El análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con Transcriptómica Ambiental

Este procedimiento comienza con la adquisición de biomasa microbiana marina a partir de muestras de agua mediante prefiltración a través de filtros de cinco y tres micrómetros, seguida de la recolección en un filtro de 0,22 micrómetros. A continuación, se extrae el ARN total de los organismos retenidos en el filtro de 0,22 micrómetros. Nuestro ARN se elimina del ARN total por degradación enzimática selectiva e hibridación sustractiva, el Mr.N enriquecido se amplifica linealmente a través de relaves de poliA y transcripción in vitro.

A continuación, el ARN antisentido amplificado se convierte en CD NA bicatenario mediante hexámero aleatorio. El CD NA resultante se puede clonar y secuenciar o directamente pirosecuenciar. Hola, soy Rachel Persky y pertenezco al laboratorio de la Dra. Marianne Moran en el Departamento de Ciencias Marinas de la Universidad de Georgia.

Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para observar la expresión génica a partir de muestras ambientales. Uso de metatranscriptómica ambiental. Scott Gifford le mostrará cómo procesar muestras ambientales para la recolección de ARN.

Te mostraré cómo extraer ARN de las muestras y de las RIN de Johanna. AON demostrará la eliminación de ARN. A continuación, Maria Kosta pasará por los pasos de amplificación de ARN y síntesis de CD NA.

Así que comencemos. Para comenzar la recolección de ARN ambiental, configuramos el sistema de línea de filtro colocando un extremo del tubo en el agua a la profundidad deseada para el muestreo y conectamos el extremo opuesto a un filtro de tres micrómetros de alto volumen colocando la bomba entre los dos extremos del tubo. A continuación, el filtro de tres micrómetros se conecta a la torre de filtro de 0,22 micrómetros y el flujo de salida se dirige desde la torre de 0,22 micrómetros a una carga graduada.

Haga correr varios litros de agua a través del sistema para enjuagar. Cuando termine, retire la tubería del agua mientras la bomba está funcionando para purgar el agua restante de la línea. A continuación, utilice un par de pinzas para colocar un filtro de 0,22 micrómetros en la torre del filtro y ciérrelo.

Vuelva a colocar el extremo de la línea en el agua y encienda la bomba. Permita que el aire se purgue de ambos filtros y controle el volumen de agua filtrada con el en la garrafa. Una vez que se haya filtrado el volumen deseado, retire la línea del agua y extraiga el agua restante del sistema.

Tan pronto como el filtro esté seco, retire rápidamente la placa del filtro superior y doble el papel de filtro. Coloque el filtro en un paquete giratorio y congele a presión en nitrógeno líquido. Antes de comenzar el experimento, es importante tener en cuenta que debido a que los ARN son ubicuos y los ARNm se degradan rápidamente, se deben seguir las precauciones estándar para trabajar en un entorno libre de ribonucleasas, incluidas las superficies de trabajo y las pipetas.

Con esto en mente, se deben usar guantes limpios cuando se manipule cualquier material utilizado en este procedimiento. Y las muestras deben procesarse en el menor tiempo posible. Para comenzar la extracción de ARN total del filtro de 0,22 micrómetros, preparamos tubos de perlas añadiendo ocho mililitros de tampón RLT con betametanol añadido a un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego se agregan de uno a dos mililitros de perlas de ARN de un kit móvil de extracción de suelo eléctrico. Retire rápidamente el filtro congelado del congelador y guárdelo en el paquete mundial. Rómpelo con un mazo.

Agregue el filtro roto al tubo cónico de 50 mililitros preparado y selle la tapa del tubo con perfume o cinta de laboratorio durante 10 minutos. A continuación, centrifugar el tubo de 50 mililitros a 5.000 rpm durante un minuto. A temperatura ambiente, retire la mayor cantidad posible de lisado y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros antes de volver a centrifugar durante cinco minutos.

A 5.000 veces G, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo de 50 mililitros y se añade un volumen de etanol al 100% al lisado. Con una jeringa de 10 mililitros, extraiga el lisado a través de una aguja de calibre 18 a 21 y páselo de nuevo unas cinco veces. Pasos de extracción posteriores, utilice el KaiGen R y el easy mini kit siguiendo las instrucciones del fabricante, aplicando el lisado a la columna suministrada con el colector de vacío o con centrifugación repetida.

Cuantificar fotométricamente el espectro de ARN total. Después de determinar el rendimiento total de ARN, utilizamos el kit turbo DNA free de Ambien de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar cualquier contaminación de ADN. Ahora que se completan las extracciones de ARN, voy a entregar el ARN total a Johanna, quien va a realizar el primer y segundo paso de eliminación de ARN.

Gracias Rachel. Para comenzar la eliminación de ARN, mezcle suavemente y centrifugue brevemente el ARNm solo 10 veces el tampón de reacción antes de usarlo en un tubo estéril de 0,5 mililitros libre de ARN, combine los volúmenes apropiados de 10 veces tampón de reacción, inhibidor de ARN, muestra de ARN total y exonucleasa terminadora. De acuerdo con el protocolo del epicentro, incubar la reacción a 30 grados centígrados durante 60 minutos en un termociclador con tapa caliente o baño de agua.

