Amplificación rápida de los extremos del ADNc

1. Experimento configurado para 3' RACE

1. Diseñe un cebador específico 5' para un gen de interés (cebador específico del gen 1, GSP-1). Debe ser muy específico, ya que es el único cebador que introduce especificidad. Por lo tanto, sería preferible un cebador relativamente largo (longitud típica de alrededor de 24 nucleótidos, Tm que oscila entre 55 y 65 °C).
2. Diseñe un segundo cebador anidado (GSP-2), es decir, el cebador debe estar ubicado a 3' de GSP-1. Este paso es opcional, pero realizar una segunda PCR con un cebador anidado aumentará el rendimiento y la especificidad de la PCR para el gen de interés. Los cebadores utilizados para amplificar los ADNc de dSmad2 se enumeran en la Tabla 2.

2. Síntesis de ADNc

1. Extraiga el ARN de las muestras, utilizando un método o kit de extracción de ARN siguiendo el protocolo del fabricante. Tratar las muestras con DNasa para evitar la amplificación del ADN genómico. En nuestro ejemplo, extrajimos ARN de 10 moscas adultas enteras.
2. Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro de microvolumen y ajústela con agua libre de ARNasa a un máximo de 100 ng/μl si es necesario.
3. Prepare el ADNc en una reacción de transcripción inversa (RT), utilizando un kit recomendado para RACE. Prepare una mezcla maestra, con los siguientes reactivos por muestra:
   - 4 μl Tampón de transcripción inversa (5x)
   - 2 μl de cebador Oligo(dT)₂₀ (un oligo compuesto por 20 desoxitimidinas)
   - 10 μl de ARN (máx. 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl de transcriptasa inversa
   - TOTAL: 20 μl
4. Incubar la reacción durante 90 min a 42ºC. Incluir un control negativo omitiendo la transcriptasa inversa.
5. Inactivar la transcriptasa inversa incubando a 85ºC durante 5 min.
6. Con el fin de diluir los niveles de ADN para una PCR eficiente, agregue 80 μl de tampón TE para llevar el volumen total a 100 μl.

3. Amplificación de fragmentos de ADNc

1. Prepare la mezcla de PCR de amplificación de primera ronda mediante el uso de una polimerasa Taq de alta fidelidad (HF):
   - 4 μl 5x tampón de polimerasa HF Taq
   - 0,4 μl de mezcla dNTP (10 mM cada una)
   - 1 μl de cebador GSP1 (10 μM)
   - 1 μl de cebador Oligo(dT)20 (10 μM)
   - 1 μl de plantilla de ADNc
   - 0,2 μl de ADN polimerasa HF Taq
   - 12,4 μl ddH2O
   - Total: 20 μl
2. Ejecute la PCR utilizando el programa PCR1 (Tabla 1). Incluya un control negativo utilizando como plantilla el producto de ARN original sin RT. Además, se puede incluir un control 'sin cebador'.
3. Opcional: PCR anidada para aumentar la especificidad y la cantidad de productos de ADNc. Diluir 1 μl de los productos de PCR y control negativo 1:20 en tampón TE. Utilícelos como plantilla para las segundas reacciones de PCR:
   - 4 μl 5x tampón de polimerasa HF Taq
   - 0,4 μl de mezcla dNTP (10 mM cada una)
   - 1 μl de imprimación GSP2 (10 μM)
   - 1 μl de cebador Oligo(dT)₂₀ (10 μM)
   - 1 μl de plantilla de producto PCR
   - 0,2 μl de ADN polimerasa HF Taq
   - 12,4 μl ddH2O
   - Total: 20 μl
4. Ejecute la segunda PCR con el programa PCR2 (Tabla 1)

4. Aislamiento de fragmentos de ADNc

1. Prepare un gel de agarosa al 1-2% con tampón TAE, utilizando bromuro de etidio o una tinción de ADN alternativa.
2. Mezclar 5 μl de muestra con 1 μl de tampón de carga de gel 6x.
3. Cargue las muestras y la escalera de ADN de 1 kb como marcador y haga funcionar el gel a 120 V durante unos 45 minutos o hasta que el frente del tinte esté ~ 75% del camino hacia abajo del gel. Asegúrese de que las muestras no se queden sin el gel.
4. Revise las bandas de gel debajo de una lámpara UV. Para el procesamiento posterior de los productos, utilice UV de baja intensidad, localice las bandas amplificadas y córtelas del gel con un bisturí.
5. Purifica el ADN del gel mediante el uso de un método como la congelación o un kit.
6. Almacene los fragmentos de ADNc purificados a -20ºC o utilícelos inmediatamente para aplicaciones posteriores, como la secuenciación o la clonación.