Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

La microinyección de citos Opus Lavu, seguida de microscopía electrónica de corte fino, es un sistema excelente para estudiar el transporte nucleocitoplasmático. En este experimento, los ovocitos se defolian con colagenasa y se seleccionan los citos de la etapa seis y se colocan en una placa de pocillos múltiples. A continuación, los citos se microinyectan con un sustrato nuclear de importación después de la incubación de los citos a temperatura ambiente para permitir que el sustrato entre en el núcleo.

Los citos se fijan y se disecan. Los citos disecados se incrustan en aros de bajo punto de fusión, se fijan de nuevo con tetróxido de osmio, se deshidratan y se incrustan en una resina epoxi. Las muestras incrustadas en epoxi se seccionan con un ultra micrótomo y las secciones se colocan en una rejilla de muestras de cobre.

Después de la tinción, las secciones se visualizan bajo un microscopio electrónico de transmisión. Hola, soy Sarah Cohen del laboratorio de la Dra. Nellie Pane en el Departamento de Zoología de la Universidad de Columbia Británica. Soy Shelly Ow, también del laboratorio de Panta.

Hoy te mostraremos un procedimiento para la Microinyección de Zenap Lavis Cytes. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la importación nuclear de cargamentos como virus. Así que comencemos.

Para comenzar con el experimento, coloque una pequeña pieza de unos dos centímetros de ovario Zenap Lavis en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de solución de colagenasa. La colagenasa elimina las células foliculares que rodean los citos, luego coloca el tubo en la plataforma agitadora y se dispara suavemente a 100 RPM durante 30 minutos. Este tiempo varía con diferentes cantidades de colagenasa.

Entonces, después de una hora, tome una pequeña muestra de los citos y examínelos bajo un microscopio de disección. Propiamente. Los citos defoliados deben estar bien separados entre sí. Inserta una aguja de vidrio en un citit para ver que se desliza fácilmente.

Si los citos no están suficientemente defoliados, déjelos en la solución de colagenasa y vuelva a revisar cada cinco minutos. Una vez que los citos estén suficientemente desregulados, lávelos tres veces con solución salina modificada y transfiéralos a una placa de Petri de 100 milímetros que contenga MBS más estreptomicina de penicilina al 1%. Usando un microscopio de disección, seleccione los cititos maduros de la etapa seis para la microinyección.

Estos citos son grandes con buen contraste entre el hemisferio animal negro y el hemisferio vegetal de color cremoso. Transfiera los seis cititos maduros de la etapa a un plato de pocillos múltiples. Para ello, utilice una pipeta de 200 microlitros con una punta de pipeta cortada en el extremo para permitir la succión ininterrumpida de los ovocitos y transfiera cuidadosamente los ovocitos al pocillo múltiple.

Utilizamos un plato sin micro pocillos con un volumen de pocillos de 10 microlitros, los sitios de EO ahora están listos para ser microinyectados. Prepare el sustrato de importación que se va a microinyectar añadiendo un microlitro de azul de fenol al 1% por 10 microlitros de sustrato. El colorante azul brom fol añade la visualización de la microinyección.

A continuación, coloque una pequeña tira de paraform en una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro y dispense una gota de cinco microlitros de la solución inyectable en la tira de param. A continuación, obtenga una aguja de inyección tirando de una micropipeta Drummond de 6,6 microlitros con el inyectar más Matt Puller Calibre la aguja de inyección haciendo marcas de puntos en la aguja cada 0,5 milímetros, lo que corresponde a un volumen de 50 nanolitros. Ponga el microinyector en modo de aspiración y llene la aguja con solución inyectable para la inyección citoplasmática.

Inserte la punta de la aguja en un citit en el hemisferio vegetal, muy cerca del hemisferio animal en un ángulo de aproximadamente 45 grados. A continuación, gire la configuración del microinyector a micro inyectar y microinyectar cada citación con 50 nanolitros de sustrato de importación. Esté atento a las marcas de puntos en la aguja para controlar la cantidad de sustrato que se ha inyectado cuando se completan las inyecciones.

Transfiera los citos a una placa de Petri de 35 milímetros llena de MBS. Incube los cititos a temperatura ambiente durante el tiempo deseado. Elija puntos de tiempo que permitan la observación del sustrato de importación asociado con complejos nucleares pobres o NPC.

Por lo general, usamos puntos de tiempo entre 10 y 30 minutos para las proteínas y los virus que se transportan activamente hacia el NPC. Estos puntos de tiempo también dependen del sitio de inyección y del tamaño de la proteína del virus. Cuando se complete la incubación, transfiera los citos a un vial de vidrio de cuatro mililitros que contenga 2% de glutaraldehído en MBS y fije durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente, lave los citos tres veces con MBS, ahora estamos listos para diseccionar los citos.

