Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía óptica

La inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica son métodos de tinción para una proteína de interés en células y tejidos cultivados, respectivamente. El principio básico de ambas técnicas relacionadas implica el uso de anticuerpos específicos marcados con un sistema de detección para identificar y visualizar la proteína y determinar su ubicación dentro de las células y tejidos, así como los niveles relativos. El proceso en cualquiera de los dos experimentos comienza con la preparación de la muestra.

Para la inmunocitoquímica, que visualiza específicamente las ubicaciones de proteínas o antígenos en las células, esto implica tres pasos. El primer paso es la siembra, que implica el cultivo de las células en un medio de crecimiento en un cubreobjetos o portaobjetos, por lo general, en los pocillos de una placa de cultivo. A esto le sigue la fijación, en la que se añade a las células un agente precipitante o reticulante como el paraformaldehído para preservar la integridad estructural de las proteínas y evitar que la actividad enzimática las degrade. El último paso es la permeabilización, que consiste en añadir un detergente para que las membranas celulares sean permeables para la tinción.

En el método homólogo, la inmunohistoquímica, las proteínas o los antígenos se visualizan en los tejidos y la preparación de la muestra consta de cinco pasos. En primer lugar, se somete todo el tejido a una fijación, normalmente con paraformaldehído. A esto le sigue la inclusión del tejido en un bloque de parafina, y luego el corte de este bloque utilizando una máquina llamada micrótomo para cortar el tejido en rodajas finas que se pueden colocar en portaobjetos. A continuación, los portaobjetos se someten a desparafinación, es decir, a la eliminación de la parafina alrededor del trozo de tejido. A continuación, se puede realizar un paso opcional de recuperación de antígenos. Esto se puede hacer usando calor o enzimas para desenmascarar los epítopos que se reticularon durante la fijación, haciéndolos disponibles para la unión de anticuerpos. Después de la preparación adecuada de la muestra, se añade un anticuerpo primario específico de la diana a la muestra de célula o tejido. Este anticuerpo primario debe unirse a la proteína de interés. A continuación, se añade un anticuerpo secundario, que detecta y se une al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario se conjuga o puede unirse a una enzima llamada HRP. Cuando se añade su sustrato específico, DAB, HRP lo convierte en un precipitado marrón insoluble. Esta mancha marrón marca la ubicación de la proteína objetivo. Los portaobjetos también se tiñen con hematoxilina, que etiqueta los núcleos en azul y proporciona un punto de referencia espacial para determinar la localización subcelular. Después de eso, se agrega un medio de montaje al portaobjetos, seguido de un cubreobjetos para sellar y preservar la muestra teñida. Por último, los portaobjetos se pueden visualizar con un microscopio óptico.

En este vídeo, observará la técnica de preparación de muestras para células en placa y secciones de tejido, seguida de la inmunotinción de las secciones de tejido.

En primer lugar, las celdas de interés deben estar asentadas sobre cubreobjetos. Para hacer esto, trabajando en una campana de cultivo de tejidos, coloque cubreobjetos individuales en los pocillos de una placa de 24 pocillos. A continuación, cierre la hoja y encienda la luz ultravioleta para esterilizar los cubreobjetos durante al menos 15 minutos. A continuación, apague la luz ultravioleta. Para levantar las células de interés de una placa confluente de 10 centímetros, aspire el medio, lave brevemente con PBS y agregue tripsina a las células durante 2 minutos. Luego, golpee el costado de la placa para asegurarse de que las células se hayan desprendido y neutralice la tripsina con medios. A continuación, agregue 0. 5 mL de la suspensión de la celda en cada pocillo, asegurándose de cubrir los cubreobjetos. Coloque la placa en una incubadora de CO2 humidificada y deje que las células crezcan a 37 grados centígrados hasta que tengan un 50-70% de confluente.

Una vez que las células alcancen la confluencia óptima, aspire el medio de cultivo de cada pocillo y luego fije las células incubándolas en . 5 mL de paraformaldehído al 4% diluido en 1X PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el fijador, enjuague las células agregando 1 mL de 1X PBS sobre cada cubreobjetos. Aspire inmediatamente el PBS, luego repita el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados.

Ahora, permeable las células añadiendo 0,5 mL de Triton X-100 al 0,1% en 1X PBS a cada pocillo. Deje el plato a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aspire el tampón de permeabilización y luego enjuague las células agregando 1 mL de PBS 1X en cada pocillo. Aspire inmediatamente el PBS y repita el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados. Ahora que las células de los cubreobjetos están fijadas y permeabilizadas, proceda con el procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica, con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en un portaobjetos de sección de tejido.

