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Ensayo sobre la muerte celular: Ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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Immunology

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Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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11:48 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3y Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Una de las principales funciones de las células del sistema inmunitario es eliminar las células diana que han sido infectadas con virus o han sufrido transformación en una célula tumoral. Los ensayos in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células inmunitarias han sido un elemento básico en los laboratorios durante muchos años. Estos ensayos se han utilizado para determinar la capacidad de las células T, células NK, o cualquier otra célula inmune para matar las células diana de una manera específica de antígeno o -no específico. Los ligandos de la muerte (por ejemplo, Fas ligando o TRAIL), las citoquinas (por ejemplo, IFNg o TNF) o gránulos citotóxicos (es decir, perforin/granzyme B) expresados por las células efectoras son algunas formas en que se puede inducir la muerte celular diana. Con la explosión en la investigación de inmunoterapia tumoral en los últimos años, hay un creciente interés en encontrar agentes para aumentar la actividad citotóxica de las células inmunitarias para mejorar los resultados del paciente. Por el contrario, algunas enfermedades se caracterizan por la actividad excesivamente exuberante de la actividad citotóxica de las células inmunitarias, lo que resulta en esfuerzos para identificar agentes para templar estas respuestas. Por lo tanto, tener un ensayo en el que el usuario puede integrar fácilmente cualquier número de diferentes células efectoras, células diana y / o modificadores de respuesta en el diseño experimental puede servir como un medio valioso de evaluar rápidamente la capacidad citotóxica de las células efectoras y / o la capacidad de respuesta de la célula objetivo.

Estos ensayos in vitro implican la mezcla de diferentes poblaciones celulares, así como el uso de un número relativamente bajo de células efectoras y dianas. Por lo tanto, una necesidad del ensayo es etiquetar las celdas de destino de una manera que pueda ser fácilmente detectada y cuantificada, permitiendo al usuario determinar el ‘porcentaje específico de lisis’ mediado por las células del efector. La radiactividad – especialmente, cromo 51⁽⁵¹Cr) en forma de Na₂⁵¹CrO₄– es una manera económica de etiquetar rápida e inespecíficamente las proteínas celulares dentro de las células diana (1). El etiquetado corto y los tiempos totales de ensayo reducen el potencial de cambios significativos en el número y/o fenotipo de las células diana, lo que podría influir en el resultado del ensayo. Tras la pérdida de la integridad de la membrana de las células diana como resultado de la actividad citotóxica de las células efectoras, las ⁵¹proteínas celulares etiquetadas con Cr dentro de las células diana se liberan en el sobrenadante del cultivo, Cuantificación. Al igual que con cualquier ensayo que examine la función de las células inmunitarias in vitro,hay una serie de consideraciones importantes a considerar la mejora del rendimiento del experimento. Una de las características más críticas es utilizar células efectora saludable (para la máxima actividad citotóxica) y células diana (para máxima capacidad de respuesta y mínima muerte espontánea / liberación de⁵¹Cr). Se requiere contacto de células objetivo y efector (lo que lleva al uso común de placas de 96 pocillos de fondo redondo para fomentar el contacto con células celulares) (2). Por último, el análisis de datos depende de la inclusión de poblaciones de células objetivo de control positivo y negativo.

El siguiente protocolo describirá los pasos para realizar un ensayo de liberación estándar de ⁵¹Cr para medir la capacidad citotóxica de una población de células efectoras, aunque recientemente se ha desarrollado una versión no radioactiva con Europium. ⁵¹ Cr es un emisor de radiación de gran alcance. En consecuencia, el uso de este ensayo requiere un entrenamiento adecuado de seguridad de la radiación, un espacio de laboratorio dedicado, un contador gamma y la eliminación de muestras radiactivas.

La secuencia general de eventos en este ensayo es: 1) preparar ⁵¹objetivos con etiqueta Cr; 2) preparar las células efectoray y añadir a la placa mientras las células objetivo están etiquetando; 3) añadir objetivos etiquetados a la placa; 4) placa de incubación; 5) cosechar supernatantes; y 6) analizar los datos después de ejecutar muestras en el mostrador. Las muestras se preparan comúnmente en triplicado, y luego se promedian para tener en cuenta cualquier diferencia sutil de pipeteo.

