Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica
9 de marzo de 2009
Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.
Los peces cebra machos y hembras se aparean en una jaula de cría en la cual los huevos fertilizados caen al fondo, donde pueden recolectarse fácilmente. Luego, los huevos se alinean contra una lámina de microscopio en una placa de Petri. A continuación, se corta la punta del microinyector cargado y se ajustan los parámetros de inyección, de modo que el bolo de inyección tenga un tamaño deseado al medirse con un micrómetro.
Finalmente, los huevos se inyectan uno a la vez a lo largo de la línea. Hola, soy Jonathan Rosen del laboratorio de John MA en el Departamento de Cardiología del Hospital Pediátrico de Boston. Y yo soy Michael Sweeney, también en el laboratorio de VY.
Hoy vamos a demostrar cómo se puede inyectar ARNm o morfolinos en embriones de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los efectos del silenciamiento o sobreexpresión de productos génicos específicos. Así que comencemos.
Para comenzar, será necesario preparar los acuarios para peces y desoves con divisores colocados la noche anterior a la inyección para aumentar la producción total de huevos. Si se desea, los peces pueden colocarse en una proporción de dos hembras por un macho. A la mañana siguiente, tras encender las luces de la sala, retire los divisores de varios acuarios y permita aproximadamente 20 minutos de apareamiento sin interrupciones. Mediante un colador, recoja los huevos de las jaulas de desove y enjuáguelos con agua para huevos antes de verterlos en una placa de Petri.
Con agua de huevo, los peces pueden reagruparse en tanques más grandes para producir rondas adicionales de huevos para inyección. Ajuste el momento de la recolección de huevos para permitir la producción del número máximo de huevos sin dejar que superen la etapa de célula única. Finalmente, coloque un portaobjetos en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 milímetros.
Utilice una pipeta de transferencia para alinear los huevos contra el lateral de la placa, formando una columna única, y luego elimine el exceso de agua de los huevos presionando una toalla Kim contra el lado opuesto a los huevos. A continuación, prepararemos las agujas de microinyección utilizando un micropipeteador polar. Se estirará una capilar de vidrio de un milímetro de diámetro externo para obtener dos agujas y se almacenarán estas agujas en una placa de Petri de 150 milímetros colocándolas sobre rampas de plastilina; las agujas pueden prepararse con antelación.
Utilizamos la siguiente configuración. Calor 6, 45 polos, velocidad 60, 80. Cargue el extremo ancho de la aguja con tres microlitros de material de inyección utilizando una pipeta microloader.
Agite el bolo hacia la punta de la aguja hasta que queden pocas o ninguna burbuja. A continuación, encenderemos la fuente de aire y el microinyector. Inserte la aguja en el microinyector y asegure un sello hermético dentro del alojamiento.
Verifique que el micromanipulador esté en una posición adecuada para permitir un amplio rango de movimiento y ajuste. Acerque la punta de la aguja al plano de visión del microscopio. Eleve bien por encima del portaobjetos y enfoque en la región más delgada de la punta.
Utilice un par de pinzas afiladas para cortar la aguja en un punto que deje la aguja lo suficientemente estrecha como para atravesar la corion y la yema, pero aún capaz de dispensar gotas de tamaño constante. Para calcular el volumen de cada inyección, colocaremos una gota de aceite mineral sobre un micrómetro, insertaremos la aguja en el aceite y presionaremos el pedal con el pie para inyectar una gota de solución en el aceite. Observe el tamaño de la gota mientras ajusta la longitud de la aguja y la presión de inyección según sea necesario al inyectar en el aceite.
Una perla con un diámetro de 0,1 milímetros contiene 500 picolitros de material de inyección. Normalmente se utilizan volúmenes de inyección de 500 picolitros o un nanolitro. Los volúmenes de inyección ideales llenarán aproximadamente el 10% del volumen del huevo.
La calidad de la punta de la aguja es crucial tanto para la facilidad de la inyección como para la calidad y consistencia de los resultados. Ahora es el momento de inyectar para comenzar el procedimiento de inyección. Asegúrese de que los embriones no hayan desarrollado más allá de la etapa de cuatro células.
