Name: Preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a preparar bicapas lipídicas planas para estudios de canales iónicos en electrofisiología. Este protocolo detalla la configuración de la cámara, electrodos y técnicas de limpieza esenciales para mediciones de canal único con alta reproducibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Por favor, visite <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">Protocolos Springer</a> para obtener más información sobre la preparación de bicapas artificiales y el uso de canales de gramicidina para probar la elasticidad de la membrana.

Los autores no tienen nada que revelar.

preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Bicapas planas de lípidos, también llamado bicapas lipídicas artificiales, permiten estudiar la realización de canales de iones en un medio ambiente bien definidos. Estas bicapas se puede utilizar para diferentes estudios, tales como la caracterización de la membrana de péptidos activos, la reconstitución de los canales iónicos o investigaciones sobre cómo los cambios en las propiedades de bicapa lipídica alterar la función de doble capa, que abarca los canales. Aquí, se muestra cómo se forma una capa doble plano y la forma de aislar pequeñas zonas de la bicapa, y en un segundo vídeo también demuestra un procedimiento para el uso de canales de gramicidina para determinar cambios en las propiedades elásticas de dos capas de lípidos. También demostramos los distintos pasos necesarios para preparar la cámara de doble capa, los electrodos y la forma de probar que la bicapa es adecuado para mediciones de un solo canal.

Bicapas planas de lípidos, también llamado bicapas lipídicas artificiales, permiten estudiar la realización de canales de iones en un medio ambiente bien definidos. Este sentido, demostrar los distintos pasos necesarios para preparar la cámara de doble capa, los electrodos y la forma de probar que la bicapa es adecuado para mediciones de un solo canal.

Preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología

Las bicapas lipídicas planas, también llamadas bicapas lipídicas artificiales, permiten estudiar los canales conductores de iones en un entorno bien definido. Estas bicapas pueden ...