El EPP adecuado es importante para este ensayo. Específicamente, el usuario debe usar una capa de laboratorio y guantes. Es posible que se requieran gafas de seguridad en función del laboratorio o la institución. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso de la ⁵¹Cr durante todos los pasos. Por último, debe haber espacio de laboratorio dedicado y equipo reservado para el uso de ⁵¹Cr, incluyendo toda la señalización adecuada para indicar dónde se guardan muestras con ⁵¹Cr y un contador Geiger equipado con sonda gamma para inspeccionar el espacio para Contaminación.

En este ejercicio de laboratorio, determinaremos la capacidad de las células mononucleares de sangre periférica humana (PPBCM), (CpG estimulado frente a no estimulado) para matar las células del melanoma, utilizando la línea celular de melanoma humano WM793 como modelo y el ensayo de liberación de cromo.

Procedure

Descripción general del procedimiento

El típico ensayo de liberación ^{de 51}Cr para medir la muerte celular implica los siguientes pasos:

En primer lugar, las celdas de destino se etiquetan con Na₂[⁵¹Cr]O₄. Esto los distingue de las células efectoras en el ensayo.
Mientras que las células diana están etiquetando, las células efectoras se recogen y, utilizando la técnica de dilución en serie, se genera una valoración decreciente de las células del efector en una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo redondo.
Al final del etiquetado de la célula objetivo, las células se lavan primero y luego se agrega un número fijo de células a la placa de ensayo que ya contiene una serie de diluciones de células efectora.
A continuación, la mezcla de células de efector de destino se incuba durante un período de tiempo definido para permitir una interacción celular suficiente con las celdas de destino, para mediar la lisis celular.
Finalmente, los supernatantes de cultivo se cosechan y se recogen en tubos. La cantidad de ⁵¹Cr se cuantifica utilizando un contador gamma.
Al final, los datos se recopilan y se utilizan para calcular la “lisis de celda específica porcentual” de las celdas de destino.

1. Etiquetado de celdas objetivo con ⁵¹Cr

Para empezar, preparar las células diana, (aquí, la línea celular de melanoma humano WM793), en una suspensión de una sola célula.
Para ello, primero retire los medios del matraz de cultivo de tejido.
Luego, lave las células con 5 ml de 1X PBS.
Pruebe las células agregando 1 ml de trippsina a la placa durante 2 min.
Toque suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz.
Agregue 5 ml de medios RPMI al matraz y pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo para separar las células.
Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 1200 rpm. Decantar al sobrenadante.
Añadir 10 ml de medios al pellet y canalizar suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión.
Determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro.
Transfiera 1×10⁶células a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1200 rpm y decantar el sobrenadante.
Brevemente vórtice el tubo para resuspender el pellet celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.
Añadir 100 ci de ⁵¹Cr directamente a la suspensión de celda objetivo WM793.
Nota: Debe haber un espacio de laboratorio dedicado configurado para la radiactividad particular. Además, debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso de la ⁵¹Cr durante todos los pasos, así como la señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con ⁵¹Cr. También es necesario un contador Geiger equipado con una sonda de panqueques, para examinar el espacio para detectar una posible contaminación.
Agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que el tubo es ahora radioactivo.
Coloque el tubo en una incubadora de 37oC con un protector de plomo e incubar durante 1 h. Deslice el tubo cada 15-20 minutos para aumentar la acumulación de la célula objetivo del cromo.
Después del período de incubación, lave las células diana con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso de ⁵¹Cr.
Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min. Decant radioactive FBS lavar en el contenedor de residuos adecuado.
Resuspende el pellet y lávelo por segunda vez con FBS. Compruebe la radiactividad incorporada en el pellet utilizando un contador Geiger.
Resuspender el pellet en medio completo de 10 ml, logrando una concentración celular de 10⁵ células/ml.
Nota: El paso de recuento de células después del etiquetado ⁵¹Cr se omite aquí en gran medida por las razones de seguridad. Se puede suponer que la concentración celular WM793 es la misma que antes del etiquetado ⁵¹Cr.

