Microscopía y tinción: Tinción de Gram, cápsula y endosporas

Las bacterias son organismos vivos microscópicos que tienen muchas características distintivas, como la forma, la disposición de las células, si producen o no cápsulas y si forman esporas. Todas estas características se pueden visualizar mediante tinción y ayudan en la identificación y clasificación de diferentes especies bacterianas.

Para examinar las dos primeras características de la forma y disposición de las células, podemos utilizar una técnica sencilla llamada tinción de Gram. Aquí, el violeta cristalino se aplica a las bacterias, que se han fijado con calor en un portaobjetos. A continuación, la solución de yodo de Gram se añade al portaobjetos, lo que da lugar a la formación de un complejo insoluble entre el violeta cristalino y la solución de yodo de Gram. A continuación, se aplica un decolorante y cualquier bacteria con una capa gruesa de peptidoglicano se teñirá de color púrpura, ya que el decolorante no penetra fácilmente en esta capa. Estas bacterias se conocen como Gram-positivas.

Las bacterias gramnegativas tienen una capa más delgada de peptidoglicano y eliminarán las manchas del decolorante, perdiendo el color púrpura. Sin embargo, se teñirán de color rosa rojizo cuando se agregue una contratinción de safranina, que se une a una capa de lipopolisacárido en su exterior. Una vez teñidas, se puede observar la morfología, el tamaño y la disposición de las células, como en cadenas o grupos, lo que ayuda aún más en la clasificación e identificación.

Otra técnica útil en el kit de herramientas del microbiólogo es la tinción de cápsulas, utilizada para visualizar cápsulas externas que rodean algunos tipos de células bacterianas. Debido a la composición no iónica de la cápsula y a su tendencia a repeler las manchas, los métodos de tinción simples no funcionarán. En su lugar, se utiliza una técnica de tinción negativa, que primero tiñe el fondo con un colorante ácido, como el rojo Congo, antes de que las células bacterianas se tiñan con violeta cristalino. Esto deja cualquier cápsula presente como un halo transparente alrededor de las células.

La última técnica de tinción importante que se trata aquí puede ayudar a determinar si las bacterias que se están estudiando forman esporas. En condiciones adversas, algunas bacterias producen endosporas, estructuras latentes, resistentes, no reproductivas, cuya función principal es garantizar la supervivencia de las bacterias durante períodos de estrés ambiental, como temperaturas extremas o deshidratación. Sin embargo, no todas las especies bacterianas producen endosporas, y son difíciles de teñir con técnicas estándar porque son impermeables a muchos tintes. El método Schaeffer-Fulton utiliza el tinte verde de malaquita, que se aplica a las bacterias fijadas a un portaobjetos. A continuación, el portaobjetos se lava con agua antes de contrateñirlo con safranina. Las células vegetativas aparecerán de color rojo rosado, mientras que las endosporas presentes aparecerán verdes. En este video, aprenderá cómo realizar estas técnicas comunes de tinción bacteriana y luego examinará las muestras de tinción mediante microscopía óptica.

Para comenzar el procedimiento, recoja el cabello largo y póngase el equipo de protección personal adecuado, que incluye una bata de laboratorio y guantes.

Luego, limpie un portaobjetos de microscopio nuevo con una toallita de laboratorio. A continuación, pipetee 10 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1X en el primer portaobjetos. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta la colonia bacteriana en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Coloque el portaobjetos en la mesa de trabajo y deje que se seque completamente al aire.

Una vez seco, encienda un mechero Bunsen para fijar las bacterias con calor. Con unas pinzas, pase la corredera a través de la llama del quemador varias veces, con las bacterias hacia arriba, teniendo cuidado de no mantener la corredera en la llama demasiado tiempo, lo que puede distorsionar las células.

Ahora, trabajando sobre el fregadero, sostenga el portaobjetos nivelado y aplique varias gotas de violeta cristalino de Gram para cubrir completamente el frotis bacteriano y luego coloque el portaobjetos en el banco para que permanezca reposado durante 45 segundos. A continuación, sostenga el portaobjetos en ángulo y rocíe suavemente un chorro de agua en la parte superior del portaobjetos, teniendo cuidado de no rociar directamente el frotis bacteriano. Ahora, sosteniendo el portaobjetos nivelado nuevamente, aplique la solución de yodo de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas y luego déjela reposar durante otros 45 segundos. A continuación, enjuague cuidadosamente el yodo del portaobjetos, como se muestra anteriormente. Mientras sostienes el portaobjetos en ángulo, agrega unas gotas del decolorante de Gram al portaobjetos, permitiendo que se escurra sobre las bacterias manchadas, solo hasta que la escorrentía esté clara, durante aproximadamente 5 segundos. Inmediatamente, enjuague con agua como se muestra anteriormente. Esto limitará la decoloración excesiva de la mancha. A continuación, manteniendo el portaobjetos nivelado de nuevo, aplique la contratinción de safranina de Gram para cubrir completamente las bacterias manchadas. Después de 45 segundos, enjuague suavemente la Safranina del portaobjetos con agua, como se muestra anteriormente, y luego seque con toallas de papel.