El embrión debería estar idealmente en la etapa de una sola célula. A continuación, baje la aguja hacia la columna de huevos, atraviese la superficie del corion e ingrese al vitelo de un solo movimiento suave mientras observa. Si se produce aplastamiento o desgarro de la bolsa vitelina, inyecte el material de inyección en el vitelo.
Evite inyectar burbujas de aire y tenga cuidado con los embriones que resulten visiblemente dañados durante la inyección a medida que avanza en la fila. Ajuste la presión según sea necesario para mantener un tamaño constante de la gota y, utilizando la punta de una pipeta, retire los huevos que parezcan no fertilizados o que se hayan destruido durante el proceso de inyección. Tras completar una columna de huevos, utilice un flujo suave de agua para huevos para trasladar los huevos inyectados a una placa de Petri limpia y repita según sea necesario.
Mantenga varios embriones no inyectados como control. Más adelante, durante el primer día, retire los embriones muertos y registre el número de embriones inyectados. Reemplace periódicamente el agua de los huevos en la placa para reducir la posibilidad de infección.
Téngase en cuenta que, dependiendo de lo que se inyecte, los embriones pueden sobrevivir a una tasa menor que sus hermanos no inyectados. Afortunadamente, es fácil inyectar grandes cantidades de ellos, por lo que esto rara vez representa un problema. Ahora mostraremos algunos resultados representativos tanto de la inyección de morfolinos como de ARNm.
El control no inyectado a las 48 horas post-fecundación se ve normal, tal como se esperaba. Sin embargo, los embriones inyectados con el morfolino HG E tres i tres eeg FFR uno, que reduce las isoformas de HG que contienen el primero de los dos repeticiones tipo EEG, presentan edema cerebral e inyección de corazón vidrio. El ARNm también produjo un fenotipo evidente a las 24 horas post-fecundación.
Las cabezas de los controles no inyectados se veían normales. Por el contrario, algunos de los embriones inyectados con la M NNA presentan opia. Acabamos de mostrarle cómo la inyección de morfolinos o ARNm durante la etapa de una sola célula puede aumentar o disminuir la expresión de genes específicos durante el desarrollo posterior. Al realizar este procedimiento, es importante recordar también eso.
Una alta concentración de ARNm o morfolino puede causar letalidad no específica en los embriones con el morfolino. Cada uno debe probarse empíricamente, pero típicamente concentraciones entre 200 y 500 micromolares reducen específicamente la actividad del gen sin causar letalidad general. Eso es todo.
Gracias por vernos y mucha suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este video demuestra la inyección de morfolinos o ARNm en embriones de pez cebra en la etapa de una sola célula para manipular la expresión génica durante el desarrollo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Manipulación genética
Antecedentes
- Los peces cebra se utilizan comúnmente como organismo modelo en biología del desarrollo.
- Las técnicas de inyección permiten el estudio de la función y regulación génica.
- La manipulación de la expresión génica puede revelar información sobre los procesos de desarrollo.
- El manejo cuidadoso de los embriones es crucial para experimentos exitosos.
Objetivo del estudio
- Demostrar la técnica de inyección de ARNm o morfolinos en embriones de pez cebra.
- Observar los efectos del silenciamiento génico o sobreexpresión en el desarrollo.
- Proporcionar un protocolo para investigadores interesados en la manipulación genética.
Métodos Utilizados
- Reproducción de pez cebra y recolección de huevos fertilizados.
- Preparación de agujas para microinyección y carga con el material de inyección.
- Microinyección de embriones en la etapa de una sola célula con precisión.
- Supervisión del desarrollo embrionario y registro de los resultados.
Resultados principales
- Los embriones inyectados exhibieron fenotipos específicos según el material utilizado.
- Los embriones control se desarrollaron normalmente, mientras que los inyectados mostraron resultados variables.
- La inyección de morfolino provocó edema cerebral observable en algunos casos.
- Las inyecciones de ARNm resultaron en cambios desarrollados distintos.