2. Preparación de células efector

Se puede utilizar una variedad de células efector, como células T humanas o de ratón y células NK. En este ejemplo, se utilizaron PMAC, aislados de sangre entera por centrifugación de gradiente de densidad estándar (a una concentración de 5×10⁶).
Para empezar, agregue 100 s de medio de cultivo de tejido a cada pocal de una de las filas (aquí fila A, Ver Tabla 1) de una placa de fondo redonda de 96 pocillos. Aquí, no se agregan celdas efector, y servirán como el ‘en blanco’ para determinar la “liberación mínima/espontánea ⁵¹Cr” de las celdas de destino.

Tabla 1: Diseño del ensayo de liberación ^{de 51}Cr: Celdas de la fila A- Objetivo (10⁴ celdas/ 100 l) incubadas con medios solamente (genera ‘en blanco’ para determinar la “liberación mínima/espontánea ⁵¹Cr”). Filas B a C- pozos que contienen diferentes efectores: relaciones de celda objetivo (E:T), que van desde 50:1 a 1.5:1. Fila H- células de destino (10⁴ celdas/100 l) incubadas con 1% NP-40 (NP-40 lisa las celdas de destino, generando “liberación máxima o total ^{de 51}Cr”). Cada relación E:T se prueba en triplicado para cada condición experimental. Columna 1-3- PMUCs no estimulados y columna 4-6- PPC estimulados por CpG.

A continuación, generar una dilución de células seriales 2X de los PBIC (en triplicado para cada condición experimental), para obtener una concentración de células efectoras que van desde 5×10⁵ a 15,625 células/100 l de medios (aquí filas B a G).
Nota: En este ejemplo, el efector inicial: la relación de celda de destino (E: T) es 50:1. Sin embargo, esta relación se puede ajustar dependiendo de los detalles experimentales.
Deje la última fila vacía (aquí fila H) sin agregar ninguna celda de efector a estos pozos. (Esta fila se utilizará para generar los “recuentos totales/min, o (c. p. m)” o la “liberación máxima ^{de 51}Cr”).
Coloque la placa en una incubadora de 37oC hasta que las celdas de destino estén listas para ser añadidas.

3. Adición de ⁵¹Cr etiquetadoWM793 células de destino al ensayo

Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lave con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso ^{de 51}Cr.
Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min, utilizando una centrífuga designada.
Retire el lavado FBS (sobrenadante radiactivo) en un contenedor de residuos apropiado.
Repita el paso de lavado resuponiendo el pellet en un fresco 5 ml de FBS.
Centrifugar las células de nuevo a 1200 rpm durante 5 min.
Finalmente, resuspende el pellet en 10 mL de medio completo.
Vierta la suspensión celular WM793 con etiqueta ^{cr 51}(10⁵ celdas/ml) en un depósito de reactivos desechable.
A continuación, agregue 100 l de estas celdas de destino etiquetadas a cada pozo de la placa celular efectora de 96 pocillos, utilizando una pipeta multicanal.
A continuación, agregue 100 l de 1% NP-40 (en agua) a la fila de pozos que están desprovistos de cualquier célula efector (aquí fila H). 1% NP-40 atisfará las celdas de destino, y por lo tanto estos pozos servirán como controles para determinar los “recuentos totales/min, o (c. p. m)” o la liberación máxima de ⁵¹Cr.
Asegure la tapa a la placa añadiendo una pequeña pieza de cinta permeable al gas a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene ⁵¹Cr.
Brevemente, centrifugar la placa a 1200 rpm. Si sólo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga.
Nota: Es importante utilizar una centrífuga marcada para manejar muestras radiactivas.
Retire la placa de la centrífuga.
Coloque la placa en una incubadora de 37oC con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 h para permitir la lisis celular diana.
Nota: El período de incubación puede variar de 4 a 18 h dependiendo de las células efectoras utilizadas y el mecanismo potencial de matanza empleada.