Transfiera los citos a una pequeña placa de Petri llena de tampón con bajo contenido de sal. Con un microscopio de disección y pinzas de disección, retire el palo vegetal de cada ovocito. Es útil estabilizar el ovocito con un par de pinzas mientras que el otro par se usa como tijeras para quitar el polo vegetal, este paso de disección hace que sea mucho más fácil encontrar el núcleo al recortar y seccionar las muestras para microscopía electrónica.

En este punto, la presencia de un tinte azul en el citosol indica que la microinyección ha sido exitosa. A continuación, fije los citos disecados nuevamente con glutaraldehído al 2% en LSB durante una hora a temperatura ambiente después de la fijación, lave los citos disecados tres veces con LSB. Una vez lavados los citos, estamos listos para preparar los ovocitos inyectados para su inclusión y corte fino.

Transfiera los ovocitos disecados a un portaobjetos de depresión, aspire la mayor cantidad posible de líquido y luego actúe rápidamente para que no se sequen. Cubra los citos disecados con un 2% de aros de bajo punto de fusión mientras el aros aún está blando. Utilice una punta de pipeta para separar los citos entre sí y asegurarse de que cada uno de ellos esté boca arriba o hacia abajo, pero no hacia los lados.

Deje que los agros se solidifiquen durante unos 10 minutos. Una vez que el agros se solidifique, use una cuchilla de afeitar para cortar el aros en pedazos pequeños, cada uno con un cite disecado. A continuación, coloque los citos incrustados en aros en un vial de vidrio de cuatro mililitros y, utilizando un poste mezclador rotativo, fíjelos con tetróxido de osmio al 1% en LSB durante una hora a temperatura ambiente.

Después de la fijación durante una hora, lave la muestra tres veces en LSB si es necesario. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados durante la noche y continúe el protocolo al día siguiente. Deshidratar secuencialmente las muestras en etanol al 50%70% y 90%ethanol durante 20 minutos cada una, luego deshidratar dos veces en etanol al 100%, durante 15 minutos cada una.

Finalmente, deshidrate las muestras con acetona al 100% durante 15 minutos, una vez completados los pasos de deshidratación. Infiltrar las muestras con una mezcla uno a uno de epon, flua y acetona durante una hora, seguido de la infiltración con una mezcla de dos a uno de epón y acetona durante dos horas, y finalmente en epón puro durante al menos seis horas. Cuando se complete el paso final de infiltración, coloque las muestras en moldes de inclusión planos llenos de epon fresco y puro.

Oriente los citos de manera que se seccione el lado del núcleo más cercano al sitio de inyección. Primero. En este caso, se seccionará el lado de los citos que se ha disecado. En primer lugar, este paso optimiza la posibilidad de visualizar la importación del sustrato elegido.

Una vez que los citos estén correctamente orientados, polimerice el epón durante dos días a 60 grados centígrados. Después de la etapa de polimerización, obtenga secciones de 50 nanómetros de espesor de las muestras incrustadas en epoxi utilizando un ultra micrótomo. Recoja las secciones en una rejilla de muestras de cobre, tiña las muestras y visualícelas bajo un microscopio electrónico de transmisión.

Si el protocolo ha tenido éxito, entonces la envoltura nuclear y los NPC deben ser claramente visibles en las micrografías electrónicas. Dependiendo del sustrato inyectado y de la cantidad de tiempo entre la inyección y la fijación, el sustrato debe ser visible en la cara citoplasmática del NPC en el NPC o en la cara nuclear del NPC. Este resultado representativo muestra una sección transversal de la envoltura nuclear con citoplasma y núcleo adyacentes de un cito zenap al que se le han inyectado cápsidas del virus vao.

Las puntas de flecha A-C-M-N-P-V apuntan a los NPC y una cápside que se acopla en la cara citoplasmática de un NPC se indica con una flecha blanca. En contraste, esta figura muestra una sección transversal de la envoltura nuclear con citoplasma y núcleo adyacentes de un ovocito zenap que ha sido inyectado con el virus parvo de ratones. Utilizando esta técnica, hemos encontrado que la MVM induce interrupciones de la envoltura nuclear.

Los paréntesis indican rupturas en la envoltura nuclear. Las puntas de flecha apuntan a los NPC y las cápsidas MVM putativas asociadas con la envoltura nuclear se indican con flechas blancas. Acabamos de mostrarte cómo microinyectar y diseccionar citos xap levu.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que varían diferentes lotes de colagenasa. Por lo tanto, pruebe su colagenasa cuidadosamente para determinar el momento óptimo para la defoliación. Además, después de la etapa de defoliación y lavado de MBS, los citos pueden almacenarse a cuatro grados centígrados hasta una semana antes de la microinyección.

Por último, mantén siempre los glúteos escondidos en el hielo y nunca dejes que la osis se seque. Deben estar completamente sumergidos durante todas las etapas de deshidratación e infiltración. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.