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La microscopía es un método ampliamente utilizado para obtener imágenes de la estructura detallada de las muestras. Los microscopios ópticos, que enfocan la luz a través de una serie de lentes para ampliar las muestras, han estado en uso durante siglos, y el primer microscopio compuesto apareció en el siglo XVII. Durante ese tiempo, Antonie van Leeuwenhoek fue el primero en observar bacterias, levaduras, glóbulos rojos y la circulación en los vasos capilares, haciendo importantes contribuciones científicas y allanando el camino para avances microscópicos.
Los microscopios ópticos siguen siendo ampliamente utilizados hoy en día en entornos clínicos y de investigación para el diagnóstico médico. Sin embargo, en los últimos 60 años, ha surgido la microscopía confocal que ilumina la muestra a través de un orificio para aumentar la resolución óptica y el contraste.
Este video ilustrará los principios operativos de la microscopía óptica y confocal, demostrará cómo se analizan las imágenes de alta resolución y discutirá varias aplicaciones de la microscopía en el campo de la ingeniería biomédica.
Comencemos discutiendo los fundamentos de la microscopía confocal. La microscopía óptica se basa en el principio de enfocar la luz en una muestra para obtener imágenes de su estructura detallada. Un microscopio está formado por dos componentes de aumento; la lente del objetivo, que enfoca una imagen real de un objeto, y el ocular, que enfoca una imagen virtual ampliada antes de que sea recibida por el ojo. El aumento total se obtiene multiplicando los aumentos de estas dos lentes.
El enfoque de la luz proporciona un plano de enfoque específico en el que el aumento y la luz de la lámpara se encuentran en el mismo punto, lo que proporciona la mejor resolución de la imagen. Cuando está fuera del plano focal, el área de iluminación es mayor y los haces de luz interfieren desde otras partes de la muestra, lo que hace que la imagen sea borrosa. Mientras que los microscopios ópticos iluminan y obtienen imágenes de toda la muestra a la vista, un microscopio confocal utiliza un orificio entre la etapa de la muestra y el detector para que solo se enfoque un pequeño haz de luz a una profundidad estrecha a la vez.
En consecuencia, la única área visible de la muestra es el punto de enfoque, lo que proporciona una imagen bien resuelta. Sin embargo, con una resolución más alta, solo se obtiene una imagen de una pequeña parte de esta muestra a la vez. Al mover la muestra en el plano X-Y, se puede realizar un escaneo ráster de su superficie. Para cada punto del escaneo, el enfoque se optimiza ajustando la altura Z para acceder a diferentes planos focales. Esto garantiza una resolución máxima punto por punto de la muestra de imagen.
Ahora usemos estos principios de microscopía y resolución de imagen para obtener imágenes del cerebro de un ratón usando un microscopio confocal y óptico.
Después de haber revisado los principios fundamentales de la microscopía, ahora realicemos una medición utilizando un microscopio confocal. Primero, encienda el microscopio en la estación de trabajo de la computadora. A continuación, cargue la muestra en la platina y céntrela debajo de la lente. Ahora abra el software de imágenes y seleccione crear nuevo trabajo. Vaya a la columna de topografía y elija el botón asistente. Seleccione el aumento más bajo, que para este microscopio es de 2,5x. A continuación, utilice el manipulador de microscopio 3D para ajustar la posición Z de la muestra y enfocar la muestra. Presione el botón en el costado para que aparezca una luz azul alrededor de los bordes. Esto permite un movimiento y un enfoque Z más finos. Ahora capture una imagen general.
Aumente lentamente el aumento de la lente y ajuste la intensidad de la luz y el enfoque para obtener el aumento deseado. Utilice el manipulador 3D en las direcciones X e Y para seleccionar diferentes áreas de interés en la muestra. Una vez que se toma una imagen con un aumento bajo, presione siguiente para tomar un punto de referencia. Utilice el punto de referencia predeterminado o especifique uno nuevo en la esquina de la muestra y, a continuación, pulse siguiente. Ahora cambie gradualmente el objetivo a la resolución deseada para la muestra. Para esta muestra, se utiliza un objetivo de 20x para visualizar las células en el tejido cerebral del ratón. Asegúrese de que haya espacio para disminuir la distancia de trabajo.