4. Cosecha de los Supernatants

Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa.
A continuación, coloque el marco de cosecha en la placa, asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro están en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Esto asegurará la colección de un sobrenadante libre de células.
Ahora, presione lentamente y suavemente los tapones de algodón en los pozos.
Después de aproximadamente 10 segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo.
Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario.
Finalmente, cargue los tubos FACS en el contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de ⁵¹Cr liberadas en cada condición. Las muestras se miden típicamente durante 1 minuto, lo que permite una fácil determinación de los “cuentas/minuto”.
Con cuidado, registre el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.

5. Análisis de datos

Aquí, los PbMU no estimulados se añadieron a las tres primeras columnas, y los PBMC estimulados por CpG (CpG ODN, (1 g/ml) para 24 h) se agregaron a las columnas 4-6. Véase el Cuadro 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
Un	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Ⅰ	Promedio de A1, A2,A3 ->		1164.67	C.p.m espontáneo		1058.33
J	Promedio de B1, B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Promedio de C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Promedio de D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Promedio de E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Promedio de F1, F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Promedio de G1, G2, G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Promedio de H1,H2,H3 ->		8884.67	Máximo c.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Relación E:T

Tabla 2: ⁵¹Cr datos del ensayo de la versión: Valores de datos ‘Counts per minute’ / ‘c. p. m’, valores de c. p. m promedio y valores de lisis específicos de porcentaje calculado.

Los datos recogidos (cuentas por minuto, es decir, c.p.m) se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original.
En primer lugar, se calcularon los promedios de los triplicados. Tabla 2 – células I3 a P3, para PMUCs no estimulados y células I6 a P6, para PMCs estimulados por CpG.
Una vez determinados los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se calculó utilizando la siguiente formula-
El porcentaje de lisis específica se calculó para cada condición (Tabla 2 – células J4 a O4, para PPM no estimulados y J7 a O7, para PBL no estimulados).

En este video observará cómo realizar el ensayo de liberación de cromo y determinar el potencial citotóxico de las células efectoras.

Las células inmunitarias son responsables de identificar y eliminar las células potencialmente dañinas, como el cáncer o las células infectadas por el virus, del cuerpo, que es una parte integral de la respuesta inmunitaria. Varias células inmunitarias, como las células T y las células NK, poseen una propiedad conocida como potencial citotóxico, que es la capacidad de identificar las células diana y secretar proteínas que inducen la degradación de las proteínas, la lisis y la muerte de esas células diana. Cuantificar el potencial citotóxico es fundamental para medir la activación y potencia de las células inmunitarias, y el ensayo de liberación de cromo se utiliza comúnmente para este propósito.

Este método permite a los usuarios comparar la toxicidad inducida por tipos específicos de células inmunitarias en diferentes condiciones, que es valioso para el estudio de la inmunoterapia contra el cáncer y enfermedades relacionadas con la inmunidad. Para empezar, las células diana, como las células cancerosas, se incuban con un isótopo radiactivo, cromo 51, que es tomado por las células. A continuación, estas células radioeléctricas etiquetadas se co-cultivan con las células inmunitarias aisladas de interés, también llamadas células efectoras, en un fondo redondo, placa de 96 pocillos para facilitar la interacción entre los dos tipos de células.

La configuración general del ensayo implica la incubación de un número específico de células diana con diferentes concentraciones de las células inmunitarias, junto con controles adecuados. El co-cultivo permite que las células efectoras induzcan apoptosis y lisis en las células diana, lo que resulta en la liberación del cromo intracelular 51 en el sobrenadante. Luego, en un momento preoptimizado, el sobrenadante que contiene el cromo liberado se cosecha de todos los pozos. El cromo 51, al ser radiactivo, sufre espontáneamente caries radiactivas para emitir radiación gamma. Los niveles de radiación gamma en los sobrenatantes de todos los pocillos de la placa de ensayo representan una salida cuantificable de la lisis de las células diana. Esto se mide utilizando un contador gamma, que luego se utiliza para determinar el potencial citotóxico de las células inmunitarias.

