Name: Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprende microinyección de ARNm y oligonucleótidos Morpholino en embriones de Danio rerio para estudios de sobreexpresión y knockdown génico. Esta técnica robusta facilita el análisis de función génica en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH y la fundación PKD de ZS. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con Yale Centro de Recursos Animales (YARC) y Atención Institucional para las directrices del Comité (IACUC).

Parte 1: Preparación de pipetas y placas de microinyección de cámara <ol><li> Fabricar micropipetas de calefacción y tirar los tubos capilares de vidrio de borosilicato (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) en un dispositivo extractor de micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Almacenar en una placa de Petri en la parte superior de la pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva. </li><li> Vierta el 1,5% de agarosa (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) en placas de medio 1x E3 moldeado con forma de cuña canales que sirven como un método fácil para la celebración de los embriones durante la inyección (como se describe en &#39;El libro de pez cebra &quot;) 1. Deje que la cámara de placas de agar se solidifique antes de usar y almacenar a 4 º C. </li></ol> Parte 2: Preparación de ARN Un método poderoso para los estudios de la función del gen es microinject in vitro transcritos de ARN tope en embriones de pez cebra. Cubiertas de ARN se comporta de manera similar a los ARNm eucariotas en vivo debido a la presencia del análogo de la PAC. Investigadores del pez cebra rutinariamente utilizan este método para sobreexpresar o misexpress su gen de interés. En esta demostración, vamos a microinject una transcripción EGFP de etiquetado y el uso directo de todo el embrión GFP-expresión como una lectura visible de una inyección de éxito. <ol><li> Realizar una reacción de transcripción in vitro de la PAC en su transcripción de ARN de interés. En nuestro laboratorio, de manera rutinaria insertar un cDNA de interés en un vector pCS2 + y llevar a cabo una reacción de síntesis in vitro de grandes cantidades de ARN tope con el mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purificar la muestra de ARN mediante la ejecución a través de la RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74104) o con fenol: cloroformo extracción y precipitación con isopropanol. </li><li> Con cuidado, determinar la concentración de la preparación de ARN y almacenar a -80 º C hasta que esté listo para su uso. </li><li> En el día de la inyección, descongelar la muestra de ARN, vortex ligeramente y girar hacia abajo brevemente. </li><li> Prepare una solución de trabajo con agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,050% de rojo fenol (Sigma-Aldrich Co., P0290). Rojo fenol sirve como un marcador visible para la inyección de la solución en el embrión. En este artículo, vamos a preparar una solución de trabajo de 100 ARNm EGFP ng / uL con 0,050% de rojo fenol. </li><li> Mantenga la muestra de trabajo en el hielo y acciones retorno de ARN a -80 ° C. </li><li> Proceder a la parte 4 cuando esté listo para inyectar la muestra. </li></ol> Parte 3: Preparación de morfolino Morfolino oligonucleótidos antisentido son ampliamente utilizados para modificar la expresión de genes mediante el bloqueo de la traducción de una proteína específica o mediante la modificación de pre-mRNA de empalme 2,3. Morfolinos en el pez cebra servir como una poderosa herramienta genética inversa por derribar la función del gen. En este artículo vamos a microinject un oligo morfolino dirigidos al sitio de iniciación de la traducción de PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Basado en el trabajo previamente establecido, se espera que los embriones inyectados para imitar fenotípicamente PKD2 4 peces mutantes. <ol><li> En forma rutinaria para 300 nmol de un oligo morfolinos diseñado específicamente para un gen de interés por parte de Gene Herramientas, LLC (Philomath, OR). </li><li> Añadir 100 uL de agua estéril para obtener una solución 3 mM de valores. Alícuota de la solución y almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> En el día de la inyección, calentar la solución morfolino a 65 ° C durante 5 minutos. Ajustar enfriar en hielo inmediatamente y girar brevemente. Este paso desnaturaliza las estructuras secundarias en el oligo y asegura que la solución esté completamente solubilizados. </li><li> Prepare una solución de trabajo mediante la dilución de la solución morfolino en agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,050% de rojo fenol. En esta demostración, que se prepara una solución de trabajo de 0,50 mm PKD2 morfolino con 0,050% de rojo fenol. </li><li> Seguir trabajando solución a temperatura ambiente. </li><li> Proceder a la parte 4 cuando esté listo para inyectar la muestra .---- </li></ol> Parte 4: Llenado de la micropipeta con su solución de trabajo <ol><li> Cortar el extremo distal de una micropipeta con fórceps o una hoja de afeitar quirúrgico para crear una abertura que es apenas visible bajo un microscopio de disección (Nikon Instruments, Inc., SM2645) con un aumento de 50X. </li><li> Coloque 2 l de la solución de trabajo como una gota en un portaobjetos. </li><li> Coloque la parte de atrás de una micropipeta a una jeringa de 5 ml equipado con un tubo de una aguja hipodérmica y un poco sumergir la punta distal de la micropipeta en su gota de solución de trabajo. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. </li><li> Sifón de la solución de trabajo a través del extremo distal de la micropipeta, tirando del émbolo de la jeringa. </li></ol> Parte 5: Calibración del volumen de inyección micropipeta <ol><li> Coloque una gota de aceite mineral (American Inc. Bioanalytical, AB00921-00025) en una diapositiva micrómetro (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> A su vez en el poder y el suministro de aire a la presión de pulso micro inyectores aparato (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Fije la micropipeta al titular de la micropipeta de los aparatos de micro inyectores. El inyector de micro es la presión regulada y las descargas se activan pulsando el pedal. </li><li> Bajo el microscopio de disección, prueba el volumen de inyección con inyector micro para colocar una gota de la solución de trabajo sobre el aceite de micrómetro. Mida el diámetro de la gota que flota como una esfera en la parte superior del aceite. </li><li> Ajustar la duración y la presión de inyección para calibrar su cuidado volumen de inyección. Este paso ayuda a la reproducibilidad de los experimentos de microinyección. En esta demostración, todas las microinyecciones se llevará a cabo con un diámetro de la gota de 0,15 mm (aproximadamente 1,76 nL en volumen). </li><li> Una vez que el volumen de la inyección ha sido calibrado, utilice el &quot;Hold&quot; botón en el inyector de micro para evitar que el relleno y las fugas de la micropipeta. </li></ol> Parte 6: Preparación fecundado embriones de pez cebra para la microinyección <ol><li> Pez cebra al azar mate en las primeras horas de cada mañana. Recoger los embriones en la etapa 1 de las células y colocarlas en 1x medio E3. </li><li> Con una pipeta de transferencia de 3 ml (Becton Dickinson Labware, 357524), organizar los embriones a lo largo de los valles en forma de cuña en las placas de microinyección de cámara. </li><li> Eliminar el medio para que los embriones son superficialmente sumergida y no inundadas. Este paso ayuda a la solución de los embriones en el fondo de los valles, así como en la penetración del corion de la micropipeta. </li></ol> Parte 7: Microinyección a través del corion <ol><li> Manipular los embriones con la micropipeta de modo que el citoplasma de las embrión en su fase 1-célula ya es visible bajo el microscopio de disección. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. </li><li> Penetrar en el corion y la yema con la micropipeta con el fin de inyectar en el embrión. En esta demostración, que será la primera microinyección en la yema directamente debajo de la celda, y permitir el flujo citoplásmico y difusión para que la solución de trabajo en la célula. Este flujo es visible debido a la rojo fenol a la solución de trabajo. </li><li> También vamos a demostrar de inyección directa en el citoplasma celular. Microinyección directa en la célula es más robusto, pero mucho tiempo como la orientación adecuada del embrión y la técnica de microinyección es necesario. Como la membrana celular es más riguroso que la membrana de la yema, a menudo es más rápido para entrar en la micropipeta a través de la yema de huevo para alcanzar el citoplasma de la célula. Orientar el polo animal hacia la parte inferior de la cubeta y el trabajo con mano firme puede ayudar en este método de la inyección. </li><li> Después de la microinyección, colocar los embriones en una placa de Petri con medio E3 y se incuba en los 28,5 ° C para el desarrollo normal. </li><li> Durante las próximas horas y días diferentes del desarrollo del embrión, observar los embriones para su fenotipos de interés. </li></ol> Parte 8: Los resultados representativos EGFP sobreexpresión de ARNm: Para verificar el éxito de la microinyección, vamos a observar la expresión de GFP en los embriones en desarrollo a partir de la etapa escudo (~ 6 HPF) de la microscopia de fluorescencia in vivo de todo el embrión (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expresión de la construcción es el más fuerte durante los primeros eventos del desarrollo embrionario y, a menudo disminuirá durante el desarrollo como la inyección de ARN tope es degradado gradualmente y depende de la estabilidad de la proteína expresada. PKD2 traslación de bloqueo morfolino: En base a los resultados publicados anteriormente, esperamos que el PKD2 morphants para imitar la curvatura del cuerpo del eje dorsal que se encuentra en PKD2 pez cebra mutante y quistes del riñón en la actualidad aproximadamente 2 - 3 fdd 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: Los resultados representativos de la microinyección de ARNm EGFP y PKD2 agosto morfolino. (A) los embriones fueron TAB microinyección en la etapa de una célula con 0,17 ng de ARNm EGFP y se visualizan en un DPF en vivo la expresión de GFP. (B, c) los embriones fueron TAB microinyección en la fase 1 de las células con ~ 1,7 nl de una PKD2 traslacional bloqueo morfolino a 0,50 mm y anotó para la curvatura dorsal del cuerpo a las 4 de fdd.

