5.12: Ensayo sobre la muerte celular: Ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

Descripción general del procedimiento

El típico ensayo de liberación ^{de 51}Cr para medir la muerte celular implica los siguientes pasos:

1. En primer lugar, las celdas de destino se etiquetan con Na₂[⁵¹Cr]O₄. Esto los distingue de las células efectoras en el ensayo.
2. Mientras que las células diana están etiquetando, las células efectoras se recogen y, utilizando la técnica de dilución en serie, se genera una valoración decreciente de las células del efector en una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo redondo.
3. Al final del etiquetado de la célula objetivo, las células se lavan primero y luego se agrega un número fijo de células a la placa de ensayo que ya contiene una serie de diluciones de células efectora.
4. A continuación, la mezcla de células de efector de destino se incuba durante un período de tiempo definido para permitir una interacción celular suficiente con las celdas de destino, para mediar la lisis celular.
5. Finalmente, los supernatantes de cultivo se cosechan y se recogen en tubos. La cantidad de ⁵¹Cr se cuantifica utilizando un contador gamma.
6. Al final, los datos se recopilan y se utilizan para calcular la "lisis de celda específica porcentual" de las celdas de destino.

1. Etiquetado de celdas objetivo con ⁵¹Cr

1. Para empezar, preparar las células diana, (aquí, la línea celular de melanoma humano WM793), en una suspensión de una sola célula.
2. Para ello, primero retire los medios del matraz de cultivo de tejido.
3. Luego, lave las células con 5 ml de 1X PBS.
4. Pruebe las células agregando 1 ml de trippsina a la placa durante 2 min.
5. Toque suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz.
6. Agregue 5 ml de medios RPMI al matraz y pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo para separar las células.
7. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 1200 rpm. Decantar al sobrenadante.
8. Añadir 10 ml de medios al pellet y canalizar suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión.
9. Determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro.
10. Transfiera 1x10⁶ células a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
11. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1200 rpm y decantar el sobrenadante.
12. Brevemente vórtice el tubo para resuspender el pellet celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.
13. Añadir 100 ci de ⁵¹Cr directamente a la suspensión de celda objetivo WM793.
    Nota: Debe haber un espacio de laboratorio dedicado configurado para la radiactividad particular. Además, debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso de la ⁵¹Cr durante todos los pasos, así como la señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con ⁵¹Cr. También es necesario un contador Geiger equipado con una sonda de panqueques, para examinar el espacio para detectar una posible contaminación.
14. Agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que el tubo es ahora radioactivo.
15. Coloque el tubo en una incubadora de 37oC con un protector de plomo e incubar durante 1 h. Deslice el tubo cada 15-20 minutos para aumentar la acumulación de la célula objetivo del cromo.
16. Después del período de incubación, lave las células diana con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso de ⁵¹Cr.
17. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min. Decant radioactive FBS lavar en el contenedor de residuos adecuado.
18. Resuspende el pellet y lávelo por segunda vez con FBS. Compruebe la radiactividad incorporada en el pellet utilizando un contador Geiger.
19. Resuspender el pellet en medio completo de 10 ml, logrando una concentración celular de 10⁵ células/ml.
    Nota: El paso de recuento de células después del etiquetado ⁵¹Cr se omite aquí en gran medida por las razones de seguridad. Se puede suponer que la concentración celular WM793 es la misma que antes del etiquetado ⁵¹Cr.

2. Preparación de células efector

1. Se puede utilizar una variedad de células efector, como células T humanas o de ratón y células NK. En este ejemplo, se utilizaron PMAC, aislados de sangre entera por centrifugación de gradiente de densidad estándar (a una concentración de 5x10⁶).
2. Para empezar, agregue 100 s de medio de cultivo de tejido a cada pocal de una de las filas (aquí fila A, Ver Tabla 1) de una placa de fondo redonda de 96 pocillos. Aquí, no se agregan celdas efector, y servirán como el 'en blanco' para determinar la "liberación mínima/espontánea ⁵¹Cr" de las celdas de destino.

Tabla 1: Diseño del ensayo de liberación ^{de 51}Cr: Celdas de la fila A- Objetivo (10⁴ celdas/ 100 l) incubadas con medios solamente (genera 'en blanco' para determinar la "liberación mínima/espontánea ⁵¹Cr"). Filas B a C- pozos que contienen diferentes efectores: relaciones de celda objetivo (E:T), que van desde 50:1 a 1.5:1. Fila H- células de destino (10⁴ celdas/100 l) incubadas con 1% NP-40 (NP-40 lisa las celdas de destino, generando "liberación máxima o total ^{de 51}Cr"). Cada relación E:T se prueba en triplicado para cada condición experimental. Columna 1-3- PMUCs no estimulados y columna 4-6- PPC estimulados por CpG.

