Name: Microinyección de oocitos de Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende microinyección en oocitos de Xenopus laevis para estudiar transporte nucleocitoplasmático mediante microscopía electrónica de secciones finas. Este método permite visualizar sustratos importados y comprender los mecanismos celulares de importación nuclear.

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Damos las gracias a David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, Columbia Británica) para la prestación del baculovirus AcMNPV y útil para el debate. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Michael Smith Fundación para la Investigación en Salud (MSFHR), y el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) .

Parte 1: Preparación de los ovocitos de Xenopus para la microinyección <ol><li> Coloque una pequeña porción (alrededor de 2 cm) de Xenopus ovario laevis en un tubo cónico de 50 ml que contienen 20 ml de solución de colagenasa (5 mg / ml de colagenasa en calcio sin modificar Barth salina: 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenasa se utiliza para eliminar las células del folículo que rodean a los ovocitos. </li><li> Coloque el tubo en una plataforma de agitación y el rock con suavidad (a 100 rpm) durante una hora. Este tiempo varía con los diferentes lotes de la colagenasa. Así, después de una hora, tomar una pequeña muestra de los ovocitos y examinarlas bajo un microscopio de disección. Adecuadamente de-folliculated ovocitos deben estar bien separados unos de otros, y debe ser fácil de insertar una aguja de vidrio en el oocito. Si los óvulos no son lo suficientemente de-folliculated, se quedan en la solución de colagenasa y comprueba de nuevo cada cinco minutos. </li><li> Lavado de los ovocitos tres veces con solución salina modificada de Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7,5), y la transferencia de los a 100 mm de diámetro del plato de Petri que contiene MBS más el 1% de penicilina estreptomicina /. Los ovocitos están listos para ser microinyección. Si microinyección se llevará a cabo en otro día, tienda de los ovocitos a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, seleccionar ovocitos maduros VI etapa para la microinyección. Estos ovocitos son grandes, con buen contraste entre el hemisferio negro de origen animal y vegetal del hemisferio color crema. </li><li> La transferencia de los ovocitos maduros etapa VI en una placa de microtitulación (Nunc, un volumen de 10 l bien). Esto debe hacerse con cuidado, usando una pipeta de 200 ml con una pipeta de punta que se ha cortado al final para permitir la succión ininterrumpido de los ovocitos. </li></ol> Parte 2: La microinyección de ovocitos de Xenopus <ol><li> Prepare el sustrato de importación que se microinyección mediante la adición de una pequeña cantidad de 1% de azul de bromofenol, para ayudar en la visualización de la microinyección. Por ejemplo, podemos añadir 1 l de azul de bromofenol y 10 l de sustrato. </li><li> Coloque una pequeña tira de Parafilm en una de 100 mm diámetro del plato de Petri, y prescindir de una caída del 5-l de la solución que se inyecta en la tira de Parafilm. </li><li> Llene una aguja de inyección previamente calibrado (que se obtiene tirando de un 6,6 l micropipeta Drummond con el Inyectar + Matic asistente de cámara) con la solución a inyectar. Para ello, el microinyector se encuentra en el modo de aspiración. Para calibrar la aguja que marca puntos en la aguja cada 0,5 mm, que corresponden a un volumen de 50 nl. </li><li> Para la inyección citoplasmática, inserte la punta de la aguja en un ovocito en el hemisferio vegetal, muy cerca del hemisferio animal, en un ángulo de aproximadamente 45 grados. A su vez la creación de microinyector microinject y microinject cada ovocito con 50 nl de sustrato de importación. Las marcas de puntos en la aguja se utilizan para controlar la cantidad de sustrato que se ha inyectado. </li><li> La transferencia de los óvulos inyectados a un pequeño (35 mm de diámetro) una placa de Petri llena de MBS, e incubar a temperatura ambiente durante el tiempo deseado (puntos de tiempo se eligen con el fin de permitir la observación del sustrato de importación asociados con los NPCs, lo que ocurre entre 10 y 30 minutos para las proteínas y los virus que son transportados activamente a la Asamblea Popular Nacional, esta vez también depende del sitio de la inyección y el tamaño de la proteína / virus). </li><li> Cuando la incubación, la transferencia de ovocitos a un vial de vidrio de 4 ml que contiene 2% de glutaraldehído en el MBS y la solución de la noche a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Disección