Conclusiones
- La técnica altera eficazmente la expresión génica en embriones de pez cebra.
- Es esencial una cuidadosa optimización de los parámetros de inyección para lograr el éxito.
- Los resultados destacan el potencial de este método para estudiar la función génica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microinyección en embriones de pez cebra permite una modulación rápida y escalable de la expresión génica para la validación temprana de objetivos en el descubrimiento de fármacos. La técnica facilita el cribado fenotípico de alto rendimiento al permitir la reducción específica o sobreexpresión de genes determinados para evaluar sus consecuencias funcionales en un sistema vertebrado. Este enfoque aporta valor mecanicista para la reducción de riesgos al vincular la perturbación genética con fenotipos de desarrollo observables, informando así las decisiones de confianza en objetivos y de selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la reducción dirigida de la expresión génica o la sobreexpresión para aclarar la participación de vías específicas.
- Valor operativo: Facilita la generación rápida de modelos de pérdida de función y ganancia de función para reducir riesgos en dianas antes del desarrollo de ensayos.
- Valor predictivo: Posibilita la reducción de riesgos biológicos al vincular la modulación genética con resultados fenotípicos en un sistema vertebrado relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce embriones estandarizados y modulados genéticamente, adecuados para lecturas fenotípicas posteriores en campañas de cribado.
- Valor operativo: Permite la preparación de cientos de embriones inyectados por hora, lo que apoya formatos de ensayo escalables y reproducibles.
- Valor traslacional: Genera fenotipos cuantitativos y observables (por ejemplo, cambios morfológicos) que sirven como puntos finales robustos para el cribado de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona continuidad desde el descubrimiento de la función génica hasta la validación preclínica mediante la modelización de variantes génicas humanas en un contexto vertebrado.
- Valor operativo: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al identificar fenotipos que se correlacionan con la eficacia o toxicidad de la modulación del blanco.
- Confianza predictiva: Ayuda a priorizar blancos según la gravedad y especificidad fenotípica observadas tras la inyección, reduciendo los falsos positivos en la identificación de compuestos líderes.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la validación del blanco mediante perturbación genética y permitiendo la transición hacia cribado fenotípico e identificación de compuestos activos cuando se cuentan con resultados observables y dependientes de la dosis.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir la modulación precisa de la expresión génica para evaluar la necesidad y suficiencia del blanco en las vías de desarrollo.
- Selección: Genera sistemas biológicos listos para ensayos con fondos genéticos estandarizados para una evaluación consistente de compuestos.
- Análisis: Permite la cuantificación fenotípica (por ejemplo, frecuencia de defectos morfológicos) para comparar condiciones y evaluar efectos genéticos o farmacológicos.
- Investigación Traducional: Conecta la manipulación genética con fenotipos de desarrollo que modelan mecanismos de enfermedades humanas, apoyando la validación alineada con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la interrogación iterativa de blancos en múltiples genes y vías dentro de proyectos del portafolio.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la perturbación genética directa en un modelo vertebrado.
- Valor operativo: Ofrece alta reproducibilidad y escalabilidad, con la capacidad de inyectar cientos de embriones por hora utilizando protocolos estandarizados de microinyección.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia fenotípica temprana de la modulación del blanco, reduciendo la inversión en blancos no viables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo al vincular fenotipos específicos de genes con resultados del desarrollo, orientando la asignación de capital en la selección de blancos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, manipulación de embriones y técnica de microinyección para garantizar viabilidad y consistencia.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo microinyectores, fuentes de aire, micrómetros y tiradores de agujas, para un control preciso del volumen.
- Necesita la estandarización del volumen de inyección, calidad de las agujas y estadios embrionarios entre operadores y sitios para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método en diferentes fondos genéticos o modelos de enfermedad, a fin de mantener la relevancia fenotípica.
- Incluye limitaciones prácticas, como la sensibilidad del embrión al trauma de inyección y efectos fuera del blanco dependientes de la concentración, lo que requiere una optimización empírica por cada blanco.
