Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía óptica

1. Preparación de células para la inmunocitoquímica

1. Células de semilla de interés sobre diapositivas con cámara o cubredes con cámara añadiendo 0,5 ml de suspensión celular a los pozos de una placa de cultivo de 24 pozos.
   Nota: Algunas células pueden requerir crecimiento en los labios de cubiertatratada, como los cubreobjetos tratados con polilisina. Las condiciones óptimas de tratamiento deben ser determinadas por el usuario dependiendo del tipo de célula que se esté utilizando.
2. Coloque la placa en una incubadora de CO₂ humidificada y permita que las células crezcan a 37oC hasta un 50-70% de confluente.
3. Una vez que las células alcancen una confluencia óptima, retire los medios de cultivo de cada poca y luego, fije las células incubando en 0,5 ml de 4% de PFA (diluido en 1X PBS) e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire el fijador y lave los pozos tres veces con 1 ml de 1X PBS.
5. A continuación, permeabilizar las células agregando 0.5 mL de 0.1% Triton-X-100 en 1X PBS a cada pozo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
6. Aspirar fuera del tampón de permeabilización y lavar los pozos tres veces con 1 mL de 1X PBS.
7. Las células en los labios de cubierta ahora están fijas y permeabilizadas. Proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica, con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en un portaobjetos de sección de tejido.

2. Preparación de secciones de formalina fija, incrustadas en parafina para la tinción

1. Obtenga secciones de tejido sinua inadtemis preparadas y fijas en la formalina.

Desparaffinización

2. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.

Rehidratación

3. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 3 min cada una.
4. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% durante 3 min.
5. Sumerja las diapositivas en 70% de etanol durante 3 min.
6. Sumerja las diapositivas en 50% de etanol durante 3 min.

Bloqueo de la actividad endógena de la peroxidasa

7. Incubar los portaobjetos en 100 ml de 0,3% H₂O₂ durante 30 min a temperatura ambiente.
8. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.

Recuperación de antígenos

9. Sumerja las diapositivas en el tampón de citrato IHC (pH 6) y herértelas durante 20 minutos.
10. Las diapositivas de tejido ya están listas para la tinción.

3. Preparación de secciones de inmovilización fresca, OTC para la tinción

1. Coloque 5 mm de tejido aislado fresco en un molde y agregue OCT hasta que la sección esté completamente cubierta.
2. Sumerja lentamente el bloque de tejido en nitrógeno líquido hasta que se congele por completo. La muestra ahora se puede almacenar a -80 oC durante un máximo de 1 año.
3. Una vez listo para el seccionamiento, transfiera el bloque de tejido congelado a un criostato y permita que toda la configuración llegue a -20 oC.
4. Corte secciones de tejido grueso de 5-10 m con un criostato y use un cepillo para colocar secciones directamente en diapositivas de vidrio compatibles con IHC.
5. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Las diapositivas también se pueden almacenar a -80 oC.
6. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar los portaobjetos antes de la tinción. El método de fijación óptimo debe ser determinado por el usuario.
7. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
8. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 0,3% H₂O₂ para 30 min a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa.
9. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
10. Las diapositivas ya están listas para la tinción.

4. Tinción

1. Círculo del tejido con una barrera hidrófoba usando una pluma de barrera.

Bloqueo

2. Usando una pipeta, coloque 100 l de tampón de bloqueo (suero de caballo diluido en 1X PBS) - sobre la sección durante 1 hora a temperatura ambiente.
3. Retire el tampón de bloqueo con una pipeta.

Incubación de anticuerpos primarios

4. Incubar el tejido rodeado con una solución de anticuerpos primarios diluido de 100 l (ciclina antihumana de ratón D1 diluida 1:100 en tampón de bloqueo) durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Escurrir el anticuerpo primario de cada portaobjetos y lavar los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 minutos cada uno.

Incubación Secundaria de Anticuerpos

6. Incubar la muestra con 100 ml de anticuerpo secundario biotinilado diluido (IgG antiratón de caballo biotinilado diluido 1:200) durante 30 min a temperatura ambiente.
7. Retire el anticuerpo secundario drenando las secciones y lávelo con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.

Desarrollo del color

8. Visualización mediante HRP: Añadir 100 ml de reactivo complejo de avidina-biotina (ABC) e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente
   Nota: Los anticuerpos con etiquetas fluorescentes también se pueden utilizar y visualizar con un microscopio adecuado.
9. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.
10. Desarrollar las diapositivas incubando las secciones en 100 s de DAB durante un máximo de 5 min.
11. Detenga el desarrollo añadiendo agua destilada (dH₂O) durante 5 min a temperatura ambiente.

Contramanchación (si se desea)

12. Sumerja las diapositivas brevemente en Harris Hematoxylin Solution (o 0.5% de verde metilo en 0.1M de acetato de sodio (pH 4.2)) durante 10 min.
13. Enjuague la contramancha lavando los portaobjetos en dH₂O dos veces durante 5 min cada uno.

Deshidratación

14. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% 2 veces durante 5 min cada una.
15. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 5 min cada una.
16. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.
17. Sopla reline las diapositivas con una toalla de papel.

Aplicación de montaje y cubreobjetos

18. Agregue una gota de soporte de montaje como Organo-Limoneene Mount a las diapositivas y coloque una tapa sobre las secciones.

Análisis microscópico

19. Observe las secciones manchadas bajo un microscopio apropiado para el análisis. Aquí se utilizó un microscopio de luz estándar para la observación y se utilizó una cámara digital montada para la toma de imágenes.