Ensayo sobre la muerte celular: Ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

Descripción general del procedimiento

El típico ensayo de liberación ^{de 51}Cr para medir la muerte celular implica los siguientes pasos:

1. En primer lugar, las celdas de destino se etiquetan con Na₂[⁵¹Cr]O₄. Esto los distingue de las células efectoras en el ensayo.
2. Mientras que las células diana están etiquetando, las células efectoras se recogen y, utilizando la técnica de dilución en serie, se genera una valoración decreciente de las células del efector en una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo redondo.
3. Al final del etiquetado de la célula objetivo, las células se lavan primero y luego se agrega un número fijo de células a la placa de ensayo que ya contiene una serie de diluciones de células efectora.
4. A continuación, la mezcla de células de efector de destino se incuba durante un período de tiempo definido para permitir una interacción celular suficiente con las celdas de destino, para mediar la lisis celular.
5. Finalmente, los supernatantes de cultivo se cosechan y se recogen en tubos. La cantidad de ⁵¹Cr se cuantifica utilizando un contador gamma.
6. Al final, los datos se recopilan y se utilizan para calcular la "lisis de celda específica porcentual" de las celdas de destino.

1. Etiquetado de celdas objetivo con ⁵¹Cr

1. Para empezar, preparar las células diana, (aquí, la línea celular de melanoma humano WM793), en una suspensión de una sola célula.
2. Para ello, primero retire los medios del matraz de cultivo de tejido.
3. Luego, lave las células con 5 ml de 1X PBS.
4. Pruebe las células agregando 1 ml de trippsina a la placa durante 2 min.
5. Toque suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz.
6. Agregue 5 ml de medios RPMI al matraz y pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo para separar las células.
7. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 1200 rpm. Decantar al sobrenadante.
8. Añadir 10 ml de medios al pellet y canalizar suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión.
9. Determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro.
10. Transfiera 1x10⁶ células a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
11. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1200 rpm y decantar el sobrenadante.
12. Brevemente vórtice el tubo para resuspender el pellet celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.
13. Añadir 100 ci de ⁵¹Cr directamente a la suspensión de celda objetivo WM793.
    Nota: Debe haber un espacio de laboratorio dedicado configurado para la radiactividad particular. Además, debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso de la ⁵¹Cr durante todos los pasos, así como la señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con ⁵¹Cr. También es necesario un contador Geiger equipado con una sonda de panqueques, para examinar el espacio para detectar una posible contaminación.
14. Agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que el tubo es ahora radioactivo.
15. Coloque el tubo en una incubadora de 37oC con un protector de plomo e incubar durante 1 h. Deslice el tubo cada 15-20 minutos para aumentar la acumulación de la célula objetivo del cromo.
16. Después del período de incubación, lave las células diana con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso de ⁵¹Cr.
17. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min. Decant radioactive FBS lavar en el contenedor de residuos adecuado.
18. Resuspende el pellet y lávelo por segunda vez con FBS. Compruebe la radiactividad incorporada en el pellet utilizando un contador Geiger.
19. Resuspender el pellet en medio completo de 10 ml, logrando una concentración celular de 10⁵ células/ml.
    Nota: El paso de recuento de células después del etiquetado ⁵¹Cr se omite aquí en gran medida por las razones de seguridad. Se puede suponer que la concentración celular WM793 es la misma que antes del etiquetado ⁵¹Cr.

2. Preparación de células efector

1. Se puede utilizar una variedad de células efector, como células T humanas o de ratón y células NK. En este ejemplo, se utilizaron PMAC, aislados de sangre entera por centrifugación de gradiente de densidad estándar (a una concentración de 5x10⁶).
2. Para empezar, agregue 100 s de medio de cultivo de tejido a cada pocal de una de las filas (aquí fila A, Ver Tabla 1) de una placa de fondo redonda de 96 pocillos. Aquí, no se agregan celdas efector, y servirán como el 'en blanco' para determinar la "liberación mínima/espontánea ⁵¹Cr" de las celdas de destino.

Tabla 1: Diseño del ensayo de liberación ^{de 51}Cr: Celdas de la fila A- Objetivo (10⁴ celdas/ 100 l) incubadas con medios solamente (genera 'en blanco' para determinar la "liberación mínima/espontánea ⁵¹Cr"). Filas B a C- pozos que contienen diferentes efectores: relaciones de celda objetivo (E:T), que van desde 50:1 a 1.5:1. Fila H- células de destino (10⁴ celdas/100 l) incubadas con 1% NP-40 (NP-40 lisa las celdas de destino, generando "liberación máxima o total ^{de 51}Cr"). Cada relación E:T se prueba en triplicado para cada condición experimental. Columna 1-3- PMUCs no estimulados y columna 4-6- PPC estimulados por CpG.