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<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
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<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

Microinyección en embriones de pez cebra es una técnica bien establecida y robusta para explorar el papel de un gen en particular en el desarrollo. Las aplicaciones incluyen la sobre-expresión, misexpression, y los ensayos de caída de su gen de interés, así como el análisis de epistasis entre múltiples genes. Microinyección en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para la generación de animales transgénicos y la asignación de destino de las células de los embriones tempranos de blástula 5,6,7,8,9. Además...

Todos los otros materiales se enumeran en el protocolo.

microinyección de arnm y oligonucleótidos antisentido morpholino en embriones de pez cebra.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Una herramienta esencial para investigar el papel de un gen durante el desarrollo es la capacidad de realizar caída del gen, la sobreexpresión y estudios misexpression. En el pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), La microinyección de ARN, el ADN, las proteínas, los oligonucleótidos antisentido y otras moléculas pequeñas en el embrión en desarrollo ofrece a los investigadores un ensayo rápido y robusto para explorar la función de genes<em&gt; In vivo</em&gt;. En este video-artículo, vamos a demostrar cómo preparar y microinject<em&gt; In vitro</em&gt; Sintetizado EGFP ARNm y un oligo-traslacional bloqueo contra morfolino<em&gt; PKD2</em&gt;, Un gen asociado con la enfermedad de herencia autosómica dominante del riñón poliquístico (PQRAD), en una de las células de embriones de pez cebra etapa. A continuación, se analizará el éxito de los ARNm y microinyecciones morfolino mediante la verificación de buenas prácticas agrarias expresión y análisis de fenotipo. Amplia gama de aplicaciones de esta técnica incluyen la generación de animales transgénicos y las quimeras de línea germinal, la cartografía de la célula-destino y la detección de genes. En este documento se describe un protocolo para la sobreexpresión de EGFP y caída de<em&gt; PKD2</em&gt; Por ARNm y la inyección de morfolino oligonucleótidos.

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Una herramienta esencial para investigar la función de un gen durante el desarrollo es la capacidad de realizar el knockdown, la sobreexpresión y la expresión ectópica de genes...