Para empezar, las células diana, la línea celular de melanoma humano WM793 en este ejemplo, se preparan en una suspensión de una sola célula. Para ello, primero retire los medios del matraz de cultivo de tejido y lave las células con cinco mililitros de 1X PBS. Decantar el PBS y luego añadir un mililitro de trippsina a la placa durante aproximadamente dos minutos. Toque suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz y luego agregue cinco mililitros de medios RPMI al matraz. Pipetear el medio hacia arriba y hacia abajo para recoger las células y añadir esta suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros.

Coloque el tubo en la centrífuga durante cinco minutos a 1200 RPM. A continuación, retire el medio del tubo asegurándose de no interrumpir el pellet celular. Mueva suavemente la parte inferior del tubo para interrumpir el pellet celular y agregue 10 mililitros de medios al tubo. Luego, pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión. A continuación, determine la concentración celular utilizando un hemocitómetro y transfiera dos mililitros de la suspensión celular original a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Coloque el tubo en una centrífuga y gletee las células a 12cientos RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vierta el exceso de medios fuera del tubo en un contenedor de residuos. Brevemente vórtice el tubo para resuspender el pellet celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.

A continuación, prepárate para usar Chromium 51 moviéndote a un espacio de laboratorio dedicado a esta radiactividad en particular. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso del Cromo 51 durante todos los pasos, así como la señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con Cromo 51. Un contador Geiger equipado con una sonda de panqueque también es necesario para servir en el espacio para una posible contaminación.

Una vez configurado para el uso adecuado de la radiactividad, agregue 100 microcuries de cromo 51 directamente a la suspensión de la célula objetivo. Luego, agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que la muestra y el tubo ahora son radiactivos. Coloque el tubo en una incubadora de 37 grados celsius con un escudo de plomo e incubar durante una hora, moviendo el tubo cada 15 a 20 minutos.

Mientras las células diana están etiquetando, prepare una suspensión de una sola célula de las células efectora. En este ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica humana, o PDMC, se aislaron de la sangre entera mediante centrifugación de gradiente de densidad estándar a una concentración de 5 veces 10 a 6o. Transfiera esta suspensión de células efectoras a un depósito de reactivo desechable y luego agregue 200 microlitros de esta suspensión en cada pozo de la fila B en una placa redonda de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de RPMI a cada pozo en la fila C a g de la placa.

Ahora, comience a realizar diluciones en serie de los PMIC para tener un rango de números de células efectoras eliminando primero 100 microlitros de las células en los pozos de la fila B y agregando esto a la fila C. Luego, diluir aún más las células efector transfiriendo 100 microlitros de células de la fila C a la fila D. Continúe la dilución en serie. Una vez alcanzada la fila G, mover 100 microlitros de los pozos para dejar un volumen final de 100 microlitros en cada pocal en esa fila. A continuación, agregue 100 microlitros de medio de cultivo de tejido a los pozos de la fila A para servir como control para la liberación espontánea de cromo 51 de las células diana, ya que no se deben agregar células efectoras a esta fila. Luego, coloque una placa en una incubadora de 37 grados celsius hasta que las celdas diana estén listas para ser agregadas.

Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lave con 5 mililitros de FBS para eliminar cualquier exceso de cromo 51. A continuación, coloque el tubo en una centrífuga designada y gire a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el lavado fbS radiactivo en un recipiente de residuos adecuado y repita el paso de lavado volviendo a cargar el pellet en un nuevo 5 mililitros de FBS. Coloque el tubo en una centrífuga designada y vuelva a girar las células a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el segundo lavado y compruebe si el pellet tiene radiactividad incorporada utilizando un contador Geiger. Finalmente, Resuspende el pellet en 10 mililitros de medio completo y vierta la suspensión de células de destino Chromium 51 en un depósito de reactivo satíuco. Luego, agregue 100 microlitros de estas células diana etiquetadas a cada pozo de la placa celular efectora de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de 1% NP-40 en agua a los pozos de la fila H para cargar todas las células objetivo esta cada fila. Estos pozos se utilizarán como un control para determinar los recuentos totales por minuto, o cpm.

