Name: El análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con Transcriptómica Ambiental (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Aprende a generar cDNA a partir de ARN ambiental de comunidades microbianas marinas mediante transcriptómica ambiental. Este método computacional permite analizar la expresión génica en ecosistemas marinos.

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El financiamiento fue proporcionado por la Gordon and Betty Moore Foundation y subvenciones de la National Science Foundation MCB-0702125.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

La investigación de la expresión génica de las comunidades microbianas naturales se ha vuelto común en los últimos años como un medio para explorar los roles y funciones ecológicas de los microorganismos. Utilizado en combinación con la detección, cuantificación y caracterización de microorganismos marinos, análisis de expresión génica puede ser utilizado para conectar la filogenia de funcionar en las comunidades microbianas naturales. Muchas de las técnicas para dirigir la expresión de genes funcionales se basan en son...

<table><tbody><tr><td>Tubos de bolas PowerSoil</td><td>kit</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini</td><td>kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de mRNA procariota mRNA-ONLY</td><td>kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de mRNA bacteriano MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>Kit MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>Kit de amplificación de ARN bacteriano MessageAmp II-Bacteria</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Sistema universal de síntesis de ADNc RiboClone</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de ADN Wizard</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con transcriptómica ambiental

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Análoga a la metagenómica, la transcriptómica del medio ambiente (metatranscriptomics) recupera y las secuencias de ARNm del medio ambiente a partir de un conjunto microbiana sin conocimiento previo de lo que los genes de la comunidad puede expresar. Por lo tanto, ofrece la perspectiva más imparcial en la expresión de genes de la comunidad<em&gt; In situ</em&gt;. Protocolos ambientales transcriptómica son técnicamente difícil, ya que los ARNm procariotas generalmente carecen de la poli (A) las colas que hacen que el aislamiento de los mensajes de eucariotas relativamente sencillo<sup&gt; 1</sup&gt; Y por la vida media relativamente corta de los ARNm<sup&gt; 2</sup&gt;. Además, los ARNm son mucho menos abundantes que en el total de rRNAs extractos de ARN, por lo tanto un fondo rRNA menudo sobrepasa las señales de ARNm. Sin embargo, las técnicas para la superación de algunas de estas dificultades se han desarrollado recientemente. Un procedimiento para analizar transcriptomes ambiental mediante la creación de bibliotecas clon usando cebadores aleatorios a inversa transcribir y ampliar los ARNm del medio ambiente fue descrito recientemente tuvo éxito en dos entornos naturales diferentes, pero los resultados estaban sesgados por la selección de los cebadores aleatorios usados ​​para iniciar la síntesis de ADNc<sup&gt; 3</sup&gt;. Los avances en la amplificación lineal de ARNm de obviar la necesidad de cebadores aleatorios en la etapa de amplificación y hacer posible el uso de menos material de partida la disminución de la recogida y el tiempo de procesamiento de las muestras y lo que minimiza la degradación del ARN<sup&gt; 4</sup&gt;.<em&gt; In vitro</emMétodos&gt; transcripción de ARNm de amplificación implican polyadenylating el ARNm y la incorporación de un promotor T7 en el extremo 3 de la transcripción. Amplifica ARN (ARNA), entonces se puede convertir en doble varados cDNA usando hexámeros al azar y secuenciado directamente por pirosecuenciación<sup&gt; 5</sup&gt;. Un primer uso de este método en la Estación ALOHA demostrado su utilidad para la caracterización de la expresión de genes microbianos comunidad<sup&gt; 6</sup&gt;.

Se presenta un método para la generación de cDNA a partir del ARNm del medio ambiente. En general, el ARN total se recogen la primera del medio ambiente, se elimina selectivamente rRNA, mRNA se amplifica de forma selectiva, y cDNA sintetizado a partir de la piscina es la secuencia de ARNm enriquecido. Secuencias recuperadas se pueden anotar utilizando las técnicas de bioinformática para identificar los genes que se expresan.

El análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con Transcriptómica Ambiental

De manera análoga a la metagenómica, la transcriptómica ambiental (metatranscriptómica) recupera y secuencia ARNm ambientales de un ensamblaje microbiano ...

