Imágenes con MEB de muestras biológicas

La microscopía electrónica de barrido, o SEM, se utiliza a menudo para obtener imágenes de materiales biológicos a escala nanométrica. Los microscopios ópticos, que utilizan la luz para obtener imágenes de una muestra, se utilizan mucho para obtener imágenes no destructivas de muestras biológicas, sin embargo, su resolución y profundidad de campo son limitadas, por lo que se utiliza SEM para lograr una resolución más alta de hasta un nanómetro.

En SEM, un haz de electrones se enfoca a través de una serie de lentes de condensador, que luego golpea la muestra. Cuando el haz golpea la muestra, los electrones en la superficie son dispersados y medidos por el detector.

En este vídeo, hablaremos de cómo funciona el SEM, demostraremos cómo obtener imágenes de una muestra biológica en el laboratorio y, por último, presentaremos algunas técnicas utilizadas para obtener imágenes de muestras sensibles.

Un microscopio electrónico de barrido utiliza un haz de electrones de alta energía, que es generado por un cañón de electrones equipado con un cátodo de filamento. Los electrones generados son impulsados hacia el ánodo y luego se enfocan usando lentes de condensador antes de ingresar a la lente del objetivo. La lente del objetivo se calibra para enfocar el haz en la muestra, donde se escanea en ráster a través de la superficie. Las interacciones de los electrones con los átomos de la muestra se utilizan para estudiar la topografía, la composición elemental y la cristalinidad de la muestra. Cuando el haz de electrones incidente golpea la superficie, emite electrones secundarios y retrodispersados. Los electrones secundarios son electrones de baja energía que se emiten desde la muestra cerca de la superficie y proporcionan información topográfica.

Los electrones retrodispersados, por otro lado, se reflejan en la dirección opuesta al haz incidente. La intensidad de la interacción aumenta con el aumento del peso atómico, lo que permite al usuario distinguir las diferencias de composición. Se necesita una consideración especial para obtener imágenes de muestras biológicas con SEM, ya que SEM utiliza un alto vacío, por lo que las muestras biológicas, que generalmente tienen un alto contenido de agua, deben secarse primero. Esto puede causar el colapso de la estructura de las muestras sensibles, especialmente las células. Por lo tanto, las células se tratan con un fijador, se enjuagan y luego se deshidratan lentamente lavándolas con cantidades crecientes de etanol.

En el caso de materiales biológicos rígidos, como el andamio tisular de colágeno-hidroxiapatita utilizado en esta demostración, la muestra se seca durante un período de varios días a alto vacío.

Finalmente, dado que las imágenes SEM típicas requieren una superficie conductora, las muestras biológicas a menudo se recubren con una capa delgada de metal antes de la obtención de imágenes. Ahora que hemos analizado cómo funciona el SEM y cómo preparar una muestra biológica para la obtención de imágenes, echemos un vistazo a cómo preparar y obtener imágenes de un andamio de tejido de colágeno-hidroxiapatita.

En primer lugar, monte la muestra de biomaterial en un trozo de SEM con cinta de carbón conductora y asegúrese de que la muestra esté seca y no tenga contaminación en la superficie.

Luego, coloque la muestra montada en la cámara de un recubridor de pulverización catódica, bombee la cámara y cubra la muestra con pulverización catódica durante unos 40 segundos para lograr una capa delgada de metal, en este caso oro, de cuatro a seis nanómetros de espesor, con una cobertura adecuada. Una vez recubierto, retire la muestra y use cinta conductora para conectar el trozo a la parte superior de la muestra, que ahora está recubierta con metal conductor.

Por último, monta el muñón en la platina SEM y aprieta el tornillo lateral. Ahora la muestra está lista para crear imágenes con SEM. Primero, cargue la etapa en la cámara SEM y selle la puerta, luego presione el botón de transferencia para abrir el paso de la cámara de carga al vacío. Una vez que la puerta interna esté abierta, atornille la varilla de metal en la etapa y empuje la muestra a la cámara de vacío, luego desenrosque la varilla de metal y retírela completamente en la cámara de carga, luego presione almacenar para cerrar la cámara de vacío.

Ahora vamos a imaginar la muestra usando SEM.

Primero, mueva la etapa usando el controlador y navegue la muestra hacia el campo de visión, luego mueva la muestra verticalmente hasta que la distancia de trabajo sea de cinco a 10 milímetros. Encienda el haz de electrones y seleccione el detector de electrones secundarios, configure el haz a cinco kiloelectronvoltios inicialmente, luego aumente hasta 20 a 30 kiloelectronvoltios según sea necesario. Si la imagen no es nítida, gire los mandos de enfoque, brillo y contraste hasta que aparezca una imagen nítida.

Utilice la navegación del escenario y las direcciones X e Y para localizar un nuevo punto en la muestra y, a continuación, aumente la ampliación hasta que las características deseadas sean visibles. Ajuste el enfoque, el contraste y el brillo según sea necesario para mejorar la calidad de la imagen. Es posible que deba disminuir la velocidad de escaneo y activar el promedio de línea para obtener una mejor imagen y, a continuación, guardar la imagen.

Las imágenes SEM revelan una estructura altamente tridimensional y porosa con características fibrosas de menos de 25 micras. Estas características serían difíciles de visualizar con microscopía óptica, ya que la microscopía óptica tiene una profundidad de campo mucho menor.

Hay muchos desafíos asociados con la obtención de imágenes de estructuras biológicas con SEM, incluido el colapso de la estructura o el daño por el haz de electrones de alta energía. Veamos ahora cómo se aplica la técnica general de SEM a este tipo de muestras sensibles. Las estructuras biológicas delicadas, como estos tejidos vegetales jóvenes, o aquellos con un alto contenido de agua, deben tratarse mediante un proceso de fijación previo a la obtención de imágenes.

Estos meristemos florales se trataron inmediatamente con una solución fijadora de formalina/ácido acético recién preparada. El tejido fijado se diseccionó en etanol, se colocó en un recipiente de malla y se deshidrató a través de una serie de etanol de 70%, 80%, 90% y 100% de etanol. Finalmente, los tejidos vegetales se secaron utilizando un secador de punto crítico, se montaron y se recubrieron con una fina capa de metal.

Después de las imágenes SEM, está claro que las estructuras no tratadas estaban muy dañadas por el proceso de secado y mostraron un colapso considerable en la estructura, mientras que las que se fijaron mantuvieron su estructura nativa. Alternativamente, las células y otras muestras con alto contenido de agua se pueden obtener imágenes utilizando SEM ambiental o ESEM. ESEM utiliza un haz de electrones de alta energía que se escanea en ráster sobre la muestra, como con el SEM convencional, sin embargo, permite la obtención de imágenes de muestras húmedas o sin recubrimiento manteniendo un ambiente gaseoso dentro de la cámara.

Esto se hace separando la cámara de alto vacío que contiene el cañón de electrones de la cámara de muestras mediante dos aberturas. El haz de electrones incurre en pérdidas significativas debido a la dispersión de las moléculas de gas, pero suele tener una energía lo suficientemente alta como para obtener imágenes. Aquí, las células se cultivaron en un chip de silicio, se funcionalizaron con puntos cuánticos y se fijaron utilizando un protocolo de fijación de glutaraldehído. Las células fueron fotografiadas en agua y muestran la estructura no colapsada de la célula con puntos cuánticos individuales visibles en la superficie de la célula.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la visualización de biomateriales mediante SEM. Ahora debería comprender cómo funciona el SEM, cómo se preparan y obtienen imágenes de las muestras biológicas, así como algunas aplicaciones de la técnica para estructuras sensibles.

¡Gracias por mirar!