Ahora que la placa está preparada, asegure la tapa añadiendo un pequeño trozo de cinta adhesiva a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene cromo 51. A continuación, coloque la placa en una centrífuga marcada para manipular muestras radiactivas. Si sólo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga. Ajuste la centrífuga a 1200 rpm y ponga la placa al día. Una vez a la velocidad, detenga la máquina. Retire la placa de la centrífuga. A continuación, coloque la placa en una incubadora de 37 grados celsius con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 horas para permitir que las células diana se disparen.

Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa. A continuación, coloque el marco de cosecha en la placa asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro están en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Ahora, presione lentamente y suavemente los tapones de algodón en los pozos. Después de aproximadamente diez segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y, a continuación, transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario. Finalmente, cargue los tubos FACS en un contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de cromo 51 liberado en cada condición. Registre cuidadosamente el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.

Aquí, los PPC no estimulados se añadieron a los primeros 3 carriles y los PMBC estimulados por CPG se añadieron a los carriles 4 a 6. En este ejemplo, los recuentos por minuto se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original y se calcularon los promedios de los triplicados. Por ejemplo, para la primera condición, las celdas A1, A2 y A3 se promediaron en la celda I3. Una vez determinados los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se puede calcular utilizando esta fórmula. Por ejemplo, para calcular la lisis específica porcentual para las células no estimuladas que tenían una relación de 50 a 1 células efectoras para las células diana, el CPM espontáneo, que en este ejemplo, es 1164.67, se restó del CPM experimental, 1129. 67. Este número puede dividirse por la diferencia entre el CPM máximo y el CPM espontáneo, y luego multiplicarse por 100 para dar el porcentaje de lisis específica. A continuación, se calcula para cada condición. Estos datos se pueden graficar para mostrar la comparación de la relación E a T con el porcentaje de lisis específica para los PPC no estimulados, y los PPC estimulados por CPG. En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CPG mataron más eficazmente las células diana a medida que aumentaba la proporción de células efectoras con las células objetivo. Este aumento no se observó en los PRAM no estimulados, lo que indica que la estimulación de CPG es necesaria para el aumento observado de la lisis de células diana.

Results

En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CpG (Figura 1, círculos negros)mataron las células diana de manera más efectiva, a medida que aumentaba la proporción de células efectoras con las células objetivo. Este aumento no se observó en los PASTRO no estimulados(círculos blancos),lo que indica que la estimulación del CpG es necesaria para el aumento observado de la lisis de las células diana.

Figura 1: ⁵¹Cr ensayo de dispersión gráfica: Actividad tumoricida por PRAM humanos, no estimulado(círculos blancos)y después de la estimulación con CpG(círculos negros),probado en diferentes efectores: proporciones de células diana (E: T) relaciones (que van desde que van desde . 50:1 a 1.5:1).

Applications and Summary

El ensayo descrito aquí tiene una flexibilidad considerable, ya que se puede utilizar una variedad de células efector y diana dependiendo de la pregunta que se haga. Por ejemplo, la especificidad de las células efectoras se puede determinar mediante el uso de diferentes células diana o el mecanismo de muerte de células efectoras se puede determinar mediante el uso de células deficientes en proteínas específicas o el uso de inhibidores específicos de proteínas. Un problema importante con el ensayo de liberación de ⁵¹Cr es el potencial de una alta velocidad de liberación espontánea por las células objetivo. Cuando se cultiva solo (sin células efector), la liberación espontánea de ⁵¹Cr por las células diana idealmente no debe ser más del 30% de la liberación total (“máxima”) por las células diana inmediatamente lisis. Las tasas de liberación espontánea más altas pueden deberse al uso de células diana no saludables, ya sea debido a una mala salud (por ejemplo, un cultivo prolongado de una línea celular) o a un período de etiquetado demasiado largo.