3. A continuación, generar una dilución de células seriales 2X de los PBIC (en triplicado para cada condición experimental), para obtener una concentración de células efectoras que van desde 5x10⁵ a 15,625 células/100 l de medios (aquí filas B a G).
   Nota: En este ejemplo, el efector inicial: la relación de celda de destino (E: T) es 50:1. Sin embargo, esta relación se puede ajustar dependiendo de los detalles experimentales.
4. Deje la última fila vacía (aquí fila H) sin agregar ninguna celda de efector a estos pozos. (Esta fila se utilizará para generar los "recuentos totales/min, o (c. p. m)" o la "liberación máxima ^{de 51}Cr").
5. Coloque la placa en una incubadora de 37oC hasta que las celdas de destino estén listas para ser añadidas.

3. Adición de ⁵¹Cr etiquetadoWM793 células de destino al ensayo

1. Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lave con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso ^{de 51}Cr.
2. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min, utilizando una centrífuga designada.
3. Retire el lavado FBS (sobrenadante radiactivo) en un contenedor de residuos apropiado.
4. Repita el paso de lavado resuponiendo el pellet en un fresco 5 ml de FBS.
5. Centrifugar las células de nuevo a 1200 rpm durante 5 min.
6. Finalmente, resuspende el pellet en 10 mL de medio completo.
7. Vierta la suspensión celular WM793 con etiqueta ^{cr 51}(10⁵ celdas/ml) en un depósito de reactivos desechable.
8. A continuación, agregue 100 l de estas celdas de destino etiquetadas a cada pozo de la placa celular efectora de 96 pocillos, utilizando una pipeta multicanal.
9. A continuación, agregue 100 l de 1% NP-40 (en agua) a la fila de pozos que están desprovistos de cualquier célula efector (aquí fila H). 1% NP-40 atisfará las celdas de destino, y por lo tanto estos pozos servirán como controles para determinar los "recuentos totales/min, o (c. p. m)" o la liberación máxima de ⁵¹Cr.
10. Asegure la tapa a la placa añadiendo una pequeña pieza de cinta permeable al gas a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene ⁵¹Cr.
11. Brevemente, centrifugar la placa a 1200 rpm. Si sólo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga.
    Nota: Es importante utilizar una centrífuga marcada para manejar muestras radiactivas.
12. Retire la placa de la centrífuga.
13. Coloque la placa en una incubadora de 37oC con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 h para permitir la lisis celular diana.
    Nota: El período de incubación puede variar de 4 a 18 h dependiendo de las células efectoras utilizadas y el mecanismo potencial de matanza empleada.

4. Cosecha de los Supernatants

1. Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa.
2. A continuación, coloque el marco de cosecha en la placa, asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro están en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Esto asegurará la colección de un sobrenadante libre de células.
3. Ahora, presione lentamente y suavemente los tapones de algodón en los pozos.
4. Después de aproximadamente 10 segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo.
5. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario.
6. Finalmente, cargue los tubos FACS en el contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de ⁵¹Cr liberadas en cada condición. Las muestras se miden típicamente durante 1 minuto, lo que permite una fácil determinación de los "cuentas/minuto".
7. Con cuidado, registre el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.

5. Análisis de datos

1. Aquí, los PbMU no estimulados se añadieron a las tres primeras columnas, y los PBMC estimulados por CpG (CpG ODN, (1 g/ml) para 24 h) se agregaron a las columnas 4-6. Véase el Cuadro 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
Un	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Ⅰ	Promedio de A1, A2,A3 ->		1164.67	C.p.m espontáneo		1058.33
J	Promedio de B1, B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Promedio de C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Promedio de D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Promedio de E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Promedio de F1, F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Promedio de G1, G2, G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Promedio de H1,H2,H3 ->		8884.67	Máximo c.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Relación E:T

Tabla 2: ⁵¹Cr datos del ensayo de la versión: Valores de datos 'Counts per minute' / 'c. p. m', valores de c. p. m promedio y valores de lisis específicos de porcentaje calculado.

2. Los datos recogidos (cuentas por minuto, es decir, c.p.m) se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original.
3. En primer lugar, se calcularon los promedios de los triplicados. Tabla 2 - células I3 a P3, para PMUCs no estimulados y células I6 a P6, para PMCs estimulados por CpG.
4. Una vez determinados los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se calculó utilizando la siguiente formula-
   
   
5. El porcentaje de lisis específica se calculó para cada condición (Tabla 2 - células J4 a O4, para PPM no estimulados y J7 a O7, para PBL no estimulados).