Este procedimiento comienza con la adquisición de biomasa microbiana marina a partir de muestras de agua mediante prefiltración a través de filtros de cinco y tres micrómetros, seguida de la recolección en un filtro de 0,22 micrómetros. Luego se extrae ARN total de los organismos retenidos en el filtro de 0,22 micrómetros. Nuestro ARN se elimina del ARN total mediante degradación enzimática selectiva y el Mr.N enriquecido mediante hibridación sustractiva se amplifica linealmente mediante la adición de cola de poliA y transcripción in vitro.El ARN antisentido amplificado se convierte luego en ADN bicatenario utilizando hexámeros aleatorios. El ADN resultante puede clonarse y secuenciarse o someterse directamente a pirosecuenciación. Hola, soy Rachel Persky del laboratorio de la Dra. Marianne Moran en el Departamento de Ciencias Marinas de la Universidad de Georgia.Hoy vamos a mostrarle un procedimiento para analizar la expresión génica a partir de muestras ambientales, utilizando metatranscriptómica ambiental. Scott Gifford le mostrará cómo procesar muestras ambientales para la recolección de ARN.Le mostraré cómo extraer ARN de las muestras y de los RIN de Johanna. AON demostrará la

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Investigación

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Biología

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

Un método para la extracción de metabolitos microbianos de las comunidades planctónicas se presenta. Muestreo de toda la comunidad se logra por filtración en filtros especialmente preparados. Después de la liofilización, acuoso-solubles metabolitos se extraen. Este enfoque permite la aplicación de la metabolómica ambientales trans-ómicas las investigaciones de las comunidades microbianas naturales o experimentales.

La concentración de los metabolitos de las comunidades planctónicas de baja densidad para la metabolómica ambiental utilizando espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

La caracterización de la comunidad microbiana ha sido un objetivo de larga data en microbiología ambiental. Los métodos de secuenciación de próxima generación ahora permiten la caracterización de comunidades microbianas a una profundidad sin precedentes con un costo y mano de obra mínimos. Detallamos aquí nuestro enfoque para secuenciar genes de ARN ribosómico 16S bacterianos utilizando un secuenciador de sobremesa.

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

Aquí, presentamos un protocolo integral para evaluar la disponibilidad de nutrientes orgánicos e inorgánicos y la abundancia y estructura de las comunidades microbianas y virales en entornos marinos remotos.

Desentrañar los jugadores invisibles en el Océano - Guía de Campo a la química del agua y Microbiología Marina

Este manuscrito describe el uso de la tecnología de vanguardia proporcionada por los microarrays de ADN. Los microarrays proporcionan una visión general de los cambios transcriptómicos en las bacterias que se producen en una condición específica. Además, destacamos la facilidad con la que se pueden analizar grandes cantidades de datos mediante el uso de convenientes paquetes de software desarrollados internamente.

Una tubería rápida y fiable para el estudio de caso Análisis Bacteriano Transcriptome: Regulación Génica Serina-dependiente en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Este protocolo es para la extracción y concentración de proteínas y ADN de la biomasa microbiana recogida del agua de mar, seguida de la generación de péptidos trípticos adecuados para el análisis proteómico basado en espectrometría de masas en tándem.

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Desarrollamos un protocolo que es rápido, sensible y reproducible para el perfil de expresión génica de patógenos durante una infección.

Perfiles de expresión génica de los microbios Infección de Uso de una Plataforma Digital Bar-codificación

Se proporciona un protocolo para cuantificar los genes de ARNr 16S bacterianos y las transcripciones de los sedimentos costeros mediante PCR en tiempo real. La metodología incluye la co-extracción de ADN y ARN; preparación de ARN libre de ADN; y cuantificación de genes y transcripciones del ARNr 16S mediante RT-q-PCR, incluida la construcción de curvas estándar.

ADN-ARN simultánea extracción de los sedimentos costeros y cuantificación de 16S rRNA genes y las transcripciones de PCR en tiempo real

Aquí, presentamos un protocolo para investigar los impactos de la fracturación hidráulica en arroyos cercanos mediante el análisis de sus comunidades microbianas de agua y sedimentos.

Evaluación del impacto de la fracturación hidráulica en las corrientes utilizando firmas moleculares microbianas

El protocolo detecta genes clave del ciclo del metano en los humedales costeros del sur de Texas y visualiza su distribución espacial para mejorar la comprensión de la regulación del metano y sus impactos ambientales en estos ecosistemas dinámicos.

Visualización de la dinámica microbiana del ciclo del metano en los humedales costeros

Aprende a generar cDNA a partir de ARN ambiental de comunidades microbianas marinas mediante transcriptómica ambiental. Este método computacional permite analizar la expresión génica en ecosistemas marinos.

El análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con Transcriptómica Ambiental

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