Finalmente, agregue una gota de aceite de inmersión directamente al portaobjetos y luego examínelo con un microscopio óptico con una lente de objetivo de aceite 100X.

Para comenzar este protocolo de tinción, primero colóquese el equipo de protección personal correcto y luego asegúrese de que los portaobjetos de vidrio que se utilizarán estén limpios.

A continuación, prepare las soluciones. Para hacer una solución de cristal violeta al 1%, mezcle 0,25 gramos de polvo de cristal violeta con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. A continuación, prepare una solución de rojo Congo al 1% mezclando 0,25 gramos de polvo de rojo Congo con 25 mililitros de agua destilada y vórtice hasta que se disuelva. Ahora, pipetea 10 microlitros de la solución de rojo Congo en el portaobjetos. Con una punta de pipeta limpia y estéril, seleccione una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Luego, unta la colonia bacteriana en el tinte para producir una capa delgada y uniforme. Seque completamente al aire el portaobjetos bacteriano durante 5-7 minutos. Una vez que el portaobjetos esté seco, inunda el frotis con suficiente 1% de violeta cristalino para cubrir el frotis y déjelo reposar durante 1 minuto. Ahora, sostenga el portaobjetos en ángulo y rocíe suavemente un chorro de agua en la parte superior del portaobjetos, teniendo cuidado de no rociar las bacterias directamente. Continúe sosteniendo el portaobjetos en un ángulo de 45 grados hasta que se seque completamente al aire. Finalmente, agregue una gota de aceite de inmersión directamente al portaobjetos y luego examínelo con un microscopio óptico con un objetivo de aceite 100X.

Para realizar la tinción de endosporas, primero, prepare una solución verde de malaquita al 0,5% mezclando 0. 125 gramos de polvo verde de malaquita con 25 mililitros de agua destilada, y luego vórtice la solución hasta que se disuelva. A continuación, pipetee 10 microlitros de 1X PBS en el centro del portaobjetos. A continuación, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB. Unta las bacterias en el líquido para producir una capa delgada y uniforme. Ahora, coloque el portaobjetos en la mesa de trabajo y deje que se seque completamente al aire. Una vez seco, encienda un mechero Bunsen para fijar las bacterias con calor. Pase la corredera a través de la llama azul del quemador varias veces, con el lado de las bacterias hacia arriba. Luego, una vez que el portaobjetos se haya enfriado, coloque un trozo de papel de lente precortado sobre la mancha fijada con calor. A continuación, encienda una placa calefactora a la temperatura más alta y hierva un vaso de precipitados con agua.

Sature el papel de la lente con la solución verde de malaquita y, con unas pinzas, coloque el portaobjetos encima del vaso de precipitados con agua hirviendo para que cocine al vapor durante 5 minutos. Mantenga el papel de la lente húmedo agregando más tinte, una gota a la vez, según sea necesario. A continuación, de nuevo con unas pinzas, coja la diapositiva del vaso de precipitados y retire y deseche el papel de las lentes. Deje que el portaobjetos se enfríe durante 2 minutos. Trabajando sobre el fregadero, sostenga el tobogán en ángulo y rocíe suavemente un chorro de agua en la parte superior del tobogán. Ahora, mantenga el portaobjetos nivelado y aplique Safranin para cubrir completamente el portaobjetos. Luego, déjalo reposar durante 1 minuto. A continuación, sostenga el portaobjetos en ángulo y enjuague como se muestra anteriormente. Deje que el portaobjetos se seque al aire en la mesa de trabajo. Finalmente, agregue una gota de aceite de inmersión directamente al portaobjetos y luego examínelo con un microscopio óptico, con un objetivo de aceite 100X.

En el protocolo de tinción de Gram, pueden producirse manchas de dos colores diferentes. La tinción de color púrpura oscuro indica que las bacterias son Gram-positivas y que han retenido la tinción de color violeta cristalino. Por el contrario, la tinción de color rosa rojizo es una característica de las bacterias gramnegativas, que en cambio serán coloreadas por la contratinción de safranina. Además, se pueden visualizar diferentes formas y disposiciones de bacterias después de la tinción de Gram. Por ejemplo, es posible diferenciar los cocos, o bacterias redondas, de los bacillus en forma de bastoncillos, o identificar las bacterias, que forman hebras, en comparación con las que normalmente se agregan como grupos o se presentan individualmente.

En una imagen de microscopio teñida con cápsula, las células bacterianas generalmente se teñirán de color púrpura y el fondo del portaobjetos debe teñirse de oscuro. Sobre este fondo oscuro, las cápsulas de las bacterias, si están presentes, aparecerán como un halo claro alrededor de las células.

Por último, en la tinción de endosporas, las células vegetativas se teñirán de rojo con la contratinción de safranina. Si hay endosporas presentes en la muestra, estas conservarán la mancha verde malaquita y aparecerán de color verde azulado.