Transferencia celular adoptiva: Introducción de cenocitos de un ratón donante a un ratón huésped y evaluación del éxito a través de FACS
Fuente: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto…
1. Preparación
- Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
- Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
- Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).
2. Disección
- Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
- El uso de fórceps mueve los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
- Usando fórceps separa cuidadosamente el bazo del estómago y colócalo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.
3. Aislamiento celular inmune
- Coloque el bazo sobre un colador de células de 40 m sobre la placa Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo.
- Recupere las células adheridas encerrando el émbolo y el colador con 1 ml de HBSS 2% FCS.
- Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
- Lavar la placa Petri con 5 mililitros de HBSS 2% FCS y transferir el fluido al tubo de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
- Resuspenda el pellet en 2 ml de pipeta de cloruro de amonio de potasio hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y lejar los eritrocitos.
- Espere 2 min y agregue HBSS 2% FCS al pellet resuspendido para obtener el volumen de hasta 14 ml.
- Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Cuente las células usando el ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 107 celdas/ml usando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.
4. Transferencia adoptiva
- Transferencia de 2 ml de suspensión celular obtenida en un tubo de recogida de 5 ml.
- Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y luego desechar el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet en 2 ml de PBS y centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 ml de PBS.
- El uso de una jeringa de 0,5 ml con una aguja de 29 G inyectar 200 l de suspensión celular en el ratón experimental por vía intravenosa en el seno de la sangre retroorbital.
- Como control, inyectar un segundo ratón en el mismo seno de la sangre con 200 ml de solución salina tamponada de fosfato.
5. Cosecha y tinción de células
- Cuatro días después de la transferencia adoptiva, eutanasia a los ratones y extirpa el bazo.
- Cosecha los esplenocitos como se describe en la sección 3.
- Transfiera 100 l de suspensiones celulares de cada ratón a dos tubos FACS, etiquetados como "control" y "transferidos".
- Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y luego desechar los sobrenadores.
- Preparar una mezcla que contenga los cuatro anticuerpos en las diluciones enumeradas en la Tabla 1.
| Anticuerpos | Fluorocromo | Dilución |
| CD45.1 | BV711 | 1/200 |
| CD45.2 | APCCy7 | 1/400 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD3 | BV421 | 1/200 |
Tabla 1: Los anticuerpos mezclan composición. Preparación de cuatro cocteles de anticuerpos utilizando conjugados concentrados de anticuerpos fluorescentes y HBSS.
- Añadir 100 l de la mezcla a cada tubo, y luego incubar durante 20 minutos en hielo en la oscuridad.
- Añadir 1 ml de HBSS 2%FCS y luego centrifugar los tubos a 370 x g durante 3 min a 10oC.
- Deseche los sobrenadores y resuspenda los pellets en 200 l de HBSS 2% FCS.
- Transfiera las celdas resuspendidas a nuevos tubos FACS etiquetados.
- Utilizando citometría de flujo, como se muestra en el protocolo FACS, evalúe la presencia de linfocitos positivos CD45.2.
6. Análisis de datos
- Abra el software "FlowJo" y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana"Todos los muestras".
- Haga doble clic en el archivo "transferido"para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en una gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia adelante "SSC-A" en el eje Y y la dispersión lateral "FSC-A" en el eje X.
- Haga clic en "polígono" y cree una estrategia de gating para seleccionar linfocitos, luego distinga las células de donante y host usando marcadores de superficie celular (CD45.1, CD45.2), y luego caracterice CD45.2+ población celular (CD3, CD4).
- Repita los pasos del análisis con el archivo "control mouse".
- Para visualizar la población de celdas, haga clic en"Editor de diseño".
- Arrastre los archivos "celdas transferidas"y "celdas CD4 transferidas" de "transferidos" y "control" en la pestaña " Editor dediseño".
- Aparecerá una gráfica de puntos que representa CD45.2+ células y linfocitos CD4.