3. A continuación, generar una dilución de células seriales 2X de los PBIC (en triplicado para cada condición experimental), para obtener una concentración de células efectoras que van desde 5x10⁵ a 15,625 células/100 l de medios (aquí filas B a G).
   Nota: En este ejemplo, el efector inicial: la relación de celda de destino (E: T) es 50:1. Sin embargo, esta relación se puede ajustar dependiendo de los detalles experimentales.
4. Deje la última fila vacía (aquí fila H) sin agregar ninguna celda de efector a estos pozos. (Esta fila se utilizará para generar los "recuentos totales/min, o (c. p. m)" o la "liberación máxima ^{de 51}Cr").
5. Coloque la placa en una incubadora de 37oC hasta que las celdas de destino estén listas para ser añadidas.

3. Adición de ⁵¹Cr etiquetadoWM793 células de destino al ensayo

1. Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lave con 5 ml de FBS para eliminar cualquier exceso ^{de 51}Cr.
2. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 5 min, utilizando una centrífuga designada.
3. Retire el lavado FBS (sobrenadante radiactivo) en un contenedor de residuos apropiado.
4. Repita el paso de lavado resuponiendo el pellet en un fresco 5 ml de FBS.
5. Centrifugar las células de nuevo a 1200 rpm durante 5 min.
6. Finalmente, resuspende el pellet en 10 mL de medio completo.
7. Vierta la suspensión celular WM793 con etiqueta ^{cr 51}(10⁵ celdas/ml) en un depósito de reactivos desechable.
8. A continuación, agregue 100 l de estas celdas de destino etiquetadas a cada pozo de la placa celular efectora de 96 pocillos, utilizando una pipeta multicanal.
9. A continuación, agregue 100 l de 1% NP-40 (en agua) a la fila de pozos que están desprovistos de cualquier célula efector (aquí fila H). 1% NP-40 atisfará las celdas de destino, y por lo tanto estos pozos servirán como controles para determinar los "recuentos totales/min, o (c. p. m)" o la liberación máxima de ⁵¹Cr.
10. Asegure la tapa a la placa añadiendo una pequeña pieza de cinta permeable al gas a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene ⁵¹Cr.
11. Brevemente, centrifugar la placa a 1200 rpm. Si sólo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga.
    Nota: Es importante utilizar una centrífuga marcada para manejar muestras radiactivas.
12. Retire la placa de la centrífuga.
13. Coloque la placa en una incubadora de 37oC con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 h para permitir la lisis celular diana.
    Nota: El período de incubación puede variar de 4 a 18 h dependiendo de las células efectoras utilizadas y el mecanismo potencial de matanza empleada.

4. Cosecha de los Supernatants

1. Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa.
2. A continuación, coloque el marco de cosecha en la placa, asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro están en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Esto asegurará la colección de un sobrenadante libre de células.
3. Ahora, presione lentamente y suavemente los tapones de algodón en los pozos.
4. Después de aproximadamente 10 segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo.
5. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario.
6. Finalmente, cargue los tubos FACS en el contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de ⁵¹Cr liberadas en cada condición. Las muestras se miden típicamente durante 1 minuto, lo que permite una fácil determinación de los "cuentas/minuto".
7. Con cuidado, registre el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.

5. Análisis de datos

1. Aquí, los PbMU no estimulados se añadieron a las tres primeras columnas, y los PBMC estimulados por CpG (CpG ODN, (1 g/ml) para 24 h) se agregaron a las columnas 4-6. Véase el Cuadro 2.

Tabla 2: ⁵¹Cr datos del ensayo de la versión: Valores de datos 'Counts per minute' / 'c. p. m', valores de c. p. m promedio y valores de lisis específicos de porcentaje calculado.

2. Los datos recogidos (cuentas por minuto, es decir, c.p.m) se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original.
3. En primer lugar, se calcularon los promedios de los triplicados. Tabla 2 - células I3 a P3, para PMUCs no estimulados y células I6 a P6, para PMCs estimulados por CpG.
4. Una vez determinados los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se calculó utilizando la siguiente formula-
   
   
5. El porcentaje de lisis específica se calculó para cada condición (Tabla 2 - células J4 a O4, para PPM no estimulados y J7 a O7, para PBL no estimulados).

