Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Este procedimiento comienza con la preparación de ARNm de capuchón transcrito y morfo y transcrito in vitro. Se llena una micropipeta mediante el sifón de la solución que contiene morpho y el volumen de inyección se calibra utilizando una etapa de micrómetro de una célula. A continuación, se recogen los embriones de pez cebra y se colocan en una cámara de microinyección para las microinyecciones de yema.

La solución de trabajo se inyecta en la yema justo debajo de la célula y los movimientos citoplasmáticos se utilizan para transportar la solución para las microinyecciones celulares. Inyecte la solución en el citoplasma celular después de las inyecciones. Incubar los embriones a 28,5 grados centígrados en un medio E tres y puntuar los fenotipos de interés en las etapas subsiguientes.

Hola, soy Shiloh Yuen del laboratorio, hijo del Dr. Sasha y del Departamento de Genética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale. Hoy demostraremos una técnica robusta de microinyección para realizar estudios de sobreexpresión de ARNm y knockdown de genes de nucleótidos morfoo-oligonucleótidos en pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el papel del S cilium en las enfermedades renales quísticas.

Así que comencemos. Un enfoque poderoso para los estudios de la función génica es la microinyección in vitro de ARN encapsulado transcrito en embriones de pez cebra. En esta demostración, microinyectaremos una transcripción marcada con EGFP y utilizaremos la expresión de GFP de embrión entero vivo como lectura visible para una inyección exitosa.

En primer lugar, realizaremos una reacción de transcripción de ARN cap in vitro en su transcripción de interés. En nuestro laboratorio, insertamos rutinariamente A-C-D-N-A de interés en un vector PCs two plus y realizamos una reacción de síntesis in vitro de grandes cantidades de ARN encapsulado utilizando el kit SP six de la máquina M message M. A continuación, purificaremos la muestra de ARN pasándola por el mini kit RN easy o mediante extracción de fenol cloroformo y precipitación de isopropanol.

Determine cuidadosamente la concentración de la preparación de ARN y guárdela a menos 80 grados centígrados hasta que esté lista para su uso el día de la inyección. Descongele ligeramente el vórtice de la muestra de ARN y gírelo brevemente. Ahora prepare una solución de trabajo con agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,05% de rojo de fenol, el rojo de fenol sirve como marcador visible para la inyección de la solución en el embrión.

Aquí prepararemos una solución de trabajo de 100 nanogramos por microlitro de ARNm de EGFP con 0,05% de rojo de fenol. Por último, mantenga la muestra de trabajo en hielo y devuelva el stock de ARN a menos 80 grados centígrados. Proceda a la preparación del morfo cuando esté listo para inyectar esta muestra.

Los oligonucleótidos antisentido de Morino se utilizan ampliamente para modificar la expresión génica mediante el bloqueo de la traducción de una proteína diana o mediante la modificación de la NA prem. El empalme de morfos en el pez cebra sirve como una poderosa herramienta de genética inversa al eliminar la función de los genes. Aquí microinyectaremos un oligonucleótido morfo dirigido al sitio de iniciación traduccional de pkd dos. Utilizamos de forma rutinaria 300 M de un oligonucleótido morfo, diseñado específicamente para un gen de interés obtenido de gene tools LLC.

Luego agregamos 100 microlitros de agua estéril para hacer una solución madre de tres milimolares y luego alícuota la solución y la almacenamos a menos 20 grados centígrados hasta que esté lista para usar el día de la inyección. Calentamos la solución de morino a 65 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, enfriamos la solución sobre hielo inmediatamente y la centrifugamos brevemente, este paso desnaturaliza cualquier estructura secundaria en el oligonucleótido y garantiza que la solución esté completamente solubilizada.

A continuación, prepararemos una solución de trabajo diluyendo la solución de Morpho en agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,05% de rojo pinal. En esta demostración, prepararemos una solución de trabajo de 0,5 milimolares PKD dos morino con 0,05% de rojo fenol. Mantenga la solución de trabajo a temperatura ambiente y proceda al llenado de la micropipeta cuando esté listo para inyectar esta muestra.

Para empezar, tendremos que fabricar micropipetas que se utilizarán para las inyecciones. Esto se hace calentando y tirando de tubos capilares de vidrio de silicato BOS en un dispositivo polar de micropipeta. Una vez que se extraen las agujas, se guardan en una placa de Petri encima de una pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva.

A continuación, prepararemos placas de cámara de microinyección vertiendo 1,5%aros en una XE tres placas medianas moldeadas con canales en forma de cuña. Eso servirá como un método fácil para sostener los embriones durante la inyección. A continuación, se deja solidificar las placas de la cámara agrícola y se almacenan a cuatro grados centígrados hasta que estén listas para ser utilizadas.