de los ovocitos de Xenopus <ol><li> Al día siguiente, lave los ovocitos 3 veces con MBS. </li><li> La transferencia de ovocitos a una pequeña placa de Petri llenas de sal de amortiguación bajo (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,5). El uso de un microscopio de disección y pinzas de disección, retirar el polo vegetal de cada ovocito. Es útil para estabilizar el ovocito se analizó con un par de pinzas, mientras que el otro par se utiliza como tijeras para cortar el polo vegetal. En este punto es posible evaluar el éxito de la microinyección por la presencia de un tinte azul en el citosol. El protocolo se mantendrán solamente por los ovocitos que se microinyección con éxito. Además, si las muestras se prepararán para EM, este paso disección hace que sea mucho más fácil encontrar el núcleo cuando se poda y el corte de las muestras. </li><li> Fijar los ovocitos disecados de nuevo con glutaraldehído al 2% en LSB durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Después de la fijación, lavado de los ovocitos diseccionado en tres ocasiones con la LSB. </li></ol> Parte 4: Preparación de los ovocitos inyectados para la Incorporación de EM y delgada de seccionamiento <ol><li> La transferencia de los ovocitos disecados a una diapositiva depresión. Aspirar la mayor cantidad de líquido como seaposible, y luego rápidamente (para que no se sequen) cubren los ovocitos analizó con bajo punto de fusión agarosa al 2%. Mientras que la agarosa es todavía suave, use una punta de pipeta para separar los ovocitos de los demás, y para asegurarse de que cada ovocito está boca arriba o hacia abajo (no hacia los lados). </li><li> Deje que la agarosa para solidificar durante unos 10 minutos. Una vez que la agarosa se solidifica, use una hoja de afeitar para cortar la agarosa en trozos pequeños, cada uno con un ovocito disecados. </li><li> Coloque los ovocitos de agarosa incrustado en un frasco de vidrio de 4 ml, y los post-solución con un 1% OsO 4 en LSB durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la muestra tres veces en la LSB. Si es necesario, guardar la muestra a 4 ° C durante la noche y continuar con el protocolo al día siguiente. </li><li> Secuencialmente deshidratar las muestras en una serie ascendente de alcohol (50, 70 y 90% de etanol durante 20 minutos cada uno). Esto es seguido por dos cambios en el 100% de etanol durante 15 minutos cada uno. Finalmente se deshidratan las muestras con acetona al 100% durante 15 min. </li><li> Infiltrarse en las muestras con una mezcla de 1:1 de Epon (Fluka) y acetona durante una hora, seguido por la infiltración con una mezcla de 2:1 de Epon y acetona durante dos horas, y finalmente en pura Epon por lo menos seis horas. </li><li> Colocar las muestras en moldes incorporación plana llena de frescos Epon puro. Los ovocitos están orientadas de tal forma que el lado del núcleo más cercano al lugar de la inyección - en este caso del lado de los ovocitos que se ha dividido - serán distribuidos en primer lugar. Este paso sirve para optimizar las posibilidades de visualización de las importaciones del sustrato elegido. </li><li> Por último, polimerizar el Epon durante dos días a 60 ° C. </li><li> Con el fin de visualizar las muestras, los bloques se cortan y se secciona a continuación, utilizando una ultramicrotomo. Las secciones son transferidos a las redes de EM, teñidas utilizando el procedimiento estándar, y se visualizaron con un microscopio electrónico de transmisión. No vamos a mostrar esta parte del protocolo, ya que es el procedimiento estándar de EM. </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: Si el protocolo ha sido un éxito, entonces la envoltura nuclear (NE) y el CPN debe ser claramente visible en micrografías EM. Dependiendo de la inyección del sustrato y la cantidad de tiempo entre la inyección y la fijación, el sustrato debe ser visible en la cara citoplásmica de la APN, en la Asamblea Popular Nacional, o en el frente nuclear de la APN. La figura 1 muestra una sección transversal NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con cápsides de los baculovirus AcMNPV, se incubaron a 4 ° C durante cuatro horas, y se procesaron para inclusión y corte delgado EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Un acoplamiento cápside en la cara citoplásmica de un NPC se indica con una flecha blanca. En contraste, la figura 2 muestra una sección transversal NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con el virus de parvovirus Minuto de ratones (MVM), incubados a temperatura ambiente durante cuatro horas, y procesados ​​para inclusión y la sección delgada EM como se describe. Usando esta técnica, hemos encontrado que MVM induce alteraciones de la NE (Cohen y Pante, 2005). Paréntesis indican los saltos en el NE. Puntas de flecha a punto de NPCs. Cápsides putativo MVM asociado con la NE se indican con flechas blancas. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figura 1" width="600" height="459" /> Figura 1: Micrografía electrónica de una sección NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con cápsides de los baculovirus Ac MNPV, se incubaron a 4 ° C durante cuatro horas, y se procesaron para incorporación de la sección delgada y EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Cápsides se indican con flechas blancas. Barra de escala: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="264" /> Figura 2: Micrografía electrónica de una sección NE con citoplasma adyacente (c) y el núcleo (n) a partir de un ovocito de Xenopus que ha sido inyectado con el virus de parvovirus Minuto de ratones (MVM), incubados a temperatura ambiente durante cuatro horas, y procesados ​​para inclusión y la sección delgada EM como se describe. Puntas de flecha a punto de NPCs. Paréntesis indican los saltos en el NE. Cápsides putativo MVM asociado con la NE se indican con flechas blancas. Barra de escala: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
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Microinyección de ovocitos de Xenopus combinado con finas corte EM es una herramienta muy eficaz para el estudio de transporte nucleocytoplasmic. Este sistema ha sido utilizado para asignar los distintos pasos de la importación a través de la APN, por ejemplo de interacción de un sustrato de importación nuclear con componentes estructurales de la APN, tales como los filamentos de citoplasma y una canasta nuclear (revisado por Pante, 2006). También se ha utilizado para estudiar la importación nuclear de la energ...

microinyección de oocitos de xenopus laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis seguido por el corte fino de microscopía electrónica (EM) es un excelente sistema para estudiar el transporte nucleocytoplasmic. Debido a su gran núcleo de alta densidad y de los complejos de poro nuclear (CPN), el transporte nuclear puede verse fácilmente en el ovocito de Xenopus. Mucho conocimiento de los mecanismos de importación y exportación nuclear se ha ganado a través del uso de este sistema (revisado por Pante, 2006). Además, hemos utilizado la microinyección de ovocitos de Xenopus a diseccionar las vías de importación nuclear de varios virus que se replican en el núcleo principal. Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de los ovocitos de Xenopus con un sustrato de importación nuclear. También muestran la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización de corte fino EM, incluyendo la disección, la deshidratación, y la incorporación de los ovocitos en una resina epoxi incrustación. Por último, se ofrecen los resultados representativos de los ovocitos que se han microinyección con la cápside del nucleopoliedrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) o el virus del parvovirus Minuto de ratones (MVM), y discutir las posibles aplicaciones de la técnica.

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ovocitos con un sustrato de importación nuclear, así como la preparación de los ovocitos inyectados para la visualización por microscopía electrónica de corte fino.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

La microinyección de ovocitos de Xenopus laevis seguida de microscopía electrónica (ME) de cortes finos es un sistema excelente para estudiar el transporte nucleocitoplasmático...

La microinyección de ovocitos de Opus Lavu, seguida de microscopía electrónica de cortes finos, es un excelente sistema para estudiar el transporte nucleocitoplasm 1. En este experimento, los ovocitos se desfolliculizan con colagenasa y se seleccionan los ovocitos en estadio seis, que se colocan en una placa de múltiples pocillos. Luego, los ovocitos se microinyectan con un sustrato de importación nuclear tras incubarlos a temperatura ambiente para permitir que el sustrato entre en el núcleo.Las células se fijan y seccionan. Las células seccionadas se incluyen en agarosa de bajo punto de fusión, se vuelven a fijar con tetraóxido de osmio, se deshidratan y se incluyen en una resina epoxi. Las muestras incluidas en epoxi se cortan con un ultramicrotomo y los cortes se colocan en una rejilla de cobre para muestras. Después de la tinción, las secciones se visualizan bajo un microscopio electrónico de transmisión. Hola, soy Sarah Cohen del laboratorio de la Dra. Nellie Pane en el Departamento de Zoología de la Universidad de Columbia Británica. Soy Shelly Ow, también del laboratorio de Panta.Hoy les mostraremos un procedimiento para la microinyección de células Zenap Lavis. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la importación nuclear de cargas, como los virus. Así que comencemos.Para comenzar el experimento, coloque un pequeño trozo de aproximadamente dos centímetros de ovario de Zenap Lavis en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de solución de colagenasa. La colagenasa elimina las células foliculares que rodean los citozoides; luego, coloque el tubo en la plataforma agitadora y agite suavemente a 100 RPM durante 30 minutos. Este tiempo varía según los diferentes lotes de colagenasa.Después de una hora, tome una muestra pequeña de los citos y examínelos bajo un microscopio estereoscópico adecuadamente. Los citos debidamente desfoliados deben estar bien separados entre sí. Inserte una aguja de vidrio en un cito para verificar que entre fácilmente.Si las células no están suficientemente desfoliadas, déjelas en la solución de colagenasa y verifique nuevamente cada cinco minutos. Una vez que las células estén suficientemente desreguladas, lávelas tres veces con solución salina bar modificada y transfiéralas a una placa de Petri de 100 milímetros que contenga MBS más 1 % Penicilina estreptomicina. Utilizando un microscopio estereoscópico, seleccione células en estadio maduro seis para microinyección.Estas ovocitos son grandes y presentan un buen contraste entre el hemisferio animal negro y el hemisferio vegetal de color crema. Transfiera los ovocitos maduros en la etapa seis a una placa de múltiples pocillos. Para ello, utilice un pipeteador de 200 microlitros con una punta de pipeta cuyo extremo ha sido cortado para permitir una succión sin interrupciones de los ovocitos y transfiera cuidadosamente los ovocitos a la placa de múltiples pocillos.Utilizamos un platillo sin micro pocillos con un volumen de pocillo de 10 microlitros. Los sitios EO ya están listos para ser microinyectados. Prepare el sustrato de importación para ser microinyectado añadiendo un microlitro de azul de bromofenol al 1 % a 10 microlitros de sustrato. El colorante azul de bromofenol añade visualización a la microinyección.Luego, coloque una pequeña tira de paraformo en una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro y coloque una gota de cinco microlitros de la solución de inyección sobre la tira de paraformo. A continuación, obtenga una aguja de inyección estirando una micropipeta Drummond de 6,6 microlitros con el estirador Inject Plus. Calibre la aguja de inyección haciendo marcas puntuales en la aguja cada 0,5 milímetros, lo que corresponde a un volumen de 50 nanolitros. Configure el microinyector en modo de aspiración y llene la aguja con la solución de inyección para inyección citoplasmática.Introduzca la punta de la aguja en un citoplasma en el hemisferio vegetal, muy cerca del hemisferio animal, con un ángulo aproximado de 45 grados. Luego, gire el selector del microinyector a la posición de microinyección e inyecte 50 nanolitros de sustrato de importación en cada citoplasma. Observe las marcas puntuales en la aguja para controlar la cantidad de sustrato inyectada una vez finalizadas las inyecciones.Transfiera los citos a una placa de Petri de 35 milímetros llena con MBS. Incube los citos a temperatura ambiente durante el tiempo deseado. Elija puntos de tiempo que permitan la observación del sustrato de importación asociado con los complejos pobres nucleares o NPCs.Normalmente utilizamos puntos temporales entre 10 y 30 minutos para proteínas y virus que son transportados activamente hacia el NPC. Estos puntos temporales también dependen del sitio de inyección y del tamaño de la proteína o del virus. Cuando la incubación haya finalizado, transfiera los citos a un vial de vidrio de cuatro mililitros que contenga glutaraldehído al 2% en MBS y fije durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave los citos tres veces con MBS; ahora estamos listos para diseccionar los citos.Transfiera los ovocitos a una pequeña placa de Petri llena con tampón de baja salinidad. Utilizando un microscopio estereoscópico y pinzas de disección, retire el polo vegetal de cada ovocito. Es útil estabilizar el ovocito con un par de pinzas mientras se usa el otro par como tijeras para eliminar el polo vegetal; este paso de disección facilita considerablemente la localización del núcleo al recortar y seccionar las muestras para microscopía electrónica.En este momento, la presencia de un tinte azulado en el citosol indica una microinyección exitosa; deseche los citos que no se microinyectaron correctamente. A continuación, vuelva a fijar