En este vídeo observarás cómo realizar el ensayo de liberación de cromo y determinar el potencial citotóxico de las células efectoras.

Las células inmunitarias son responsables de identificar y eliminar del cuerpo las células potencialmente dañinas, como las células cancerosas o infectadas por virus, que es una parte integral de la respuesta inmunitaria. Varias células inmunitarias, como las células T y las células NK, poseen una propiedad conocida como potencial citotóxico, que es la capacidad de identificar las células objetivo y secretar proteínas que inducen la degradación de proteínas, la lisis y la muerte de esas células objetivo. La cuantificación del potencial citotóxico es fundamental para medir la activación y la potencia de las células inmunitarias, y el ensayo de liberación de cromo se utiliza habitualmente para este fin.

Este método permite a los usuarios comparar la citoxicidad inducida por tipos específicos de células inmunitarias en diferentes condiciones, lo que es valioso para estudiar la inmunoterapia contra el cáncer y las enfermedades relacionadas con la inmunidad. Para empezar, las células objetivo, al igual que las células cancerosas, se incuban con un isótopo radiactivo, el cromo 51, que es absorbido por las células. A continuación, estas células radiomarcadas se cultivan conjuntamente con las células inmunitarias aisladas de interés, también llamadas células efectoras, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo para facilitar la interacción entre los dos tipos de células.

La configuración general del ensayo implica la incubación de un número específico de células diana con diferentes concentraciones de células inmunitarias, junto con los controles adecuados. El cocultivo permite a las células efectoras inducir la apoptosis y la lisis en las células diana, lo que resulta en la liberación del cromo intracelular 51 en el sobrenadante. Luego, en un punto de tiempo preoptimizado, el sobrenadante que contiene el cromo liberado se cosecha de todos los pozos. El cromo 51, al ser radiactivo, sufre espontáneamente una desintegración radiactiva para emitir radiación gamma. Los niveles de radiación gamma en los sobrenadantes de todos los pocillos de la placa de ensayo representan una salida cuantificable de la lisis de las células objetivo. Esto se mide utilizando un contador gamma, que luego se utiliza para determinar el potencial citotóxico de las células inmunitarias.

Para empezar, las células objetivo, la línea celular de melanoma humano WM793 en este ejemplo, se preparan en una suspensión de una sola célula. Para ello, primero retire el medio del matraz de cultivo de tejidos y lave las células con cinco mililitros de PBS 1X. Decantar el PBS y luego agregar un mililitro de tripsina al plato durante aproximadamente dos minutos. Golpee suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz y luego agregue cinco mililitros de medios RPMI al matraz. Pipetea el medio hacia arriba y hacia abajo para recoger las células y añadir esta suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros.

Coloque el tubo en la centrífuga durante cinco minutos a 1200 RPM. A continuación, retire el medio del tubo asegurándose de no interrumpir el pellet de la celda. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para romper el pellet de la celda y agregue 10 mililitros de medio al tubo. A continuación, pipetea suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión. A continuación, determine la concentración celular con un hemocitómetro y transfiera dos mililitros de la suspensión celular original a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Coloque el tubo en una centrífuga y granule las celdas a 12 mil RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vierta el exceso de medio fuera del tubo en un contenedor de desechos. Agite brevemente el tubo para resuspender la célula en el pequeño volumen de medio que queda.

A continuación, prepárese para usar Chromium 51 trasladándose a un espacio de laboratorio dedicado a esta radiactividad en particular. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento y uso seguro del Chromium 51 durante todos los pasos, así como una señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con Chromium 51. También es necesario un contador Geiger equipado con una sonda de panqueques para servir en el espacio por posible contaminación.

Una vez configurado para el uso adecuado de la radiactividad, agregue 100 microcurios de Cromo 51 directamente a la suspensión de la célula objetivo. Luego, agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que la muestra y el tubo ahora son radiactivos. Coloque el tubo en una incubadora a 37 grados centígrados con un protector de plomo e incube durante una hora, agitando el tubo cada 15 a 20 minutos.

Mientras se etiquetan las células objetivo, prepare una suspensión de células efectoras de una sola célula. En este ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica humana, o PDMC, se aislaron de la sangre total mediante centrifugación en gradiente de densidad estándar a una concentración de 5 veces 10 a la 6ª. Transfiera esta suspensión de celda efectora a un depósito de reactivo desechable y luego agregue 200 microlitros de esta suspensión en cada pocillo de la fila B en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de RPMI a cada pocillo en la fila C a G del plato.