Para definir la distancia a la que se deben recoger los cortes, vaya primero a la página de definición del rango de medición y utilice el manipulador 3D para ajustar finalmente la muestra en la dirección Z. Haga clic en establecer en último lugar cuando la parte superior de la muestra esté enfocada y haga clic en establecer primero cuando la parte inferior de la muestra esté enfocada. Asegúrese de que el número de segmentos calculados no supere los 1.000 o el programa fallará. Verifica que no haya píxeles rojos, lo que indica que la intensidad de la luz está sobresaturada.
Finalmente, presione listo para tomar la imagen de la tomografía. Cuando se abra el software de tomografía, seleccione la pestaña estudios para ver los datos en 3D y tomar medidas en 2D y 3D.
Ahora vamos a tomar una imagen usando un microscopio óptico digital. Primero, encienda el microscopio y abra el software de imágenes. A continuación, cargue la muestra en la platina y céntrela debajo de la lente. Cuando el software de imágenes esté abierto, seleccione un trabajo de la lista de plantillas o elija examen gratuito. A continuación, adquiera una imagen general que muestre todo el escenario. Utilice el controlador para cambiar el enfoque y la posición de la imagen.
Una vez completada la adquisición, coloque un sistema de coordenadas en la imagen. El sistema de coordenadas predeterminado se encuentra en el centro del escenario. Para mayor flexibilidad, las coordenadas se pueden cambiar manualmente.
A continuación, asigne un nombre a la muestra y seleccione el botón de la cámara. Presione el botón en vivo mientras navega por la muestra y mueva el enfoque hacia abajo hasta que la muestra esté claramente enfocada. Si es necesario, use la pestaña de iluminación y apertura para ajustar la iluminación. A continuación, adquiera una imagen de la muestra.
Utilice las herramientas del panel de optimización de imagen, como la inclinación de la lente, los niveles de iluminación de la muestra y el brillo y el contraste de la imagen para optimizar la imagen con la nitidez deseada. Ahora toque la herramienta lápiz para realizar mediciones. Utilice las herramientas de distancia y área para medir el tamaño de las celdas de la muestra.
Por último, vaya a la pestaña de flujo de trabajo de resultados y configure el diseño del informe. Toque el botón Guardar para guardar el trabajo y analizarlo más a fondo.
Ahora analicemos las imágenes del cerebro de un ratón que fueron tomadas con microscopios ópticos confocales y digitales. La imagen confocal con un aumento de 50x es de alta resolución y proporciona un enfoque profundo con diferentes niveles de profundidad de información.
En el mapa tomográfico, la altura de esta muestra oscila entre una y nueve micras. Características como la amplitud, el perfil de rugosidad y los parámetros de la curva se pueden analizar más a fondo. Sin embargo, se pueden obtener imágenes de todo el portaobjetos del tejido cerebral seccionado con un microscopio óptico digital.
Al acercar una sección se muestran más detalles de la muestra, pero a una resolución mucho menor que la obtenida con el microscopio confocal. Esta muestra se obtuvo con un aumento de 300x. El software dedicado ofrece herramientas para medir las dimensiones de la sección transversal, como el diámetro, así como para calcular el área interna de la sección.
La microscopía digital, óptica y confocal son herramientas estándar utilizadas en diversas aplicaciones biomédicas. La oftalmoscopia láser de barrido o SLO es una técnica de imagen no invasiva que se utiliza ampliamente en oftalmología clínica para diagnosticar y controlar el desarrollo de enfermedades de la retina.
SLO produce imágenes estereoscópicas de alto contraste que visualizan la microglía. Los macrófagos residentes de la retina, que están involucrados en varias enfermedades de la retina. La microscopía confocal también se utiliza en la obtención de imágenes de células vivas, lo que permite a los investigadores visualizar la función biológica microscópica de las células en tiempo real.
Esta técnica se utiliza para estudiar la migración y proliferación celular y la dinámica de proteínas, entre otros. Aquí, los receptores transmembrana y los lisosomas se marcaron con tintes fluorescentes y su colocalización se analizó mediante imágenes de lapso de tiempo para investigar la internalización de los receptores.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la microscopía digital, óptica y confocal. Ahora debe comprender los principios de la microscopía y la resolución de la imagen, cómo operar los microscopios ópticos y confocales para obtener imágenes de muestras biológicas y varias aplicaciones de su uso en el campo de la ingeniería biomédica.
Gracias por mirar.
