Biodistribución de nanotransportadores de fármacos: Aplicaciones del MEB

Las nanopartículas metálicas y magnéticas se están utilizando ampliamente como nanoportadores para la administración de fármacos. Y su biodistribución en los tejidos es esencial para evaluar su eficacia terapéutica y seguridad. Los nanoportadores son partículas submicrónicas, generalmente limitadas a menos de 200 nanómetros, que pueden cargarse con agentes terapéuticos. Debido a su tamaño, son capaces de acceder a muchos sitios y órganos del cuerpo. El lugar donde terminan las partículas en el cuerpo, llamado biodistribución, es un parámetro importante que se utiliza para evaluar la seguridad, optimizar la dosis y mejorar la orientación de los fármacos.

En este vídeo se describirán los principios básicos de la administración dirigida de fármacos y se demostrará un método para evaluar la biodistribución mediante técnicas de imagen de alta resolución. También se discutirán otras aplicaciones de los portadores basados en nanopartículas.

Comencemos discutiendo los fundamentos de las nanopartículas y entendamos por qué se están desarrollando como portadoras de fármacos.

En primer lugar, las partículas a nanoescala, que pueden ser poliméricas, liposomales o metálicas, suelen ser biocompatibles, lo que significa que no son dañinas ni reactivas al tejido vivo y no provocan una respuesta inmunitaria. Sin embargo, se deben realizar estudios de nanotoxicología para comprender cómo los materiales y el tamaño de las partículas afectan la biodistribución en el cuerpo.

En segundo lugar, su pequeño tamaño permite su extravasación a través del endotelio en sitios inflamatorios, como en los tumores, y da como resultado una absorción celular eficiente. A medida que las células cancerosas se dividen, se necesita un suministro vascular para suministrar nutrientes y oxígeno y apoyar el crecimiento tumoral. Estos vasos sanguíneos se forman rápidamente y, por lo tanto, suelen ser anormales y efectivos, ya que contienen grandes espacios en su revestimiento endotelial, lo que resulta en una vasculatura permeable y un aumento de la permeabilidad. Las nanopartículas son capaces de escapar del torrente sanguíneo y acumularse dentro del microambiente tumoral. Esto se denomina focalización pasiva, en la que el nanoportador llega al órgano diana a través de un fenómeno conocido como efecto EPR o el efecto de permeabilidad y retención mejorados.

Por último, estas nanopartículas tienen una gran superficie que puede ser funcionalizada con ligandos específicos como anticuerpos o proteínas. En la diana activa, estos ligandos pueden reconocer y unirse a los receptores que están sobreexpresados por las células en el sitio del tumor. Las interacciones específicas entre los ligandos en la superficie del nanotransportador y los receptores celulares desencadenan la endocitosis mediada por receptores y facilitan la absorción celular.

Ahora que entendemos los conceptos básicos de la administración de fármacos con nanopartículas, veamos una demostración que utiliza imágenes de alta resolución para determinar la biodistribución de nanopartículas metálicas en un modelo de ratón.

Primero, prepare las nanopartículas que se inyectarán en el ratón. Aquí se utilizaron partículas de bario y titanio de 30 nanómetros. Después de que el ratón haya sido anestesiado, inyecte las nanopartículas por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Permita que el ratón se recupere mientras se dirige pasivamente a los órganos durante una, cuatro y ocho semanas.

En el momento adecuado posterior a la inyección, eutanasiar humanamente a los ratones de acuerdo con las directrices de la AVMA. A continuación, abra la cavidad corporal y extirpe quirúrgicamente los órganos de interés, como el bazo, el riñón, el hígado y los pulmones. Y almacene los órganos en formol tamponado con fosfato al 10% hasta el análisis.

Ahora use pinzas para transferir el tejido del ratón del fijador a solución salina tamponada con fosfato. Meca la muestra durante 30 minutos, reemplazando el PBS cada 10 minutos para eliminar el exceso de fijador. A continuación, retire el pañuelo de papel de la coctelera. Agregue un compuesto de temperatura de corte óptima que contiene glicoles y resinas solubles en agua a un molde de plástico etiquetado.