Para comenzar, obtenga secciones de tejido preparadas, fijadas en formol e incluidas en parafina. Desparafinar los portaobjetos colocándolos en una gradilla de portaobjetos y luego sumergiéndolos completamente en 250 mL de xileno 100%. Deje que los portaobjetos se incuben durante 5 minutos en el xileno. A continuación, retira los portaobjetos del recipiente, límpialos con una toalla de papel y colócalos en un nuevo baño de xileno en un recipiente nuevo durante 5 minutos más.

A continuación, rehidrate las secciones en una serie de soluciones de etanol graduadas comenzando con etanol al 100% durante 3 minutos. Limpie la rejilla de portaobjetos con una toalla de papel y transfiera los portaobjetos a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros 3 minutos. Continúe este ciclo de lavado, secado con una toalla de papel y transferencia de los portaobjetos a un nuevo baño después de las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final con etanol, limpie la rejilla con una toalla de papel e incube los portaobjetos en 100 ml de peróxido de hidrógeno del 0,3% durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de la peroxidasa. Lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado en un recipiente de 1X PBS fresco durante 5 minutos más.

A continuación, realice la recuperación de antígenos sumergiendo los portaobjetos en 250 ml de tampón de citrato IHC a pH 6,0 y hirviéndolos durante 20 minutos. A continuación, proceda con el protocolo de tinción.

Para comenzar el proceso de tinción para IHQ, rodee las secciones con un bolígrafo hidrofóbico para identificar el área mínima que debe cubrir el tampón. A continuación, utilice una pipeta para colocar 100 microlitros de tampón de bloqueo, que en este experimento es suero de caballo diluido en 1X PBS, sobre la sección. Incuba los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, retire el tampón de bloqueo con una pipeta.

A continuación, diluya el anticuerpo primario y el tampón bloqueante en una dilución de 1:100 añadiendo 990 microlitros de suero de caballo diluido en 1X PBS en un 1. 5 mL de tubo de Eppendorf, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario. Agregue 100 microlitros del anticuerpo primario diluido a cada sección e incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando suene el temporizador, drene el anticuerpo primario de cada portaobjetos y luego lávelos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado una vez más con 1X PBS fresco.

Mientras los portaobjetos se lavan en 1X PBS, diluya el anticuerpo secundario a una dilución de 1:200 agregando 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 mL seguido de 5 microlitros del anticuerpo secundario, que en este caso es IGG anti-ratón de caballo biotinilado. Agregue 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada sección y luego incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire el anticuerpo secundario drenándolo de las secciones, luego lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado con 1X PBS fresco.

Ahora, agregue 100 microlitros de reactivo del complejo avidina-biotina e incube las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos sumergiéndolos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. De manera similar a los pasos de lavado anteriores, repita este lavado una vez más con 1X PBS nuevo. A continuación, revele los portaobjetos incubando las secciones en 100 microlitros de DAB durante un máximo de 5 minutos. Detenga el desarrollo sumergiendo las secciones en 250 mL de agua destilada durante 5 minutos.

Ahora, las diapositivas se pueden contrateñir, si se desea. Para hacer esto, sumerja brevemente los portaobjetos en 250 ml de solución de hematoxilina de Harris. Enjuague la contramancha lavando los portaobjetos en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos. Repita este lavado 1 vez más con agua destilada fresca. A continuación, deshidrata las secciones. Para hacer esto, primero incube los portaobjetos en etanol al 95% durante 5 minutos. Seque los portaobjetos en una toalla de papel y transfiéralos a un nuevo recipiente de etanol fresco al 95% durante otros 5 minutos. Continúe el ciclo de lavado, secando con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un nuevo baño, siguiendo las soluciones indicadas durante 5 minutos cada uno.

Después de la incubación final, seque los portaobjetos con una toalla de papel, luego agregue una gota de medio de montaje, como Organo-Limonene Mount, a los portaobjetos. Ahora, coloque un cubreobjetos sobre las secciones, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire. Los portaobjetos ya están listos para ser observados bajo un microscopio para su análisis.

Para observar las secciones manchadas, use un microscopio óptico estándar para visualizar la mancha y una cámara digital para capturar la imagen. En este ejemplo particular de IHQ, se comparan tejidos de bazo de tipo salvaje y ratones espontáneos, doblemente transgénicos o DTG, para estudiar la expresión de Dyclin D1 en el linfoma. Los tejidos se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con el anticuerpo anticiclina D1, y se obtuvieron imágenes con un aumento de 20X. Las células que expresan ciclina D1 se indican por el color marrón rojizo sobre el fondo de tejido azul. Al comparar las intensidades de tinción entre las imágenes de los distintos ratones, los bazos no agrandados tienen cantidades relativamente bajas de expresión de ciclina D1, independientemente del genotipo del ratón. Por el contrario, el bazo agrandado del ratón DTG muestra un aumento de la tinción marrón rojiza que indica una correlación entre el desarrollo de cáncer y la expresión de ciclina D1 en este modelo de ratón.