El análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con Transcriptómica Ambiental

Este procedimiento comienza con la adquisición de biomasa microbiana marina a partir de muestras de agua mediante prefiltración a través de filtros de cinco y tres micrómetros, seguida de la recolección en un filtro de 0,22 micrómetros. Luego se extrae ARN total de los organismos retenidos en el filtro de 0,22 micrómetros. Nuestro ARN se elimina del ARN total mediante degradación enzimática selectiva y el Mr.N enriquecido mediante hibridación sustractiva se amplifica linealmente mediante la adición de cola de poliA y transcripción in vitro.

El ARN antisentido amplificado se convierte luego en ADN bicatenario utilizando hexámeros aleatorios. El ADN resultante puede clonarse y secuenciarse o someterse directamente a pirosecuenciación. Hola, soy Rachel Persky del laboratorio de la Dra. Marianne Moran en el Departamento de Ciencias Marinas de la Universidad de Georgia.

Hoy vamos a mostrarle un procedimiento para analizar la expresión génica a partir de muestras ambientales, utilizando metatranscriptómica ambiental. Scott Gifford le mostrará cómo procesar muestras ambientales para la recolección de ARN.

Le mostraré cómo extraer ARN de las muestras y de los RIN de Johanna. AON demostrará la eliminación de ARN. Luego, Maria Kosta explicará los pasos de amplificación de ARN y síntesis de ADN complementario.

Así que comencemos. Para iniciar la recolección de ARN ambiental, preparamos el sistema de filtración colocando un extremo del tubo en el agua a la profundidad deseada para el muestreo y conectamos el extremo opuesto a un filtro de alto volumen de tres micrómetros, colocando la bomba entre ambos extremos del tubo. Luego, el filtro de tres micrómetros se conecta a la torre de filtro de 0,22 micrómetros y el efluente se dirige desde la torre de 0,22 micrómetros hacia un recipiente graduado.

Recorra varios litros de agua a través del sistema para enjuagar. Al finalizar, retire el tubo del agua mientras la bomba está en funcionamiento para eliminar el agua restante de la línea. A continuación, use un par de pinzas para colocar un filtro de 0,22 micrómetros en la torre de filtro y ciérrelo.

Coloque el extremo de la manguera nuevamente en el agua y encienda la bomba. Permita que el aire sea expulsado tanto de los filtros como del sistema, y supervise el volumen de agua filtrada en el bidón. Una vez que se haya filtrado el volumen deseado, retire la manguera del agua y purgue el agua restante del sistema.

En cuanto el filtro esté seco, retire rápidamente la placa superior del filtro y doble el papel de filtro. Coloque el filtro en un recipiente hermético y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido. Antes de comenzar el experimento, es importante tener en cuenta que, dado que los ARN son ubicuos y los ARNm se degradan rápidamente, deben seguirse las precauciones estándar para trabajar en un entorno libre de ribonucleasas, incluyendo las superficies de trabajo y las pipetas.

Con esto en mente, se deben usar guantes limpios al manipular cualquier material utilizado en este procedimiento. Además, las muestras deben procesarse en el menor tiempo posible. Para comenzar la extracción de ARN total del filtro de 0,22 micrómetros, preparamos tubos con perlas agregando ocho mililitros de tampón RLT con beta meto etanol a un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego se agregan uno a dos mililitros de perlas de ARN de un kit de extracción de suelo con energía portátil. Retire rápidamente el filtro congelado del congelador y manténgalo dentro del paquete térmico. Rompalo con un mazo.

Agregue el filtro triturado al tubo cónico de 50 mililitros preparado y selle la tapa del tubo con cinta parafilm o cinta de laboratorio; vortexee durante 10 minutos. Luego, centrifugue el tubo de 50 mililitros a 5.000 RPM durante un minuto. A temperatura ambiente, retire la mayor cantidad posible del lisado y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros antes de centrifugar nuevamente durante cinco minutos.

A 5.000 ×g, el sobrenadante se transfiere entonces a un nuevo tubo de 50 mililitros y se añade un volumen de etanol al 100 % al lisado. Utilizando una jeringa de 10 mililitros, aspire el lisado a través de una aguja de calibre 18 a 21 y páselo hacia afuera aproximadamente cinco veces. En los pasos subsiguientes de extracción, use el kit KaiGen R y easy mini siguiendo las instrucciones del fabricante, aplicando el lisado a la columna proporcionada ya sea con el manifold de vacío o mediante centrifugaciones repetidas.

Cuantifique el ARN total espectrofotométricamente. Después de determinar el rendimiento total de ARN, utilizamos el kit Ambien turbo DNA free según las instrucciones del fabricante para eliminar cualquier contaminación de ADN. Ahora que las extracciones de ARN han finalizado, voy a entregar el ARN total a Johanna, quien realizará los pasos de eliminación de ARNr primero y segundo.

Gracias Rachel. Para comenzar la eliminación de ARNr, mezcle suavemente y centrifugue brevemente el tampón de reacción 10 veces antes de usarlo en un tubo estéril libre de ARN de 0,5 mililitros; combine los volúmenes adecuados de tampón de reacción 10 veces, inhibidor de ARN, muestra de ARN total y exonucleasa terminator. Según el protocolo de Epicenter, incube la reacción a 30 grados Celsius durante 60 minutos en un termociclador con tapa calentada o en un baño de agua.