Este procedimiento comienza preparando ARNm con caperuza transcrito in vitro y morfolinos. Se llena una micropipeta aspirando la solución que contiene morfolinos y luego se calibra el volumen de inyección utilizando un micrómetro en embriones en estadio de una sola célula. A continuación, se recolectan embriones de pez cebra y se acomodan en una cámara de microinyección para realizar microinyecciones en el vitelo.Se inyecta la solución de trabajo en la yema justo debajo de la célula y se aprovechan los movimientos citoplasmáticos para transportar la solución destinada a microinyecciones celulares. Inyecte la solución en el citoplasma celular tras las inyecciones. Incube los embriones a 28,5 grados Celsius en medio E tres y evalúe los fenotipos de interés en las etapas subsiguientes.Hola, soy Shiloh Yuen del laboratorio, hijo del Dr. Sasha y del Departamento de Genética de la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale. Hoy demostraremos una técnica sólida de microinyección para realizar estudios de sobreexpresión de ARNm y de inhibición génica mediante oligonucleótidos morfolinos en pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el papel del S cilium en enfermedades renales quísticas.Así que comencemos. Un enfoque poderoso para estudios de función génica consiste en microinyectar ARN transcrito in vitro y con caperuza en embriones de pez cebra. En esta demostración, microinyectaremos un transcrito marcado con EGFP y utilizaremos la expresión de GFP en embriones enteros vivos como un indicador visible de una inyección exitosa.Primero, realizaremos una reacción de transcripción in vitro de ARN con caperuza en su transcrito de interés. En nuestro laboratorio, habitualmente insertamos el ADN de interés en un vector PCRII-plus y llevamos a cabo una reacción de síntesis in vitro para obtener grandes cantidades de ARN caperuzado utilizando el kit Mmessage Mmachine SP6. A continuación, purificaremos la muestra de ARN pasándola a través del kit RNeasy Mini o mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con isopropanol.Determine cuidadosamente la concentración de la preparación de ARN y almacénela a menos 80 grados Celsius hasta el momento de su uso el día de la inyección. Descongele la muestra de ARN, vortexee suavemente y centrifugue brevemente. A continuación, prepare una solución de trabajo con agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,05 % de rojo de fenol; el rojo de fenol sirve como marcador visible para la inyección de la solución en el embrión.Aquí prepararemos una solución de trabajo de 100 nanogramos por microlitro de ARNm de EGFP con fenol rojo al 0,05 %. Por último, mantenga la muestra de trabajo en hielo y devuelva el stock de ARN a menos 80 grados Celsius. Pase a la preparación del morfo cuando esté listo para inyectar esta muestra.Los oligonucleótidos antisentido Morino se utilizan ampliamente para modificar la expresión génica al bloquear la traducción de una proteína diana o al modificar el empalme del ARNm. Los morfolinos en el pez cebra constituyen una herramienta potente de genética inversa al eliminar la función génica. Aquí realizaremos microinyección de un morfolino dirigido al sitio de iniciación de la traducción de pkd2. Rutinariamente utilizamos 300 M de un morfolino, diseñado específicamente para un gen de interés, obtenido de Gene Tools LLC.A continuación, agregamos 100 microlitros de agua estéril para obtener una solución stock de tres milimolar y luego alícuotamos la solución y la almacenamos a menos 20 grados Celsius hasta el momento de su uso el día de la inyección. Calentamos la solución de morino a 65 grados Celsius durante cinco minutos. Luego enfriamos rápidamente la solución en hielo inmediatamente y centrifugamos brevemente; este paso desnaturaliza cualquier estructura secundaria en el oligonucleótido y asegura que la solución esté completamente solubilizada.A continuación, prepararemos una solución de trabajo diluyendo la solución Morpho en agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,05 % pinal rojo. En esta demostración, prepararemos una solución de trabajo de 0,5 milimolar PKD dos morino con 0,05 % fenol rojo. Mantenga la solución de trabajo a temperatura ambiente y proceda al llenado de micropipetas cuando esté listo para inyectar esta muestra.Para comenzar, necesitaremos fabricar micropipetas que se utilizarán para las inyecciones. Esto se realiza calentando y tirando de tubos capilares de vidrio de silicato BOS en un dispositivo polar para micropipetas. Una vez que se han estirado las agujas, se guardan en una placa de Petri sobre una pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva.A continuación, prepararemos placas de cámara para microinyección vertiendo agar al 1,5 % en placas de medio XE tres moldeadas con surcos en forma de cuña. Esto servirá como un método sencillo para sostener los embriones durante la inyección. Luego, se deja que las placas de cámara con agar se solidifiquen y se almacenan a cuatro grados Celsius hasta que estén listas para usarse.Para comenzar a llenar la micropipeta, corte la punta distal con pinzas o una hoja de bisturí quirúrgico para crear una abertura que sea apenas visible bajo un microscopio estereoscópico a 50 aumentos. A continuación, coloque dos microlitros de su solución de trabajo.Como una gota sobre un portaobjetos, sujete la parte posterior de una micropipeta a una jeringa de cinco mililitros equipada con tubo en una aguja hipodérmica y sumerja ligeramente la punta distal de la micropipeta en su gota de solución de trabajo. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. Aspire la solución de trabajo a través del extremo distal de la micropipeta tirando del émbolo de la jeringa.A continuación, calibraremos el volumen de inyección de la micropipeta. Coloque una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos micrométrico y encienda la fuente de alimentación y el suministro de aire del aparato de microinyección por pulsos de presión. A continuación, conecte la micropipeta al soporte de micropipeta del aparato de microinyección.El microinyector está regulado por presión y los pulsos se activan presionando el pedal con el pie bajo el microscopio de disección. Pruebe el volumen de inyección utilizando el microinyector para colocar una gota de su solución de trabajo sobre el aceite del micrómetro. Mida el diámetro de la gota mientras flota como una esfera sobre la superficie del aceite.Ajuste la duración y la presión de la inyección para calibrar cuidadosamente el volumen de inyección. Este paso contribuye a la reproducibilidad del experimento de microinyección. En esta demostración, todas las microinyecciones se realizarán con un diámetro de gota de 0.15 milímetros.Finalmente, una vez que se haya calibrado el volumen de inyección, utilice el botón de retención en el microinyector para evitar la recarga y la fuga de la micropipeta. Ahora es el momento de preparar los embriones de pez cebra. Los peces cebra se aparearán aleatoriamente durante las primeras horas de cada mañana; para comenzar la preparación, recolecte los embriones en la etapa de una sola célula y colóquelos en medio 1XE3.Utilizando una pipeta de transferencia de tres mililitros, coloque los embriones a lo largo de las ranuras en forma de cuña en las placas de la cámara de microinyección. Retire el medio de manera que los embriones queden ligeramente sumergidos y no inundados. Este paso facilita que los embriones se asienten en el fondo de las ranuras, así como la penetración del corion por la micropipeta.Ahora comenzaremos las inyecciones. Primero, manipularemos los embriones con la micropipeta para que el citoplasma del embrión en estadio de una sola célula sea visible bajo el microscopio estereoscópico. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta; penetre la coriona y luego el vitelo con la micropipeta para inyectar dentro del embrión.En esta demostración, primero realizaremos una microinyección en el vitelo directamente debajo de la célula y permitiremos que el citoplasma y la difusión introduzcan la solución de trabajo en la célula. Este flujo es visible debido al rojo de fenol agregado a la solución de trabajo. Dado que se trata de un embrión de una sola célula, puede inyectarse manualmente o con un manipulador.También demostraremos la inyección directa en el citoplasma celular. La microinyección directa en la célula es más robusta, pero consume más tiempo, ya que se requiere una orientación adecuada del embrión y una técnica precisa de microinyección. Dado que la membrana celular es más resistente que la membrana del vitelo, a menudo es más rápido introducir la micropipeta a través del vitelo para alcanzar la célula.El citoplasma orientando el polo animal hacia el fondo del canal y trabajar con manos firmes puede ayudar en este método de inyección. Después de la microinyección, coloque los embriones en una placa de Petri con medio E3 e incúbelos a 28,5 grados Celsius para un desarrollo normal. Durante las próximas horas y días del desarrollo embrionario, observe los embriones para detectar los fenotipos de interés.Para verificar el éxito de la microinyección, monitorearemos la expresión de GFP en los embriones en desarrollo a partir de la etapa de escudo mediante microscopía de fluorescencia en todo el embrión en vivo. La expresión del constructo es más intensa durante los primeros eventos del desarrollo embrionario y a menudo disminuirá durante el desarrollo, ya que el ARN con caperuza inyectado se degrada gradualmente y depende de la estabilidad de la proteína expresada. Con base en resultados previamente publicados, esperamos que la morfina PKD dos imite la curvatura del eje corporal dorsal observada en los peces cebra mutantes PKD dos y presente quistes renales aproximadamente entre dos y tres días después de la fertilización.Acabamos de mostrarle una técnica de microinyección robusta para realizar estudios de sobreexpresión de ARNm y de inhibición génica mediante oligonucleótidos morfolinos en pez cebra. Al realizar este procedimiento, recuerde que es importante inyectar con mano firme. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Biología

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

Un método para entregar morfolinos directamente en el pez cebra en otocyst 24hpf se ha desarrollado. Con microinyección de morfolinos en el lumen de la vesícula ótica y la electroporación para llevar a cabo la penetración, hemos sido capaces de evitar el efecto de morfolinos en el cerebro y obtener efectos específicos en el oído interno.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

El protocolo describe la eliminación dirigida de la expresión génica en el pez cebra mediante la inyección de morfolino en la cola.

Inyección de morfolino: un método para eliminar la expresión génica objetivo para estudiar la función en el pez cebra

Este video describe una técnica de microinyección de embriones para administrar compuestos en el saco vitelino del pez cebra.

Microinyección de embriones: una técnica para introducir un compuesto en la yema del pez cebra

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.

Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Aprende microinyección de ARNm y oligonucleótidos Morpholino en embriones de Danio rerio para estudios de sobreexpresión y knockdown génico. Esta técnica robusta facilita el análisis de función génica en biología del desarrollo.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

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