Seque el pañuelo con una toallita Kimwipe y luego colóquelo en el molde de plástico. Llene el molde con compuesto OCT cubriendo el pañuelo y colóquelo en una bolsa de plástico. Coloque la bolsa en un balde que contenga hielo seco y muévala a un congelador a menos 80 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, retire la muestra del congelador y colóquela en hielo seco mientras la transporta al criostato. Ajuste la temperatura de la cámara a menos 23 grados y luego transfiera la muestra al criostato. Etiquete los portaobjetos con el tipo de órgano y el tamaño de nanopartícula de la muestra que va a cortar. A continuación, active el criostato. A continuación, cubra el mandril de criostato con OCT. A continuación, retire la muestra del molde y colóquela encima del mandril. Monte el mandril en el portamuestras y oriéntelo y ajústelo para que la cuchilla corte directamente a través de la muestra congelada. Ahora acerque la muestra a la hoja y ajuste el grosor a 30 micrómetros para un refrentado rugoso. Gire el volante para cortar secciones de 30 micrómetros de grosor y continúe seccionando hasta que se corte una rebanada de tejido uniforme. Para un revestimiento fino, ajuste el grosor de la sección a siete u ocho micrómetros y corte la muestra.

Recoja las secciones presionando un portaobjetos de vidrio etiquetado en la rebanada. A continuación, añada los portaobjetos a la rejilla y séquelos al aire a temperatura ambiente. Una vez seco, sumerja repetidamente la rejilla de portaobjetos en etanol al 50% durante tres minutos para eliminar la OCT. Transfiera la rejilla a etanol al 80% y sumérjala durante tres minutos. Luego, mueva la rejilla a una proporción de uno a uno de metanol frío a acetona y colóquela en un congelador a menos 20 grados centígrados. Después de 10 minutos, retire la rejilla deslizante del congelador y escúrrala sobre una toalla de papel. Cuando estén secos, coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos y guárdelos a menos 20 grados centígrados hasta su uso.

Ahora imaginemos tejido pulmonar de ratón que se recolectó una semana después de la inyección con partículas de bario y titanio de 30 nanómetros para determinar su biodistribución. Para empezar, primero monta una diapositiva preparada en la platina SEM. Para aprender a recubrir y preparar su muestra, vea el video anterior de esta colección. A continuación, cargue la platina en la cámara SEM. Una vez que la muestra esté en el campo de visión, muévala verticalmente a una distancia de trabajo de aproximadamente cinco milímetros. Encienda el haz de electrones y seleccione el detector de electrones secundarios. A continuación, ajuste el voltaje de aceleración del haz a 25 kiloelectronvoltios. Para comenzar a obtener imágenes, amplíe la muestra a un aumento de aproximadamente 1.000 a 2.000X. Con este aumento, la estructura que contiene las nanopartículas debería ser visible, aunque las nanopartículas no lo sean. A esto se le llama imagen secundaria.

Ahora active el modo de detección de electrones de retrodispersión en el módulo SEM para visualizar las nanopartículas. Mueva la platina en la dirección Z para alcanzar la misma distancia de trabajo de cinco milímetros utilizada anteriormente. Ajuste la configuración del detector de retrodispersión y utilice diferentes polarizaciones de voltaje para los paneles de detección hasta que la imagen sea nítida. Las regiones de alto contraste, las nanopartículas, deberían ser ahora visibles. Esta es la imagen retrodispersada. Capture y guarde la imagen.