A continuación, detenga la reacción mediante una precipitación con fenol-etanol. Primero, agregue agua libre de RNasas hasta un volumen total de 200 microlitros y luego añada un volumen de una solución de fenol-cloroformo uno a uno a la centrifugación de ARNm. Recupere la fase acuosa y luego precipite con etanol al cien por ciento y agite. Este es un punto potencial donde se puede detener el procedimiento.

El ARN se puede almacenar a menos 80 grados Celsius hasta que se esté listo para utilizar la muestra en aplicaciones posteriores. Una vez que hayamos completado la primera enriquecimiento de ARNm, utilizaremos los kits Ambien microbe enrich y microbe express según las instrucciones del fabricante para eliminar cualquier ARNr residual de nuestra muestra. Para facilitar la eliminación del ARNr eucariota, utilizaremos el kit microbe enrich.

Todos los volúmenes se determinan siguiendo las instrucciones del fabricante. Para comenzar, pipetee 300 microlitros de tampón de unión en un tubo de 1,5 mililitros. Añada de 5 a 100 microgramos de ARN total en un volumen máximo de 30 microlitros y vortexee.

Añada suavemente dos microlitros de la mezcla de oligos de captura para cinco microgramos de ARN en tampón de unión y golpee suavemente el tubo. Centrifugue brevemente la mezcla. Desnaturalice la mezcla a 70 grados Celsius durante 10 minutos antes de incubarla a 37 grados Celsius durante una hora.

Durante esta incubación, prepare las perlas magnéticas de oligo lavándolas una vez con agua libre de nucleasas y una vez con tampón de unión, capturando las perlas en un soporte magnético entre cada lavado. Almacene las perlas en hielo y déjelas calentar a temperatura ambiente. Cinco minutos antes de usarlas, caliente la solución de lavado a 37 grados Celsius en un bloque térmico.

Añada la mezcla de oligos de captura de ARN a las perlas magnéticas con oligos lavadas, mezcle suavemente el tubo y centrifugue. Incube brevemente la mezcla a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere aproximadamente tres minutos antes de aspirar el sobrenadante que contiene el ARNm y transferirlo a un tubo de recolección sobre hielo.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución de lavado previamente calentada a las perlas capturadas. Vortexee suavemente para capturar las perlas y recupere el sobrenadante. Este sobrenadante con ARN.M en el tubo de recolección se coloca sobre hielo.

Coloque un tubo de recolección en hielo mientras se prepara para eliminar el ARNr procariota utilizando el kit Ambi Microbe Express, que usaremos para eliminar el ARNr procariota residual. Utilice un bioanalizador o Experion para verificar la contaminación por ARNr y la calidad del ARN.M. Este es un punto potencial donde se puede detener el procedimiento.

El ARN se puede almacenar a menos 80 grados Celsius. Una vez que se ha eliminado el ARNr, utilizaremos el kit Ambien Message AMP dos bacterias según las instrucciones del fabricante para amplificar nuestro ARNm. Ahora que tenemos una muestra pura de ARNm, pasaré el experimento a María, quien los guiará a través de la amplificación de ARNm y la síntesis de ADNc.

Gracias, Hannah. Antes de comenzar la amplificación de ARNm, calcule los volúmenes de cada componente de las mezclas maestras del kit Ambien message AMP dos bacterias en línea. Comience la poliadenilación del ARN molde colocando hasta 1000 nanogramos de ARN total en un tubo microfuga estéril libre de ARN. Utilice 6,5 microlitros de muestra y sin agua libre de ARN en el primer tampón para sintetizar un ARN mediante transcripción in vitro.

Se recomienda utilizar un horno o incubadora de hibridación debido a su temperatura uniforme. Y dado que es extremadamente importante que no se forme condensación dentro de los tubos, recomendamos encarecidamente una incubación de la reacción de transcripción in vitro de 14 horas. Para maximizar el rendimiento de ARN y obtener el mayor rendimiento posible de ARN A, realice la IBT en un volumen final de reacción de 40 microlitros y almacene el ARN A a menos 80 grados Celsius en alícuotas de aproximadamente 10 microlitros.

Una vez que el ARN se ha amplificado, es momento de sintetizar el ADN complementario o ADNc. Se utiliza el kit Promega Universal RiboClone de sistema de síntesis de ADNc para sintetizar ADNc a partir del ARN. El kit proporciona instrucciones para convertir dos microgramos de ARN en ADNc. Recomendamos una cantidad de entrada de seis a 10 microgramos de ARN y escalar las reacciones en consecuencia.

Limpie el ADNc utilizando ya sea una precipitación con etanol o el sistema de purificación de ADN Promega Wizard. Según las instrucciones del fabricante, almacene las muestras a menos 80 grados Celsius. En este punto, el ADNc de doble cadena puede secuenciarse directamente. A partir de 10 litros de agua de mar, extraímos aproximadamente 10 microgramos de ARN ambiental y lo amplificamos 20 veces mediante la conversión del ARNm amplificado en ADNc de doble cadena, obteniendo cantidades suficientes de material para la secuenciación y el análisis de los transcritos ambientales. Acabamos de mostrarle cómo evaluar la expresión génica de comunidades microbianas marinas utilizando metatranscriptómica ambiental.

Recuerde siempre que, al realizar este procedimiento, el ARNm se degrada rápidamente y los ARN están presentes de forma ubicua. Por lo tanto, tome las precauciones estándar para trabajar en un entorno libre de ribonucleasas y procese las muestras lo más rápidamente posible. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.