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Por lo general, con los nuevos ARNm solo se conoce una parte de su secuencia completa. Las secuencias de nucleótidos faltantes en los extremos del ARNm se pueden determinar mediante un método basado en PCR llamado amplificación rápida de extremos de ADNc o RACE.
En los eucariotas, los ARNm maduros tienen características estructurales distintivas en ambos extremos. En el extremo de cinco primos, la mayoría tiene un residuo de guanosina metilada conectado al ARNm a través de un enlace trifosfato de cinco primos a cinco primos. Esto también se conoce como el límite de cinco primos. En el extremo de los tres primos, la mayoría de los eucariotas tienen una cola de 20 a 250 residuos de adenilato, llamada cola de poli(A).
Ahora, si la secuencia de nucleótidos de incluso un pequeño segmento se conoce en cualquier parte del ARNm, la secuencia hasta su extremo de tres primos se puede amplificar utilizando un cebador específico de gen y un cebador oligo(dT) no específico que se recocen a la cola de poli(A) en el extremo de tres primos. Este subconjunto de la técnica RACE se denomina RACE de tres primos, y permite la detección de variantes de transcripción y diferentes regiones no traducidas de tres primos, o UTR.
La secuencia en el extremo de los cinco primos se puede amplificar de manera similar. Para hacer esto, primero se une una cola de poli (A) en el extremo de los cinco primos. Luego, usando un cebador oligo(dT) no específico que se recoce a la cola añadida y un cebador específico de un gen, se puede amplificar la secuencia hasta el extremo de los cinco primos. Este subconjunto de RACE se conoce como RACE de cinco primos y se utiliza para encontrar variantes de empalme diferenciales de cinco primos y UTR alternativas de cinco primos.
Para realizar RACE de tres primos para identificar diferentes transcripciones codificadas por un gen determinado, primero se aísla el ARN del organismo o tejido de interés. A continuación, el ADNc se sintetiza a partir de los ARNm aislados con una reacción de transcripción inversa que utiliza un cebador de oligo(dT) y una enzima de transcriptasa inversa, que genera ADN complementario a partir de una plantilla de ARN. A continuación, a partir del grupo generado de ADNc, el extremo desconocido de tres primos del ADNc objetivo se extiende mediante PCR, utilizando el cebador oligo(dT) no específico y un cebador específico del gen, y se amplifica durante la reacción de PCR.
Sin embargo, debido a la naturaleza genérica del cebador no específico y al mal cebado aleatorio por el cebador específico del gen, pueden recocer a ADNc fuera del objetivo, lo que hace que también se amplifiquen. Para superar este problema, se lleva a cabo una segunda ronda de PCR utilizando cebadores anidados, que se unen aguas abajo del primer conjunto de cebadores. Este segundo conjunto de cebadores amplifica aún más el ADNc de interés, pero no el producto no específico, lo que aumenta la especificidad y el rendimiento de la reacción.
Finalmente, los productos de PCR se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, que separa diferentes transcripciones del gen objetivo en función de sus tamaños, produciendo bandas distintas. A continuación, la banda de interés puede ser extirpada, purificada y finalmente secuenciada para obtener la secuencia completa de la transcripción.
En este vídeo, demostraremos la técnica RACE de tres primos para identificar y aislar diferentes transcripciones codificadas por el gen dSmad2 de Drosophila.
Antes de comenzar la síntesis y amplificación del ADNc, utilice un software de diseño de cebadores para crear un cebador específico de cinco primos para el gen de interés, dSmad2 en este ejemplo. Para garantizar que el cebador sea altamente específico, debe tener alrededor de 24 nucleótidos y una Tm que oscile entre 55 y 65 grados Celsius. A continuación, diseñe un segundo cebador anidado ubicado a tres primos del primer cebador, que también es específico para la secuencia objetivo.
Para comenzar, extraiga ARN de 10 moscas adultas enteras con un kit de extracción de ARN disponible comercialmente. Una vez extraído el ARN, resuspender el pellet en 20 microlitros de agua libre de nucleasas. Para una reacción de 50 microlitros, agregue 5 microlitros del tampón de reacción a cada tubo de muestra y aumente el volumen de la reacción agregando 24 microlitros de agua sin nucleasa. A continuación, añadir 1 microlitro de DNasa I para evitar la amplificación del ADN genómico. Finalmente, incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
Después del tratamiento con DNasa, inactivar la enzima con 1 microlitro de EDTA de 25 milimolares en cada uno de los tubos. Agregue la muestra a una columna de centrifugación para purificar el ARN. A continuación, utilice un espectrofotómetro de microvolumen para medir la concentración de ARN. Ajuste la concentración a 100 nanogramos por microlitro agregando agua sin nucleasa.
Ahora, prepara una mezcla maestra para la reacción de transcripción inversa. Además de las muestras de ADN de prueba, incluya un testigo negativo omitiendo la transcriptasa inversa del tubo apropiado. Incubar las reacciones durante 90 minutos a 42 grados centígrados. A continuación, inactiva la transcriptasa inversa incubando los tubos a 85 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, diluya los niveles de ADN añadiendo 80 microlitros de tampón TE a cada tubo para llevar el total de la reacción a 100 microlitros.
Ahora que se sintetiza el ADNc, amplifique el gen de interés mediante PCR. Para hacer esto, primero prepare la primera ronda de mezcla de PCR de amplificación. Además de la plantilla de ADNc, incluya una reacción de control negativo que utilice la plantilla del producto no transcrito inverso, así como una reacción que no tenga el cebador específico del gen como control sin cebador.
Una vez preparadas las reacciones, realice amplificaciones de PCR en un termociclador equipado con una tapa calentada. A continuación, diluya los productos del 1 al 20 añadiendo 1 microlitro de los productos PCR a 19 microlitros de tampón TE. Con estos productos diluidos, prepare la mezcla de PCR de amplificación de segunda ronda. A continuación, utilice un termociclador para ejecutar la segunda PCR.
Para aislar los fragmentos de PCR, prepare un gel de agarosa al 1% añadiendo 1 gramo de agarosa por cada 100 mililitros de tampón TAE. Derrita la mezcla durante dos minutos en el microondas y luego agregue SYBR Safe stain o bromuro de etidio. Vierta la mezcla fundida en una bandeja de gel y deje que se asiente.
Mientras el gel se está endureciendo, pipetee 1 gota de microlitros de tinte de carga 6X en una pieza de parafilm correspondiente al número de muestras. Agregue 5 microlitros de muestra a cada gota. Ahora, cargue las muestras, junto con una escalera de ADN de 1 kilobase, en el gel. Ejecuta el gel a 120 voltios durante aproximadamente 45 minutos o hasta que el frente del tinte esté al 75% del camino hacia abajo del gel.
Cuando el gel haya terminado de correr, revise las bandas de gel debajo de un transiluminador UV. Localiza las bandas y córtalas con un bisturí. Purifique los fragmentos de ADNc utilizando un kit de columna de centrifugación disponible en el mercado. Una vez purificados, los fragmentos de ADNc pueden almacenarse a menos 20 grados centígrados o utilizarse inmediatamente para su posterior análisis.
Antes de este experimento, se anotaron dos transcripciones de Drosophila dSmad2 en la base de datos genómica de Drosophila, FlyBase. Sobre la base del empalme esperado de este gen, se deben identificar dos productos mediante el protocolo RACE de tres primos.
Los resultados de este experimento, sin embargo, revelan tres transcripciones diferentes para dSmad2. Entre los productos predichos, predomina una transcripción y otra se expresa en un nivel inferior. Además, se detectó un producto más pequeño no descrito anteriormente, visible a 750 pares de bases.