- Las celdas transferidas CD45.2 solo deben aparecer en la gráfica de puntos "ratón transferido".
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La transferencia celular adoptiva es un método para introducir células de interés en un organismo. Es una técnica poderosa para estudiar varios mecanismos biológicos, incluida la acción de clases específicas de células inmunitarias. Además, la transferencia adoptiva es un tratamiento novedoso y prometedor para numerosas afecciones, como las que requieren trasplantes de médula ósea o tratamientos contra el cáncer en los que se pueden extraer las propias células T del paciente, modificarlas para reconocer y destruir las células cancerosas y luego devolverlas al cuerpo para combatir los tumores.
En el laboratorio, los modelos animales se utilizan a menudo para estudiar la transferencia adoptiva. Por ejemplo, los ratones knockout CD45.1 Rag gamma-c carecen de receptores fundamentales para muchas citocinas, que son esenciales para la diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas en linfocitos. Como resultado, los ratones knockout tienen un desarrollo de linfocitos comprometido y no tienen células asesinas naturales, o NK, células T o células B.
La transferencia adoptiva se puede utilizar para introducir las células inmunitarias faltantes en estos ratones comprometidos, recolectando primero tejido de ratón donante que contenga altas concentraciones de células inmunitarias, como el bazo. A continuación, el tejido se disocia y se aísla una variedad de células del bazo, incluidas las células inmunitarias. A continuación, los eritrocitos no deseados, o glóbulos rojos, se pueden lisar mediante la adición de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio y los glóbulos blancos restantes, o esplenocitos, se separan de los restos celulares mediante centrifugación.
Finalmente, los esplenocitos purificados se inyectan en los ratones inmunocomprometidos, lo que facilita estudios detallados de las funciones de estas células. Varios días después, el éxito de la transferencia adoptiva de células inmunitarias puede confirmarse aislando y preparando primero los esplenoncitos del huésped de la misma manera que el tejido del donante. A continuación, estas células se tiñen utilizando anticuerpos marcados contra los marcadores de células inmunitarias del donante para que puedan verificarse y clasificarse mediante FACS.
Para empezar, póngase guantes de laboratorio y el equipo de protección adecuado. A continuación, lave un par de pinzas y unas tijeras de disección primero con un detergente y luego con etanol al 70% y luego séquelas con una toalla de papel limpia. Prepare 50 mililitros de la Solución Salina Equilibrada de Hank's, o HBSS, con un 2% de Suero Fetal para Terneros, o FCS, combinando un mililitro de FCS con 49 mililitros de HBSS en un tubo de 50 mililitros. Mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.
Diseccionar el ratón sacrificado y extirpar su bazo como se demuestra en el protocolo de vídeo de JoVE, tecnología FACS para la separación de linfocitos B esplénicos. Para aislar las células inmunitarias, primero coloque el bazo en un colador de células de 40 micrómetros en una placa de Petri. Tritura el bazo con un émbolo para disociarlo en el plato. Recuperar las células adheridas enjuagando el émbolo y el colador con 1 mililitro de HBSS 2% FCS. Luego, pipetee el bazo disociado y el líquido de la placa de Petri en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lave la placa de Petri con 5 mililitros de HBSS 2% FCS y transfiera el líquido al tubo de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego recuperar el tubo con cuidado para no alterar el pellet. Ahora, retire el sobrenadante sin alterar el pellet y deseche el líquido en un contenedor de residuos adecuado. A continuación, añada dos mililitros de tampón de lisado de cloruro de amonio y potasio al tubo de centrífuga y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y lisar los eritrocitos. Espere dos minutos y luego agregue HBSS 2% FCS al pellet resuspendido para obtener un valor total de 14 mililitros. Repita la centrifugación. Recupere el tubo con cuidado y deseche el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros HBSS 2% FCS pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, cuente las células en suspensión. Agregue cinco microlitros de azul de tripano a cinco microlitros de suspensión celular y mezcle bien pipeteando. A continuación, deposite suavemente una gota de cinco microlitros de suspensión celular diluida entre el cubreobjetos y el portaobjetos Malassez. Con el microscopio configurado en un aumento de 40X, cuente el número de células. Ajuste la concentración de celdas de 10 a siete celdas por mililitro agregando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.
