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La transferencia celular adoptiva es un método para introducir células de interés en un organismo. Es una técnica poderosa para estudiar varios mecanismos biológicos, incluida la acción de clases específicas de células inmunitarias. Además, la transferencia adoptiva es un tratamiento novedoso y prometedor para numerosas afecciones, como las que requieren trasplantes de médula ósea o tratamientos contra el cáncer en los que se pueden extraer las propias células T del paciente, modificarlas para reconocer y destruir las células cancerosas y luego devolverlas al cuerpo para combatir los tumores.
En el laboratorio, los modelos animales se utilizan a menudo para estudiar la transferencia adoptiva. Por ejemplo, los ratones knockout CD45.1 Rag gamma-c carecen de receptores fundamentales para muchas citocinas, que son esenciales para la diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas en linfocitos. Como resultado, los ratones knockout tienen un desarrollo de linfocitos comprometido y no tienen células asesinas naturales, o NK, células T o células B.
La transferencia adoptiva se puede utilizar para introducir las células inmunitarias faltantes en estos ratones comprometidos, recolectando primero tejido de ratón donante que contenga altas concentraciones de células inmunitarias, como el bazo. A continuación, el tejido se disocia y se aísla una variedad de células del bazo, incluidas las células inmunitarias. A continuación, los eritrocitos no deseados, o glóbulos rojos, se pueden lisar mediante la adición de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio y los glóbulos blancos restantes, o esplenocitos, se separan de los restos celulares mediante centrifugación.
Finalmente, los esplenocitos purificados se inyectan en los ratones inmunocomprometidos, lo que facilita estudios detallados de las funciones de estas células. Varios días después, el éxito de la transferencia adoptiva de células inmunitarias puede confirmarse aislando y preparando primero los esplenoncitos del huésped de la misma manera que el tejido del donante. A continuación, estas células se tiñen utilizando anticuerpos marcados contra los marcadores de células inmunitarias del donante para que puedan verificarse y clasificarse mediante FACS.
Para empezar, póngase guantes de laboratorio y el equipo de protección adecuado. A continuación, lave un par de pinzas y unas tijeras de disección primero con un detergente y luego con etanol al 70% y luego séquelas con una toalla de papel limpia. Prepare 50 mililitros de la Solución Salina Equilibrada de Hank's, o HBSS, con un 2% de Suero Fetal para Terneros, o FCS, combinando un mililitro de FCS con 49 mililitros de HBSS en un tubo de 50 mililitros. Mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.
Diseccionar el ratón sacrificado y extirpar su bazo como se demuestra en el protocolo de vídeo de JoVE, tecnología FACS para la separación de linfocitos B esplénicos. Para aislar las células inmunitarias, primero coloque el bazo en un colador de células de 40 micrómetros en una placa de Petri. Tritura el bazo con un émbolo para disociarlo en el plato. Recuperar las células adheridas enjuagando el émbolo y el colador con 1 mililitro de HBSS 2% FCS. Luego, pipetee el bazo disociado y el líquido de la placa de Petri en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lave la placa de Petri con 5 mililitros de HBSS 2% FCS y transfiera el líquido al tubo de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego recuperar el tubo con cuidado para no alterar el pellet. Ahora, retire el sobrenadante sin alterar el pellet y deseche el líquido en un contenedor de residuos adecuado. A continuación, añada dos mililitros de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio al tubo de centrífuga y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y lisar los eritrocitos. Espere dos minutos y luego agregue HBSS 2% FCS al pellet resuspendido para obtener un valor total de 14 mililitros. Repita la centrifugación. Recupere el tubo con cuidado y deseche el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros HBSS 2% FCS pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, cuente las células en suspensión. Agregue cinco microlitros de azul de tripano a cinco microlitros de suspensión celular y mezcle bien pipeteando. A continuación, deposite suavemente una gota de cinco microlitros de suspensión celular diluida entre el cubreobjetos y el portaobjetos Malassez. Con el microscopio configurado en un aumento de 40X, cuente el número de células. Ajuste la concentración de celdas de 10 a siete celdas por mililitro agregando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.
Para comenzar la transferencia adoptiva, transfiera dos mililitros de la suspensión celular a un tubo de recolección de cinco mililitros. Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato y centrifugue el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Deseche el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. Usando una jeringa de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 29, inyecte 200 microlitros de suspensión celular en el ratón experimental por vía intravenosa en el seno sanguíneo retroorbitario.
Cuatro días después de la transferencia adoptiva, eutanasia a los ratones y extirpar los bazos. A continuación, recoja las células inmunitarias como se describe en la sección tres. A continuación, transfiera 100 microlitros de suspensión celular de cada ratón a dos tubos FACS etiquetados como control y transferidos. Centrifugar los tubos a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar los sobrenadantes. Ahora, prepare una mezcla que contenga los cuatro anticuerpos en la dilución indicada en la tabla uno. Agregue 100 microlitros de la mezcla a cada tubo y luego incube durante 20 minutos en hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y luego centrifugue los tubos a 370 veces g durante tres minutos a 10 grados centígrados. Deseche los sobrenadantes y luego vuelva a suspender los pellets en 200 microlitros de HBSS 2% FCS. Transfiera las células resuspendidas a nuevos tubos FACS marcados. Ahora, utilice la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS para evaluar la presencia de CD45. 2 linfocitos positivos.
Ahora, determinaremos la presencia de linfocitos CD45.2 que fueron aislados del CD45. 1 bazo del huésped. Para empezar, haz doble clic en el icono de FlowJo y arrastra los archivos de cada tubo en la ventana de todas las muestras. A continuación, haga doble clic en el archivo transferido para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en un gráfico de puntos que muestra la dispersión hacia adelante FSCA en el eje x y la dispersión lateral SSCA en el eje y. Haga clic en el polígono para rodear las poblaciones de linfocitos. Aparecerá una nueva ventana de identificación de subpoblación. Haga clic en Aceptar. Ahora, establezca el eje y en FSC-W y el eje x en FSC-A. Seleccione la población de celda única con la herramienta polígono como se demostró anteriormente.
A continuación, haga doble clic en la población encerrada en un círculo para crear una nueva ventana para las celdas seleccionadas. En la nueva ventana, seleccione CD45.2 en la Y y CD45.1 en la X. Haga clic en el icono T y personalice el eje para ampliar el gráfico. A continuación, haga clic en el polígono para rodear las celdas positivas CD45.2. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células transferidas a la población de células y haga clic en Aceptar. En la misma ventana, haga clic en el rectángulo para seleccionar las celdas negativas CD45.2. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células anfitrionas de la población celular y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población con un círculo CD45.2, población transferida, para crear una nueva ventana para las celdas seleccionadas. En la nueva ventana, seleccione CD3 en la Y y CD4 en la X.
A continuación, haga clic en el polígono para rodear las celdas CD4 CD3 positivas. En esta ventana de identificación de subpoblaciones, asigne un nombre a la población celular CD4 transferida. A continuación, repita los pasos de análisis anteriores con el archivo de control del ratón. Finalmente, para visualizar sus poblaciones de celdas, haga clic en Editor de diseño. Arrastre las celdas transferidas y la población de celdas CD4 transferidas de los archivos transferidos y de control a la pestaña Editor de diseño. Aparecerá un diagrama de puntos que representa las células CD45.2 positivas y los linfocitos CD4. CD45. 2 celdas transferidas solo deben aparecer en el diagrama de puntos del ratón transferido.