los citos diseccionados con glutaraldehído al 2% en LSB durante una hora a temperatura ambiente. Tras la fijación, lave los citos diseccionados tres veces con LSB. Una vez lavados los citos, estamos listos para preparar los ovocitos inyectados para su inclusión y seccionado delgado em.Transfiera los ovocitos disecados a una placa con depresión, aspire la mayor cantidad posible del líquido y actúe rápidamente para que no se sequen. Cubra los ovocitos disecados con agarosa al 2% de punto de fusión bajo mientras la agarosa aún esté blanda. Utilice la punta de una pipeta para separar los ovocitos entre sí y asegurarse de que cada ovocito esté colocado con la cara hacia arriba o hacia abajo, pero nunca de lado.Deje solidificar los agros durante aproximadamente 10 minutos. Una vez que los agros se hayan solidificado, use una cuchilla de afeitar para cortar los aros en pequeños trozos, cada uno conteniendo un citoplasma diseccionado. Luego, coloque los citoplasmas incrustados en los aros en un vial de vidrio de cuatro mililitros y, utilizando un mezclador rotatorio, fíjelos con tetróxido de osmio al 1% en LSB durante una hora a temperatura ambiente.Después de fijar durante una hora, lave la muestra tres veces en LSB si es necesario. Almacene la muestra a cuatro grados Celsius durante la noche y continúe con el protocolo al día siguiente. Deshidrate secuencialmente las muestras en etanol al 50 %, 70 % y 90 % durante 20 minutos cada uno, luego deshidrate dos veces en etanol al 100 % durante 15 minutos cada vez.Finalmente, deshidrate las muestras con acetona al 100 % durante 15 minutos después de completar los pasos de deshidratación. Infiltra las muestras con una mezcla uno a uno de epon, flua y acetona durante una hora, seguida de la infiltración con una mezcla dos a uno de epon y acetona durante dos horas, y finalmente con epon puro durante al menos seis horas. Cuando se complete el paso final de infiltración, coloque las muestras en moldes planos para inclusión llenos de epon fresco y puro.Oriente las citoes de manera que el lado del núcleo más cercano al sitio de inyección sea seccionado primero. En este caso, se seccionará el lado de las citoes que ha sido diseccionado. En primer lugar, este paso optimiza la probabilidad de visualizar la importación del sustrato elegido.Una vez que las c&eacute;lulas est&eacute;n correctamente orientadas, polimerice el epon durante dos d&iacute;as a 60 grados Celsius. Despu&eacute;s del paso de polimerizaci&oacute;n, obtenga secciones de 50 nan&oacute;metros de grosor de las muestras embebidas en epoxi utilizando un ultramicrotomo. Recopile las secciones en una rejilla de cobre para muestras de ME, ti&ntilde;a las muestras y visual&iacute;celas mediante un microscopio electr&oacute;nico de transmisi&oacute;n.Si el protocolo ha tenido éxito, entonces el envoltorio nuclear y los NPCs deben ser claramente visibles en micrografías de EM. Dependiendo del sustrato inyectado y del tiempo transcurrido entre la inyección y la fijación, el sustrato debe ser visible en la cara citoplasmática del NPC, dentro del NPC o en la cara nuclear del NPC. Este resultado representativo muestra una sección transversal del envoltorio nuclear con citoplasma y núcleo adyacentes procedentes de un cito zenap que ha sido inyectado con cápsidas del virus VAO.Las flechas A-C-M-N-P-V señalan NPCs y una cápside anclándose en la cara citoplasmática de un NPC se indica mediante una flecha blanca. En contraste, esta figura muestra una sección transversal del envoltorio nuclear con citoplasma y núcleo adyacentes de un ovocito zenap que ha sido inyectado con el virus parvo de ratones. Mediante esta técnica, hemos encontrado que el MVM induce alteraciones en el envoltorio nuclear.Los corchetes indican interrupciones en el envoltorio nuclear. Las puntas de flecha señalan los NPCs y las cápsides putativas de MVM asociadas con el envoltorio nuclear se indican con flechas blancas. Acabamos de mostrarle cómo microinyectar y diseccionar células xap levu.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los diferentes lotes de colagenasa varían. Por lo tanto, pruebe cuidadosamente su colagenasa para determinar el tiempo óptimo para la defoliación. Además, tras la defoliación y el lavado con MBS, los citos pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta una semana antes de la microinyección.Por último, mantenga siempre su glúteo completamente sumergido en hielo y nunca permita que el osio se seque. Deben estar completamente sumergidos durante todos los pasos de deshidratación e infiltración. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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