Hola, soy el Dr. Olaf Anderson del Departamento de Fisiología y Biofísica del Weill Cornell Medical College en la ciudad de Nueva York. Hola, soy Ruchi Kaur, estudiante de MD PhD en el laboratorio del Dr. Olaf Anderson. Hola, mi nombre es John Kim.Soy técnico de investigación. Hoy les mostraremos cómo prepararse para experimentos con canales individuales en bicapas lipídicas simples. Les mostraremos cómo preparar la cámara y cómo preparar los electrodos para el método Bilayer Punch.Utilizamos para aislar las pequeñas áreas de membrana donde realizamos las mediciones. Así que comencemos. Nuestra configuración electrofisiológica consiste en lo siguiente: una mesa antivibración suspendida en el aire para minimizar las vibraciones mecánicas, una jaula de Faraday para proteger contra el ruido eléctrico, sonido y vibraciones, y un soporte.Para la cámara de bicapa, utilizamos una chaqueta de agua circulante para el control de temperatura en la que se coloca la cámara de bicapa y un micromanipulador para montar el cabezal del amplificador de parche. Se utiliza una unidad de filtro electrónico para filtrar aún más la salida del amplificador de parche a 500 hercios. Para visualizar las transiciones de corriente, se emplea un osciloscopio para mostrar la señal de corriente, tanto la salida del amplificador de parche como la del filtro electrónico.Por último, pero no menos importante, necesitará una computadora con un sistema de adquisición de datos que digitalice la señal del parche. A 20 kilohercios, utilizamos un software desarrollado internamente para la grabación y el análisis de datos. Todo el equipo se enciende 20 minutos antes de comenzar.A continuación, prepararemos la cámara donde se realizan los experimentos. La cámara está dividida en dos mitades mediante un septo, que consiste en una lámina delgada de teflón, de aproximadamente 100 micrones de espesor, y rellena con una solución electrolítica. Formamos la bicapa a través del orificio en el septo, lo que permite la conexión entre las soluciones electrolíticas.El orificio debe tener un diámetro de uno a 1.5 milímetros utilizando vaselina como sellador. Coloque una ventana de vidrio en la mitad frontal de la cámara de teflón, pase tornillos de acero inoxidable a través de un soporte metálico y los cuatro orificios en la mitad trasera de la cámara. Utilizando vaselina como sellador, coloque una partición circular de teflón de manera que quede atrapada entre las dos mitades de la cámara ensamblada.Asegúrese de que el orificio en la partición esté centrado. Aplique vaselina en ambos lados de la partición para garantizar que los compartimentos del electrolito sean herméticos al agua y estén aislados eléctricamente. Continúe enroscando los tornillos a través de la mitad frontal de la cámara y el soporte metálico frontal.Ajuste el ensamblaje para asegurar que todos los componentes se mantengan firmemente en su lugar, pero sin apretar demasiado, con el fin de poder limpiar la cámara y eliminar la vaselina. Una pipeta de pastoreo se calienta a fuego, se pulen y se dobla en ángulo recto. Calentarla a fuego. Pulir la pipeta hasta obtener una punta suave ayuda a evitar rayar el vidrio o el teflón.A continuación, limpie la cámara con una mezcla de dos a uno de cloroformo y metanol o solución fch. Utilizando la pipeta, retire el exceso de vaselina con la solución fch sin esparcirla por todo el teflón y el vidrio. Utilice al menos 10 volúmenes de fch.Una vez hecho esto, se añaden barras de agitación magnética a las cámaras. Luego se limpia la cámara con etanol al 95 %. Y finalmente con agua de alta pureza, ya sea agua destilada, agua UE o un equivalente.Como antes, utilice una pipeta de pasteur con la punta pulida al fuego para aspirar el líquido. Finalmente, repita la limpieza con etanol FCH y agua. Luego agua, etanol y fol.Ahora fabricaremos la micropipeta de electrodo de vidrio, que servirá como conexión eléctrica al compartimento posterior de la cámara. Utilizando un micropipeteador P-97 Flaming/Brown Polar de Sutter Instruments, se tira de la capilaridad de vidrio para obtener dos micropipetas, cada una con una punta afilada y corta. Utilizamos capilares hechos de vidrio de borosilicato con un diámetro externo de 0,8 milímetros y un diámetro interno de 0,5 milímetros. Se coloca una capilaridad de vidrio en el polar y se sujeta en preparación para tirar del filamento.El polar debe estar hecho de platino, ya que no hemos tenido éxito al tirar de las pipetas en polares de electrodo con filamentos de tungsteno; los siguientes pasos se realizarán en una microherrería con un filamento de platino. Antes de usar la microherrería, debe asegurarse de que el filamento esté bien recubierto de vidrio.Puede utilizar ya sea un vidrio de cal sodada blando o un vidrio de borosilicato duro. Deberá ajustar el calor de su microhorno para que el vidrio fluya uniformemente y cubra el filamento con una capa delgada y homogénea. Ahora monte la micropipeta en el microhorno y rompa la punta.Lo hacemos suavizando ligeramente el recubrimiento de vidrio del filamento con una temperatura relativamente baja. Luego, mueva suavemente la punta de la micropipeta hacia el recubrimiento de vidrio del filamento para que ambos se fundan; a continuación, apague el calor del filamento, que se retrae y provoca que la pipeta se rompa. Ahora queda una abertura afilada y uniforme de aproximadamente 30 micrones de diámetro.Nuevamente, utilizando el microfusor, cree una curva en ángulo recto en la micropipeta a tres o cuatro milímetros de la punta, coloque la pipeta a unas pocas centenas de micrones por encima del filamento y luego encienda el calor hasta que el filamento se vuelva rojo. El filamento se moverá debido a la expansión térmica. Luego, baje suavemente la pipeta sobre el filamento y este se doblará.Usted controla la cantidad de curvatura mediante el calor del filamento. Cuando la curvatura es de aproximadamente 80 grados, mueve rápidamente la pipeta hacia arriba y hacia adelante. Esto requiere cierta coordinación.Desea obtener una curvatura de 90 grados utilizando la misma configuración. Pule con llama la punta de la micropipeta, manteniendo el filamento recubierto con vidrio. Ahora silanizamos la punta de la pipeta con una solución al 10% de trioctil silano en benceno.Esto hace que la superficie de la pipeta sea hidrofóbica para que interactúe adecuadamente con la membrana. Permita que la solución ascienda unos pocos milímetros dentro de la pipeta por acción capilar. Evapore el sánal utilizando el microsoplete a baja temperatura y habrá terminado.Ahora le mostraremos cómo preparar el electrodo de plata. Tome un trozo de alambre de plata de cinco centímetros de longitud y aproximadamente un milímetro de diámetro. Enróllelo de tres a cuatro veces formando una bobina con un diámetro interno de dos a tres milímetros.Mantenga el resto como una cola que se doblará de manera que forme un ángulo recto con la hélice. Recubra la cola y los cinco a diez milímetros adyacentes del alambre de plata con cloruro de plata fundido. Ahora prepare la solución formadora de bicapa.En nuestro caso, el lípido dial fosfatidilcolina en decano final. El lípido se almacena en tubos de vidrio a menos 40 grados Celsius como alícuotas de 150 microlitros de lípido y cloroformo. Tome un tubo de vidrio del congelador, déjelo llegar a temperatura ambiente y evapore el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno seco.En una campana química, agregue 50 microlitros de decano final y vortexee. Para lograr un buen contacto entre la solución formadora de bicapa y el teflón que rodea el orificio sobre el cual formamos la bicapa, repintamos la partición de teflón alrededor del orificio. Primero, limpie una pipeta Pasteur pulida con llama con fch.Luego, sumerja la pipeta limpia en una solución de 2,5 % de fosfolípido en decano final, permitiendo que el lípido ascienda aproximadamente un milímetro dentro de la pipeta. Deposite una gota de lípido como una película sobre el orificio en la partición de teflón. Deje secar el lípido durante unos 10 a 15 minutos y repita.Hoy les hemos mostrado cómo preparar bicapas lipídicas para experimentos de canales individuales. En el video adjunto, les mostraremos cómo aislar pequeños parches de membrana, cómo registrar la actividad de canales individuales, cómo modificar la actividad con moléculas pequeñas y cómo analizar los resultados. Bien, eso es todo.Gracias por ver el video. Buena suerte con su experimento.

