse como transductores moleculares de fuerza para indicar si los anfifilos pueden alterar las propiedades de la bicapa lipídica. Representar gráficamente los cambios en el tiempo de vida y la tasa de aparición en función de la concentración del modificador proporciona información sobre las alteraciones en las propiedades de la bicapa.
Una frecuencia aumentada significa que la bicapa se deforma más fácilmente para acomodar el sitio Gram y la dimerización. Una vida media aumentada significa que la deformación de la bicapa asociada con la formación del canal no es tan costosa energéticamente. Un modificador puede aumentar la frecuencia y la vida media al incrementar la elasticidad de la membrana o afectar la curvatura.
Ahora hemos mostrado cómo usar canales cromogénicos para verificar si las moléculas pequeñas alteran las propiedades elásticas de la bicapa. Y eso es todo. Gracias por ver.
Buena suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este artículo en video demuestra la formación de una membrana de bicapa lipídica utilizando electrodos de parche de bicapa y el uso de canales de gramicidina para evaluar las propiedades de la membrana. Proporciona una guía paso a paso para aislar parches de membrana y registrar la actividad de canales individuales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Electrofisiología
- Biofísica
- Biología de Membranas
Antecedentes
- La función de las proteínas de membrana está influenciada por la composición lipídica.
- Los canales de gramicidina actúan como indicadores de alteraciones en las propiedades de la membrana.
- Comprender la dinámica de la bicapa lipídica es fundamental para los estudios biofísicos.
- Las técnicas de parche atrapado son esenciales para estudiar la actividad de canales individuales.
Objetivo del estudio
- Demostrar la formación de bicapas lipídicas para estudios electrofisiológicos.
- Ilustrar el uso de la gramicidina como sonda para propiedades de membranas.
- Proporcionar un protocolo para registrar la actividad de canales individuales en bicapas lipídicas.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones electrolíticas y configuración de la cámara.
- Aislamiento de pequeños parches de membrana utilizando electrodos de parche en bicapa.
- Aplicación de gramicidina a la membrana para el análisis de la actividad del canal.
- Registro de trazas de corriente bajo condiciones variables de voltaje.
Resultados principales
- Se logró la formación exitosa de membranas de bicapa lipídica.
- Los canales de gramicidina se incorporaron eficazmente a la bicapa.
- Se registró la actividad de canales individuales, revelando la dinámica de la membrana.
- Se cuantificaron las duraciones de los canales y las tasas de aparición para su análisis.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar las propiedades de las bicapas lipídicas.
- Los canales de gramicidina son útiles para investigar la dinámica de las membranas.
- Las técnicas electrofisiológicas pueden proporcionar información sobre la función de las proteínas de membrana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa de las propiedades elásticas de la bicapa es fundamental para reducir los riesgos asociados a dianas terapéuticas de proteínas de membrana, ya que muchos fármacos modulan la mecánica de la membrana y, por ende, alteran la función proteica. El monitoreo de moléculas individuales mediante canales de gramicidina proporciona una lectura directa y de alta resolución de los cambios en las propiedades de la bicapa en respuesta a moléculas pequeñas. Esta capacidad fortalece la confianza predictiva en la evaluación temprana de compuestos e informa la selección de carteras para terapéuticos activos sobre membranas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de cómo los compuestos candidatos alteran la mecánica de la membrana relacionada con la función del blanco.
- Apoya la desvinculación mecanicista al distinguir los efectos del compuesto en la bicapa frente a interacciones específicas de la proteína.
- Proporciona validación funcional de los blancos de proteínas de membrana en condiciones de bicapa fisiológicamente relevantes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un ensayo reproducible y cuantitativo para detectar la modulación de propiedades de la bicapa por moléculas pequeñas.
- Facilita la estandarización del cribado de compuestos activos sobre membranas mediante mediciones de corriente de canal individual.
- Proporciona resultados robustos y escalables, como tasas de aparición y tiempos de vida de los canales, para análisis comparativo.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relaciona los efectos de los compuestos sobre las propiedades de la bicapa con el posible impacto farmacológico in vivo sobre las proteínas de membrana.
- Apoya la continuidad traslacional al vincular los cambios biofísicos en la membrana con la modulación funcional de proteínas.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo para candidatos a fármacos dirigidos a membranas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder y la evaluación preclínica de compuestos activos sobre membranas.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona pruebas cuantitativas de hipótesis nula sobre cambios inducidos por compuestos en bicapas, utilizando lecturas de canales de gramicidina.
- Selección: Suministra mediciones estandarizadas y reproducibles de corrientes de canales individuales para la selección de compuestos.
- Análisis: Genera distribuciones del tiempo de vida del canal y de la frecuencia de aparición para comparaciones estadísticas entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona cambios en las propiedades de bicapas in vitro con posibles modulaciones de proteínas de membrana in vivo.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la evaluación continua de agentes activos sobre membranas en diversos programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas de proteínas de membrana y en los estudios del mecanismo de acción de compuestos.
- Valor operativo: Proporciona mediciones estandarizadas, escalables y reproducibles a nivel de molécula individual para flujos de trabajo entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas para carteras dirigidas a membranas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en evidencia biofísica directa de interacción con la membrana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología y análisis de canales individuales.
- Exige instrumentación especializada, como configuraciones de parche adherido (patch clamp) y cámaras de bicapa.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos de trabajo en cuanto a protocolos y algoritmos de análisis de datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes composiciones lipídicas o sistemas de proteínas de membrana.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de una actividad baja de los canales para garantizar la asignación y el análisis precisos de los eventos.