Para comenzar a llenar la micropipeta. Corta la punta distal con pinzas o una cuchilla de afeitar quirúrgica para crear una abertura que sea visible bajo un microscopio de disección con un aumento de 50x. A continuación, coloque dos microlitros de su solución de trabajo.

Como una gota en un cubreobjetos, conecte la parte posterior de una micropipeta a una jeringa de cinco mililitros provista de un tubo en una aguja hipodérmica y sumerja ligeramente la punta distal de la micropipeta en la gota de solución de trabajo. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. Sifón de la solución de trabajo a través del extremo distal de la micropipeta tirando del émbolo de la jeringa.

A continuación, calibraremos el volumen de inyección de la micropipeta. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de micrómetro y encienda el suministro de energía y aire al aparato de microinyectores de pulso de presión. A continuación, conecte la micropipeta al soporte de micropipeta del aparato de microinyectores.

El microinyector está regulado por presión y las descargas se activan presionando el pedal debajo del microscopio de disección. Pruebe el volumen de inyección utilizando el microinyector para colocar una gota de su solución de trabajo en el aceite del micrómetro. Mide el diámetro de la gota mientras flota como una esfera sobre el aceite.

Ajuste la duración y la presión de la inyección para calibrar cuidadosamente el volumen de la inyección. Este paso ayuda a la reproducibilidad del experimento de microinyección. En esta demostración, todas las microinyecciones se realizarán con un diámetro de gota de 0,15 milímetros.

Por último, una vez calibrado el volumen de inyección, utilice la perilla de retención del microinyector para evitar el relleno y las fugas de la micropipeta. Ahora es el momento de preparar los embriones de pez cebra. El pez cebra se apareará al azar, en las primeras horas de cada mañana para comenzar la preparación, recolectará embriones en la etapa de una célula y los colocará en un medio XE tres.

Con una pipeta de transferencia de tres mililitros, coloque los embriones a lo largo de los canales en forma de cuña en las placas de la cámara de microinyección. Retire el medio para que los embriones queden poco profundos, sumergidos y no inundados. Este paso ayuda a asentar los embriones en el fondo de los comederos, así como a penetrar en el corion por la micropipeta.

Ahora comenzaremos las inyecciones. Primero, manipularemos los embriones con la micropipeta para que el citoplasma del embrión en etapa de una célula sea visible bajo el microscopio de disección. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta, penetre en el corion y luego en la yema con la micropipeta para inyectar en el embrión.

En esta demostración, primero inyectaremos micro en la yema directamente debajo de la célula y permitiremos que la citoplasmática y la difusión lleven la solución de trabajo a la célula. Este flujo es visible debido al rojo fenol añadido a la solución de trabajo. Dado que se trata de un embrión unicelular, se puede inyectar a mano alzada o con un manipulador.

También demostraremos la inyección directa en el citoplasma de la célula. La microinyección directa en la célula es más robusta, pero requiere mucho tiempo, ya que se requiere una orientación embrionaria adecuada y una técnica de microinyección. Como la membrana celular es más rigurosa que la membrana de la yema, a menudo es más rápido entrar en la micropipeta a través de la yema para llegar a la célula.

El citoplasma que orienta el polo del animal hacia el fondo del comedero y trabaja con manos firmes puede ayudar en este método de inyección. Después de la microinyección, coloque los embriones en una placa de Petri con medio E tres e incube a 28,5 grados centígrados para un desarrollo normal. Durante las próximas horas y días de desarrollo embrionario, observe los embriones en busca de los fenotipos que le interesen.

Para verificar el éxito de la microinyección, monitorearemos la expresión de GFP en los embriones en desarrollo comenzando en la etapa de escudo mediante microscopía de fluorescencia de embrión completo in vivo. La expresión del constructo es más fuerte durante los eventos tempranos del desarrollo embrionario y, a menudo, disminuirá durante el desarrollo. A medida que el ARN tapado inyectado se degrada gradualmente y depende de la estabilidad de la proteína expresada. Basándonos en los resultados publicados anteriormente, esperamos que la morfina PKD dos imite la curvatura del eje dorsal del cuerpo como se encuentra en el pez cebra mutante PKD dos y presente quistes renales aproximadamente dos o tres días después de la fertilización.

Acabamos de mostrarle una técnica robusta de microinyección para realizar estudios de sobreexpresión de ARNm y knockdown de genes de morfooligonucleótidos en pez cebra al realizar este procedimiento, recuerde que eso es importante. Inyecte con mano firme. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.