References

Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

Transcript

In this video you will observe how to perform the chromium release assay and determine the cytotoxic potential of the effector cells.

Immune cells are responsible for identifying and removing potentially harmful cells, like cancer or virus-infected cells, from the body, which is an integral part of the immune response. Several immune cells, like T-cells and NK cells, possess a property known as cytotoxic potential, which is the ability to identify target cells and secrete proteins that induce protein degradation, lysis, and death of those target cells. Quantifying cytotoxic potential is critical for measuring immune cell activation and potency, and the chromium release assay is commonly used for this purpose.

This method enables users to compare cytoxicity induced by specific types of immune cells under different conditions, which is valuable for studying cancer immunotherapy and immunity related diseases. To begin, the target cells, like cancer cells, are incubated with a radioactive isotope, chromium 51, which is taken up by the cells. Next, these radio labeled cells are co-cultured with the isolated immune cells of interest, also called the effector cells, in a round bottom, 96- well plate to facilitate interaction between the two cell types.

The overall setup of the assay involves incubating a specific number of target cells with different concentrations of the immune cells, along with appropriate controls. The co-culture allows the effector cells to induce apoptosis and lysis in the target cells, resulting in the release of the intracellular chromium 51 into the supernatant. Then, at a preoptimized time point, the supernatant containing the released chromium is harvested from all the wells. The chromium 51, being radioactive, spontaneously undergoes radioactive decay to emit gamma radiation. The gamma radiation levels in the supernatants from all the wells in the assay plate represent a quantifiable output of the lysis of the target cells. This is measured using a gamma counter, which is then used to determine the cytotoxic potential of the immune cells.

To begin, the target cells, human melanoma cell line WM793 in this example, are prepared into a single cell suspension. To do this, first remove the media from the tissue culture flask and wash the cells with five milliliters of 1X PBS. Decant the PBS and then add one milliliter of trypsin to the plate for approximately two minutes. Gently tap the flask to loosen the cells from the flask surface and then add five milliliters of RPMI media to the flask. Pipette the media up and down to collect the cells and add this suspension to a 15 milliliter conical tube.

Place the tube in the centrifuge for five minutes at 1200 RPM. Next, remove the media from the tube making sure not to disrupt the cell pellet. Gently flick the bottom of the tube to disrupt the cell pellet and add 10 milliliters of media to the tube. Then, gently pipette the media up and down to bring the cells into suspension. Next, determine the cell concentration using a hemocytometer and transfer two milliliters of the original cell suspension to a new 15 milliliter conical tube. Place the tube into a centrifuge and pellet the cells at 12 hundred RPM for five minutes. After centrifugation, pour the excess media out of the tube into a waste container. Briefly vortex the tube to resuspend the cell pellet in the small volume of medium left behind.

Next, prepare to use Chromium 51 by moving to a lab space dedicated for this particular radioactivity. There should be ample lead shielding for safe storage and use of the Chromium 51 during all steps, as well as proper signage to indicate where samples with Chromium 51 are being kept. A Geiger counter equipped with a pancake probe is also necessary to serve in the space for possible contamination.

Once set up for the proper use of radioactivity, add 100 microcuries of Chromium 51 directly to the target cell suspension. Then, add a small piece of radioactive tape to the tube to indicate that the sample and tube are now radioactive. Place the tube in a 37 degree celsius incubator with a lead shield and incubate for an hour, flicking the tube every 15 to 20 minutes.

While the target cells are labeling, prepare a single cell suspension of effector cells. In this example, human peripheral blood mono nuclear cells, or PDMCs, were isolated from whole blood by standard density gradient centrifugation to a concentration of 5 times 10 to the 6th. Transfer this effector cell suspension into a disposable reagent reservoir and then add 200 microliters of this suspension into each well of row B in a 96-well round-bottom plate. Next, add 100 microliters of RPMI to each well in row C through G of the plate.

