Microscopía y tinción: Tinción de Gram, cápsula y endosporas

1. Tinción de Gram

1. Configuración
   1. Use guantes y una capa de laboratorio no inflamable, ya que los colorantes mancharán las manos y la ropa.
   2. Un quemador Bunsen se utiliza para fijar el calor de las bacterias. Tenga cuidado al trabajar con llamas; atar el pelo largo.
   3. Se utilizarán reactivos de tinción de Gram disponibles comercialmente.
   4. Limpie las guías del microscopio con toallitas de laboratorio.
2. Protocolo
   1. Pipet 10 L fosfato salina tamponada o caldo de cultivo en tobogán.
   2. Unta una colonia bacteriana en el líquido para producir una capa uniforme delgada.
      Nota: No utilice cultivos de más de 24 horas, ya que las bacterias demasiado viejas podrían tener cambios en la pared de su célula que afectarán los resultados de la mancha de Gram (1, 4).
   3. Tobogán completamente seco al aire.
   4. Una vez secas, las bacterias de reparación de calor al pasar diapositiva a través de la llama (bacterias lado hacia arriba) 4-5 veces.
      Nota: No sostenga el portaobjetos en la llama demasiado tiempo o puede distorsionar las células bacterianas (1).
   5. Trabajando sobre el fregadero, sostenga el nivel de la diapositiva y aplique el Cristal Violet de Gram para cubrir completamente las bacterias fijas al calor, permita que se mantengan de pie 45 segundos.
   6. Enjuague el exceso de Cristal Violet sosteniendo el portaobjetos en un ángulo y chorros de agua sobre el tobogán y dejándolo correr sobre las bacterias manchadas. No chorro de agua directamente sobre las bacterias.
   7. Sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplique la solución de yodo de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas, permita que se mantenga de pie 45 segundos.
   8. Enjuague el exceso de yodo como en el paso 1.2.6 anterior.
   9. Mientras sostiene la diapositiva en un ángulo, agregue unas gotas de decolorante a la diapositiva, dejándola gotear hacia abajo sobre las bacterias manchadas hasta que la escorrenza esté clara; por lo general, unos 5 segundos. Enjuague inmediatamente con agua como en el paso 1.2.6 anterior.
      Nota: Este es un paso crítico en el protocolo. Permitir que Decolorizador gotear demasiado tiempo o no lo suficiente resultará en falsa tinción de Gram (4).
   10. Sosteniendo el nivel de la diapositiva de nuevo, aplicar Safranin de Gram para cubrir completamente las bacterias, dejar reposar 45 segundos.
   11. Enjuague el exceso de Safranin como en el paso 1.2.6 anterior.
   12. Blot, no frote, exceso de agua de la diapositiva usando toallas de papel.
   13. Examine la diapositiva en el microscopio utilizando la inmersión en aceite con un objetivo 100X.
3. Resultados y análisis de datos
   1. Las bacterias gram-positivas mancharán el púrpura.
   2. Las bacterias gramnegativas mancharán el rojo.
   3. La forma (cocci, bacilos, varillas curvas, espirales) de las bacterias será visible.
   4. La disposición de las células bacterianas (células únicas, células emparejadas, cadenas de células, racimos, agrupaciones) será visible.

2. Tinción de cápsulas

1. Configuración
   1. Use guantes y un abrigo de laboratorio mientras los colorantes manchan las manos y la ropa.
   2. Para preparar una solución de Cristal Violet al 1%, mezcle 0,25 gramos de cristal violeta con 25 ml de agua destilada hasta que se disuelva.
   3. Para preparar una solución de 1% Congo Rojo, mezcle 0,25 gramos de Congo Rojo con 25 ml de agua destilada hasta que se disuelva.
   4. Limpie las guías con toallitas de laboratorio.
2. Protocolo
   1. Coloque 10 l Congo Rojo en el tobogán.
   2. Usando una punta de pipeta, frota una colonia bacteriana en el tinte para producir una capa uniforme delgada.
   3. Tobogán completamente seco al aire con mezcla de tinte/célula, 5-7 minutos.
      Nota: No fijar el calor ya que la calefacción puede deshidratar o distorsionar la cápsula.
   4. Inunda el frotis con un 1% de cristal violeta durante 1 minuto.
   5. Enjuague el exceso de manchas sosteniendo el portaobjetos en un ángulo y chorros de agua sobre el tobogán y dejándolo correr sobre las bacterias manchadas. No chorro de agua directamente sobre las bacterias.
   6. Sostenga el portaobjetos en un ángulo de 45 grados hasta que esté completamente secado al aire.
   7. Examine el frotis en el microscopio bajo inmersión en aceite con un objetivo 100X.
3. Resultados y análisis de datos
   1. Las células bacterianas mancharán el púrpura.
   2. El fondo de la diapositiva se manchará oscuro.
   3. Las cápsulas serán un halo claro alrededor de las células sobre un fondo oscuro.

3. Mancha de endospora (método Schaeffer-Fulton)

1. Configuración
   1. Use guantes y bata de laboratorio no inflamable para proteger las manos y la ropa de los colorantes y las llamas.
   2. Un quemador Bunsen se utiliza para fijar el calor de las bacterias. Tenga cuidado al trabajar con llamas; atar el pelo largo.
   3. Para preparar 0.5% Malachite Green solución, mezclar 0.125 gramos Malachite Green con 25 ml de agua destilada hasta que se disuelva.
   4. Utilice la solución de reactivo Safranin de Gram, disponible en el uso comercial.
   5. Limpie las guías con toallitas de laboratorio.
2. Protocolo
   1. Pipet 10 l fosfato salina tamponada (PBS) o caldo de cultivo en tobogán.
   2. Usando una técnica aséptica, frote una colonia bacteriana en el líquido para producir una capa uniforme delgada.
      Nota: Las endosporas generalmente no se forman en células jóvenes, por lo tanto, se recomienda que el cultivo tenga entre 18 y 36 horas (9).
   3. Tobogán completamente seco al aire.
   4. Fije el calor pasando la diapositiva (bacterias hacia arriba) a través de la llama 4-5 veces.
   5. Para ayudar a contener el tinte, coloque un pedazo de papel de lente (cortado para ajustarse al frotis bacteriano) sobre el frotis de calor fijo.
   6. Saturar el papel de lente con la solución Malachite Green.
   7. Coloque el deslice encima del vaso de precipitados de agua hirviendo en una placa caliente y toque de vapor durante 5 minutos, manteniendo el papel de la lente húmedo agregando más tinte una gota a la vez según sea necesario.
      Nota: Evite sobrecalentar y secar la solución de tinte.
   8. Retire la diapositiva del vaso de precipitados, retire y deseche el papel de la lente, deje que la diapositiva se enfríe 2 minutos.
   9. Sosteniendo el portaobjetos en un ángulo, enjuague bien chorros de una corriente de agua suave e indirecta sobre el portaobjetos, lo que le permite drenar hacia abajo sobre el frotis.
   10. Sosteniendo el nivel de deslizamiento, frotis de inundación con Safranin, dejar reposar 1 minuto.
   11. Enjuague el exceso de Safranin como en el paso 3.2.9 anterior.
   12. Dejar secar al aire.
   13. Examine la diapositiva en el microscopio bajo inmersión en aceite con un objetivo 100X.
3. Resultados y análisis de datos
   1. Las esporas mancharán de verde.
   2. Las células vegetativas mancharán el rojo.
   3. Algunas células vegetativas contendrán esporas; las células se mancharán de color rojo, mientras que las endosporas se mancharán de color verde.