Ahora, comience a realizar diluciones en serie de las PBMC para tener un rango de números de células efectoras eliminando primero 100 microlitros de las células en los pocillos de la fila B y agregándolas a la fila C. A continuación, diluya aún más las células efectoras transfiriendo 100 microlitros de células de la fila C a la fila D. Continúe con la dilución en serie. Una vez que se alcanza la fila G, mueva 100 microlitros de los pocillos para dejar un volumen final de 100 microlitros en cada pocillo de esa fila. A continuación, se añadan 100 microlitros de medio de cultivo de tejidos a los pocillos de la fila A para que sirvan de control de la liberación espontánea de cromo 51 de las células objetivo, ya que no se deben añadir células efectoras a esta hilera. Luego, coloque una placa en una incubadora a 37 grados centígrados hasta que las células objetivo estén listas para agregarse.

Después del período de incubación, retire las células objetivo de la incubadora y lávelas con 5 mililitros de FBS para eliminar el exceso de cromo 51. Luego, coloque el tubo en una centrífuga designada y gire a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el lavado radiactivo de FBS en un contenedor de residuos adecuado y repita el paso de lavado volviendo a suspender el pellet en 5 mililitros nuevos de FBS. Coloque el tubo en una centrífuga designada y vuelva a hacer girar las celdas a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el segundo lavado y compruebe si el pellet tiene radiactividad incorporada con un contador Geiger. Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio completo y vierta la suspensión de células objetivo etiquetada con Chromium 51 en un depósito de reactivo desechable. Luego, agregue 100 microlitros de estas células objetivo marcadas a cada pocillo de la placa de celdas efectoras de 96 pocillos. A continuación, añada 100 microlitros de NP-40 al 1% en agua a los pocillos de la fila H para lisar todas las células objetivo de cada hilera. Estos pozos se utilizarán como control para determinar los recuentos totales por minuto, o cpm.

Ahora que el plato está preparado, asegure la tapa agregando un pequeño trozo de cinta adhesiva a cada lado del plato y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene cromo 51. Luego, coloque la placa en una centrífuga marcada para manejar muestras radiactivas. Si solo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga. Ajuste la centrífuga a 1200 rpm y ponga la placa a la velocidad. Una vez a la velocidad, detenga la máquina. Retire la placa de la centrífuga. Luego, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados con una pequeña pieza de protección de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 horas para permitir que las células objetivo se lisen.

Al final del período de incubación, retire con cuidado la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa. A continuación, coloque el marco de recolección en la placa asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro estén en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Ahora, presione lenta y suavemente los tapones de algodón en los pozos. Después de aproximadamente diez segundos, libere la presión sobre los tapones de algodón y luego transfiera los tapones de algodón a tiras de tubo. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario. Finalmente, cargue los tubos FACS en un contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de cromo 51 liberado en cada condición. Registre cuidadosamente el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.

Aquí, se agregaron PBMC no estimulados a los primeros 3 carriles y PMBC estimulados por CPG a los carriles 4 a 6. En este ejemplo, los recuentos por minuto se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original y se calcularon los promedios de los triplicados. Por ejemplo, para la primera condición, las celdas A1, A2 y A3 se promediaron en la celda I3. Una vez que se determinan los promedios, se puede calcular el porcentaje de lisis específica para cada condición utilizando esta fórmula. Por ejemplo, para calcular el porcentaje de lisis específica para las células no estimuladas que tenían una proporción de 50 a 1 células efectoras con respecto a las células diana, el CPM espontáneo, que en este ejemplo es 1164,67, se restó del CPM experimental, 1129. 67. Este número se puede dividir por la diferencia entre el CPM máximo y el CPM espontáneo, y luego multiplicar por 100 para obtener el porcentaje de lisis específica. A continuación, se calcula para cada condición. Estos datos se pueden graficar para mostrar la comparación de la relación E a T con el porcentaje de lisis específica tanto para las PBMC no estimuladas como para las PBMC estimuladas por CPG. En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CPG mataron de forma más eficaz a las células diana a medida que aumentaba la proporción de células efectoras con respecto a las células diana. Este aumento no se observó en las PBMC no estimuladas, lo que indica que la estimulación de CPG es necesaria para el aumento observado en la lisis de las células diana.