A continuación, finalice la reacción con una precipitación de etanol fenólico agregando primero agua libre de ARN a un volumen total de 200 microlitros y luego agregando un volumen de una solución de cloroformo de fenol uno a uno a la centrífuga de ARNm. Recoja la fase acuosa y luego precipite con etanol al cien por cien y asalto. Este es un posible punto de parada.

El ARN se puede almacenar a menos 80 grados Celsius hasta que uno esté listo para usar la muestra en aplicaciones posteriores. Una vez que hayamos completado el primer enriquecimiento de ARNm, utilizaremos los kits de enriquecimiento de microbios y microbios exprés de Ambien de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar cualquier ARNr residual de nuestra muestra. Para facilitar la eliminación del ARNr eucariota, utilizaremos el kit de enriquecimiento de microbios.

Todos los volúmenes se determinan leyendo las instrucciones del fabricante. Para comenzar la pipeta, coloque 300 microlitros de tampón aglutinante en un tubo de 1,5 mililitros. Agregue de cinco a 100 microgramos de ARN total en un volumen máximo de 30 microlitros y vórtice.

Agregue suavemente dos microlitros de mezcla de oligonucleótidos de captura para obtener cinco microgramos de ARN en tampón de unión y golpee suavemente el tubo. Gira brevemente la mezcla. Desnaturalice la mezcla a 70 grados centígrados durante 10 minutos antes de arrodillar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora.

Durante esta incubación, prepare las perlas de oligo mag lavándolas una vez en agua libre de nucleasas y otra vez en tampón de unión y capturando las perlas en un soporte magnético entre lavados. Guarde las cuentas en hielo y caliéntelas a temperatura ambiente. Cinco minutos antes de usar, caliente la solución de lavado a 37 grados centígrados en un bloque de calor.

Agregue la mezcla de oligonucleótidos de captura de ARN a las perlas de oligo mag lavadas, entierre suavemente, mezcle el tubo y gire. Incuba brevemente la mezcla a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere unos tres minutos antes de aspirar el ARNm que contiene el sobrenadante y luego transferirlo a un tubo de recolección en hielo.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución de lavado precalentada a las perlas capturadas. Y suavemente el vórtice captura las cuentas y recupera al tonto sobrenadante. Este sobrenadante con Mr.NA en el tubo de recolección sobre hielo.

Coloque un tubo de recolección en hielo mientras se prepara para eliminar el ARNr procariota con el kit exprés de microbios ambi, que usaremos para eliminar el ARNr procariota residual. Utilice el bioanalizador o Experion para comprobar si hay contaminación por ARNr y RM. Calidad NA. Este es un posible punto de parada.

El ARN se puede almacenar a menos 80 grados centígrados. Una vez eliminado el ARNr, utilizaremos el kit de bacterias Ambien message AMP two según las instrucciones del fabricante para amplificar nuestro ARNm. Así que ahora que tenemos una muestra pura de ARNm, le entregaré el experimento a María, quien lo guiará a través de la amplificación de ARNm y la síntesis de CDNA.

Gracias, Hannah. Antes de comenzar la amplificación del ARNm, calcule los volúmenes de cada componente de las mezclas maestras del kit de dos bacterias Ambien message AMP en línea, comenzamos la poliadenilación del ARN molde colocando hasta 1000 nanogramos de ARN total en un tubo de micro fuga estéril libre de ARN. Utilice 6,5 microlitros de muestra y no hay agua libre de ARN en el primer tampón para sintetizar un ARN a través de la transcripción in vitro.

Se recomienda utilizar un horno de hibridación o incubadora debido a su temperatura uniforme. Y debido a que es extremadamente importante que no se forme condensación dentro de los tubos, recomendamos encarecidamente una incubación de reacción de transcripción in vitro de 14 horas. Para maximizar el rendimiento de ARN para obtener el rendimiento de ARN A más alto, conduzca el IBT en un volumen de reacción final de 40 microlitros, almacene el ARN A a 80 grados centígrados negativos en cuartos de aproximadamente 10 microlitros.

Una vez que se amplifica el ARN, es hora de sintetizar el complementario o CDNA. El clon de ribot universal Promega. El kit del sistema de síntesis CDNA se utiliza para sintetizar CD NA a partir de un NA. El kit proporciona instrucciones para convertir dos microgramos, un NA a CD NA. Recomendamos una entrada de seis a 10 microgramos por NA y escalar las reacciones en consecuencia.

Limpie el CD NA utilizando una precipitación de etanol o el sistema de limpieza de ADN promega wizard. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las muestras almacenadas a menos 80 grados Celsius de CDNA bicatenario se pueden secuenciar directamente en este punto a partir de 10 litros de agua de mar, extrajimos aproximadamente 10 microgramos de ARN ambiental y amplificamos a 20 veces a través de la conversión del MR amplificado. Se generaron cantidades suficientes de material de NA a CDNA bicatenario para la secuenciación y el análisis de las transcripciones ambientales. Acabamos de mostrarte cómo evaluar la expresión génica de las comunidades microbianas marinas utilizando la metatranscriptómica ambiental.

Recuerde siempre que al realizar este procedimiento, el ARNm se degrada rápidamente y los ARN son omnipresentes. Por lo tanto, tome las precauciones estándar para trabajar en un entorno libre de núcleos de costillas y procese las muestras lo más rápido posible. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.