Para comenzar la transferencia adoptiva, transfiera dos mililitros de la suspensión celular a un tubo de recolección de cinco mililitros. Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato y centrifugue el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Deseche el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. Usando una jeringa de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 29, inyecte 200 microlitros de suspensión celular en el ratón experimental por vía intravenosa en el seno sanguíneo retroorbitario.
Cuatro días después de la transferencia adoptiva, eutanasia a los ratones y extirpar los bazos. A continuación, recoja las células inmunitarias como se describe en la sección tres. A continuación, transfiera 100 microlitros de suspensión celular de cada ratón a dos tubos FACS etiquetados como control y transferidos. Centrifugar los tubos a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar los sobrenadantes. Ahora, prepare una mezcla que contenga los cuatro anticuerpos en la dilución indicada en la tabla uno. Agregue 100 microlitros de la mezcla a cada tubo y luego incube durante 20 minutos en hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y luego centrifugue los tubos a 370 veces g durante tres minutos a 10 grados centígrados. Deseche los sobrenadantes y luego vuelva a suspender los pellets en 200 microlitros de HBSS 2% FCS. Transfiera las células resuspendidas a nuevos tubos FACS marcados. Ahora, utilice la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS para evaluar la presencia de CD45. 2 linfocitos positivos.
Ahora, determinaremos la presencia de linfocitos CD45.2 que fueron aislados del CD45. 1 bazo del huésped. Para empezar, haz doble clic en el icono de FlowJo y arrastra los archivos de cada tubo en la ventana de todas las muestras. A continuación, haga doble clic en el archivo transferido para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en un gráfico de puntos que muestra la dispersión hacia adelante FSCA en el eje x y la dispersión lateral SSCA en el eje y. Haga clic en el polígono para rodear las poblaciones de linfocitos. Aparecerá una nueva ventana de identificación de subpoblación. Haga clic en Aceptar. Ahora, establezca el eje y en FSC-W y el eje x en FSC-A. Seleccione la población de celda única con la herramienta polígono como se demostró anteriormente.
A continuación, haga doble clic en la población encerrada en un círculo para crear una nueva ventana para las celdas seleccionadas. En la nueva ventana, seleccione CD45.2 en la Y y CD45.1 en la X. Haga clic en el icono T y personalice el eje para ampliar el gráfico. A continuación, haga clic en el polígono para rodear las celdas positivas CD45.2. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células transferidas a la población de células y haga clic en Aceptar. En la misma ventana, haga clic en el rectángulo para seleccionar las celdas negativas CD45.2. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células anfitrionas de la población celular y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población con un círculo CD45.2, población transferida, para crear una nueva ventana para las celdas seleccionadas. En la nueva ventana, seleccione CD3 en la Y y CD4 en la X.
A continuación, haga clic en el polígono para rodear las celdas CD4 CD3 positivas. En esta ventana de identificación de subpoblaciones, asigne un nombre a la población celular CD4 transferida. A continuación, repita los pasos de análisis anteriores con el archivo de control del ratón. Finalmente, para visualizar sus poblaciones de celdas, haga clic en Editor de diseño. Arrastre las celdas transferidas y la población de celdas CD4 transferidas de los archivos transferidos y de control a la pestaña Editor de diseño. Aparecerá un diagrama de puntos que representa las células CD45.2 positivas y los linfocitos CD4. CD45. 2 celdas transferidas solo deben aparecer en el diagrama de puntos del ratón transferido.
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Q1: What is adoptive cell transfer and why is it used in research?
Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.
Q2: Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?
CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.
Q3: How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?
The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.
Q4: What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?
Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.
Q5: How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?
The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.
Q6: What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?
FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.
Q7: What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?
Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.