Now, begin performing serial dilutions of the PBMCs to have a range of effector cell numbers by first removing 100 microliters of the cells in the wells in row B and adding this to row C. Then, further dilute the effector cells by transferring 100 microliters of cells from row C to row D. Continue the serial dilution. Once row G is reached, move 100 microliters from the wells to leave a final volume of 100 microliters in each well in that row. Next, add 100 microliters of tissue culture medium to the wells in row A to serve as a control for the spontaneous release of Chromium 51 from the target cells, as no effector cells should be added to this row. Then, place a plate into a 37 degree celsius incubator until the target cells are ready to be added.

After the incubation period, remove the target cells from the incubator and wash with 5 milliliters of FBS to remove any excess Chromium 51. Then, place the tube in a designated centrifuge and spin at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the radioactive FBS wash into an appropriate waste container and repeat the wash step by resuspending the pellet in a fresh 5 milliliters of FBS. Place the tube in a designated centrifuge and spin the cells again at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the second wash and check the pellet for incorporated radioactivity using a Geiger counter. Finally, Resuspend the pellet in 10 milliliters of complete medium and pour the Chromium 51 labeled, target cell suspension into a disposable reagent reservoir. Then, add 100 microliters of these labeled target cells to every well of the 96-well effector cell plate. Next, add 100 microliters of 1% NP-40 in water to the wells in row H to lyse all the target cells this each row. These wells will be used as a control to determine the total counts per minute, or cpm.

Now that the plate is prepared, secure the lid by adding a small piece of tape to the each side of the plate and place a piece of radioactive tape on the lid to indicate it contains chromium 51. Then, place the plate in a centrifuge marked to handle radioactive samples. If only one experimental plate is being used, add a balance plate to the centrifuge. Set the centrifuge to 1200 rpm, and bring the plate up to speed. Once at the speed, stop the machine. Remove the plate from the centrifuge. Then, place the plate in a 37 degree celsius incubator with a small piece of lead shielding over the plate for additional safety. Incubate for 16 hours to allow the target cells to lyse.

At the end of the incubation period, carefully remove the tape around the edge of the plate, and remove the lid. Next, place the harvesting frame on the plate making sure to confirm the small filter discs are in place for each of the cotton plugs. Now, slowly and gently press the cotton plugs into the wells. After approximately ten seconds, release the pressure on the cotton plugs, and then transfer the cotton plugs to tube strips. Place each of these tubes into a secondary FACS tube. Finally, load the FACS tubes onto a gamma counter and run the samples to quantitate the amount of chromium 51 released in each condition. Carefully record the order in which the tubes were loaded into the counter.

Here, unstimulated PBMCs were added to the first 3 lanes and CPG stimulated PMBCs were added to lanes 4 through 6. In this example, the counts per minute were entered into the cells of a spreadsheet in the same manner as the samples were laid out in the original plate and the averages of the triplicates were calculated. For example, for the first condition, cells A1, A2, and A3 were averaged in cell I3. Once the averages are determined, the percent of specific lysis for each condition can be calculated using this formula. For example, to calculate the percent specific lysis for the unstimulated cells that had a ratio of 50 to 1 effector cells to target cells the spontaneous CPM, which in this example, is 1164.67, was subtracted from the experimental CPM, 1129. 67. This number can then be divided by the difference between the maximum CPM and the spontaneous CPM, and then multiplied by 100 to give the percent specific lysis. This is then calculated for each condition. These data can then be graphed to show comparison of the E to T ratio with the percent specific lysis for both the unstimulated PBMCs, and the CPG stimulated PBMCs. In this example, effector cells stimulated with CPG more effectively killed target cells as the ratio of effector cells to target cells increased. This increase was not observed in the unstimulated PBMCs, indicating that CPG stimulation is necessary for the observed increase in target cell lysis.

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