A continuación, obtenga datos de espectroscopia de rayos X de dispersión de energía o EDS de la muestra. Acérquese al área de alto contraste de un grupo de nanopartículas. A continuación, abra la segunda cámara de la cámara y baje el EDS en el sistema. Observe la pantalla de la cámara para asegurarse de que el EDS se acerca, pero no toca el BSD o el cañón de electrones. A continuación, abra el software de microanálisis y adquiera una imagen. Utilice el ratón para seleccionar una región de interés para un análisis más detallado. A continuación, se muestra un espectro de rayos X para esa área. Aquí, los picos representan bario y titanio, lo que confirma la presencia de nanopartículas metálicas en la muestra. Ahora abra el software de análisis de datos cualitativos y mapee los bordes del órgano en la diapositiva. A continuación, seleccione y ejecute el protocolo apropiado en el menú para crear una imagen de mosaico del órgano. Esto puede tardar varias horas.

Una vez completado, expórtelo como un archivo TIF y abra el archivo en ImageJ. Ajuste los valores del umbral de contraste para resaltar las áreas de muy alto contraste, las nanopartículas. A continuación, seleccione Analizar partículas para obtener el número medio de nanopartículas en el órgano y el porcentaje de área del órgano que contiene nanopartículas.

Repita todos los pasos de este procedimiento para las muestras de tejido restantes de otros puntos de tiempo y órganos. Una vez que se hayan recopilado todos los datos, compílelos en un gráfico de biodistribución.

Ahora analicemos las imágenes para determinar la biodistribución y aprender cómo el cuerpo procesó las nanopartículas. En primer lugar, trace la distribución de partículas medidas en función del tiempo para todas las muestras analizadas. Se trata de la distribución de nanopartículas de 30 nanómetros en varios órganos de ratón a lo largo del tiempo. Hay una disminución general de las nanopartículas después de ocho semanas, lo que indica la eliminación de la nanopartícula del cuerpo.

Sin embargo, hay un aumento de la concentración de nanopartículas en el hígado después de cuatro semanas. Esto sugiere que el cuerpo puede estar procesando las nanopartículas de bario y titanio de 30 nanómetros utilizadas en este estudio como una toxina. Este análisis también se puede realizar para evaluar cómo el tamaño de la nanopartícula afecta su biodistribución en el cuerpo. El cambio en el tamaño de las nanopartículas afectó la tasa de absorción celular general y la tasa de eliminación.

Las nanopartículas y los nanoportadores se utilizan ampliamente en la investigación biomédica y tienen aplicaciones como agentes de imagen, diagnóstico y terapéuticos. Las nanopartículas se están desarrollando para su uso en la administración de vacunas contra una amplia variedad de enfermedades infecciosas porque protegen los componentes de la vacuna de la degradación y maximizan la estimulación inmunitaria. Se están desarrollando vesículas multilaminares reticuladas entre bicapas, o ICMV, para la inducción de respuestas de células T CD8 positivas específicas del antígeno.

Estos ICMV se localizan específicamente en los ganglios linfáticos de los ratones para una administración eficiente de la vacuna y han provocado respuestas inmunitarias sólidas contra los antígenos de la malaria y las células tumorales. Las nanopartículas metálicas se utilizan a menudo como agentes de contraste en la resonancia magnética para visualizar la estructura y la función de los tejidos para la detección temprana de enfermedades. Las nanopartículas de óxido de hierro son sondas diagnósticas útiles. Cuando se sintetizan con un resto de bifosfonatos, estas nanopartículas se acumulan rápida y selectivamente en placas ateroscleróticas y permiten su visualización en una hora para un diagnóstico rápido.

Recientemente, se han desarrollado nanoportadores cargados como estrategia para detectar simultáneamente el cáncer en etapa temprana y administrar agentes quimioterapéuticos. Estos nanoportadores se denominan teranósticos porque integran capacidades diagnósticas y terapéuticas.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la determinación de la biodistribución de los portadores de nanofármacos. Ahora debería conocer los principios básicos de los portadores de nanofármacos, cómo detectar nanoportadores en muestras de tejido utilizando SEM de alta resolución y determinar su biodistribución, y algunas aplicaciones de las nanopartículas en ingeniería biomédica.

Gracias por mirar.