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Función de la membrana de proteínas está regulada por la composición lipídica de la membrana celular. Este artículo detalla cómo video-para formar un parche a través de electrodos de dos capas de parches, así como el uso de canales de gramicidina como reporteros de propiedades de la membrana alterado.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

Canales mechanosensitive bacterianas se pueden utilizar como transductores mechanoelectrical en dispositivos biomoleculares. Bicapas Gotita de interfaz (DIB), bloques de construcción de células de inspiración a este tipo de dispositivos, representan nuevas plataformas para incorporar y estimular canales mechanosensitive. Aquí, demostramos un nuevo método basado en la micropipeta de formar DIB, lo que permite el estudio de los canales mechanosensitive bajo estimulación mecánica.

Multifuncional, Micropipeta basada en el Método de Incorporación y la estimulación de Canales bacteriana mechanosensitive Ion en Gotita de interfaz Bilayers

Demostramos un sistema almacenable, transportable lípidos formación de bicapa. Una membrana de bicapa lipídica se puede formar dentro de 1 h con tasa de éxito más del 80% cuando un precursor de membrana congelada se llevó a temperatura ambiente. Este sistema reducirá los procesos laboriosos y conocimientos asociados a los canales iónicos.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.

Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas

Suave, de baja potencia, biomolecular memristores aprovechan similar composición, estructura y cambio de mecanismos de bio-sinapsis. Presentamos un protocolo de arme y caracterizar biomoléculas memristores procede de bicapas de lípidos entre las gotas de agua en el aceite de aislamiento. La incorporación de resultados de péptidos activados por voltaje alamethicin en memristive de conductancia iónica a través de la membrana.

Montaje y caracterización de memristores Biomolecular consisten en membranas lipídicas dopado canal iónico

Este protocolo detalla el uso de un sistema de calentamiento de temperatura controlada de retroalimentación para promover el ensamblaje de monocapas lipídicas y la formación de bicapas de interfaz de gotitas para lípidos con temperaturas de fusión elevadas, y mediciones de capacitancia para caracterizar los cambios impulsados por la temperatura en la membrana.

Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Se presenta un protocolo experimental para ensamblar, estimular eléctricamente y analizar bicapas de interfaz de gotas dopadas con gramicidina A. Las relaciones estructura-función lipídio-proteína se cuantifican midiendo cambios en el área de membrana, el flujo iónico y la conductancia de canal único, y relacionando estas respuestas con cambios similares a la plasticidad en la conducción iónica en un modelo de membrana inspirado en sinapsis eléctricas.

Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

Aprenda a preparar bicapas lipídicas planas para estudios de canales iónicos en electrofisiología. Este protocolo detalla la configuración de la cámara, electrodos y técnicas de limpieza esenciales para mediciones de canal único con alta reproducibilidad.

Preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología

Explorar más videos