Name: Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda el aislamiento de islotes pancreáticos humanos mediante digestión automatizada con colagenasa y recolección de tejido. Este método mejora la calidad y cantidad de islotes para trasplante clínico en diabetes.

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Apoyado con fondos de la Universidad de Illinois en Chicago, así como células de los islotes del Centro de Recursos NIH (RFA-05-003 RR), la Fundación Christopher, la Fundación Efroymson, y la Fundación Tellabs.

1. Facilidad de configuración <ol><li> El aislamiento de islotes humanos es un procedimiento sensible al tiempo que implica el trabajo en equipo, y por lo tanto, cuatro personas se necesitan para llevar a cabo este procedimiento. El equipo está liderado por el cirujano, que disecciona y cannulates el páncreas. </li><li> El aislamiento de islotes comienza en el momento que el equipo entra en la instalación de aislamiento de islotes UIC. Miembros del equipo de asegurarse de que todos los instrumentos necesarios, como la centrífuga, se comprueba y se enciende. También asegúrese de desinfectar todas las campanas y las superficies. </li><li> Dos personas se creó la mesa de la canalización, máquina granizado, el circuito de la digestión, la unidad de la perfusión, la máquina de purificación de COBE, y mesas quirúrgicas. </li><li> Al mismo tiempo, dos miembros del equipo preparará los medios de comunicación que se necesita durante el aislamiento. </li><li> A continuación, los tubos de la bacteriología (botellas, tubos, la forma y la bolsa), los tubos de muestreo (pre-llenado con lavado), y los tubos de evaluación y las placas están preparadas. </li><li> Prepare el tubo de depuración establecidos de la siguiente manera: El tubo de vacío y primera marca de 150 ml, tubos de 2.12 con 200 ml de M199 medios suplementados con albúmina humana (solución de lavado) y marcados con 230 ml y, finalmente, un tubo de 50 ml cónicos llena con 50 ml de solución de lavado. Una vez que estos pasos de preparación se completa estamos listos para empezar a preparar la perfusión y el páncreas. </li></ol> 2. Páncreas preparación y la perfusión <ol><li> Para comenzar la preparación y la perfusión del páncreas, un operario retira el órgano de los envases utilizando una técnica estéril. El cirujano de transferencia de páncreas a la mesa de la descontaminación. </li><li> El cirujano llenar una jeringa de 60 ml con la solución de preservación de páncreas original y entregarlo a un operador, que se utiliza para rellenar preparado &quot;Adquisiciones&quot; botellas de bacteriología. </li><li> Después de una inspección visual para determinar si el órgano es adecuado para el aislamiento de los islotes (Si el páncreas está dañado durante la adquisición o anormal anatómica, no se puede utilizar para el aislamiento de los islotes), el cirujano le preguntará al operador preparar la colagenasa. Recuerde que el tiempo que re-suspensión varía entre las marcas de enzimas diferentes y mucho. </li><li> Cuando el cirujano está listo, poner las soluciones de descontaminación (Betadine, Fungizone / cefazolina y HBSS) a la mesa de la descontaminación y verter en los contenedores apropiados. Cirujano realiza la descontaminación del páncreas de lavado de un minuto, el páncreas en cada una de las soluciones de descontaminación. El páncreas se coloca en un pequeño frasco estéril en el que se pesaba. Después de que el peso se introduce en el registro del lote, el páncreas se coloca en la bandeja de la canalización con alguna solución de preservación. </li><li> El cirujano exponer y cortar parcialmente el conducto principal y canular cada mitad del páncreas con una cánula. La cánula se asegura con sutura. Para la perfusión del páncreas, en primer lugar pasar a la unidad de la perfusión y se vierte la solución de la enzima en la cuenca. Tiempo de perfusión total es de unos 10 minutos, a 80 mmHg durante 5 minutos, luego a 180 mmHg durante 5 minutos. Páncreas distendido después de la perfusión. </li><li> Mueva el páncreas perfundido a la sartén la canalización, donde se recorta el tejido graso del páncreas con cuidado. A continuación, corte el páncreas en 10-12 piezas y traslado a Ricordi Cámara para la digestión. </li></ol> 3. Páncreas digestión <ol><li> Para empezar a paso de digestión, el páncreas para la transferencia de la cámara de Ricordi vacía, añadir un 2,5 ml frasco de Pulmozyme, poner en la pantalla (evitar gran parte de bloque de tejido de la cámara), cerca de la cámara, y llenar el sistema. </li><li> Comenzar a bombear la solución durante 5 minutos. Agite suavemente la cámara para dispersar uniformemente la solución caliente a través. Después de cinco minutos, agitar suavemente la cámara para la fase de digestión de todo. Mantener la temperatura a 37 ˚ C. </li><li> Roca de la cámara suavemente hasta que la temperatura alcanza los 37 °, se sacude la cámara. Tomar una muestra cada dos minutos y detectar si islotes libres se encuentran bajo el ámbito de aplicación. Registrar la información de la evaluación de los islotes en la mesa de la digestión del registro del lote. Seguir para determinar el porcentaje de islotes hasta que haya un 50% de ellos flotando libremente y aislado en la solución. </li></ol> 4. Tejido colección <ol><li> Una vez que el 50% de los islotes se encuentran libres en las muestras, la digestión se detiene mediante la adición de una solución fría de dilución RPMI en el circuito. Tejido se recoge en 500 ml tubos cónicos precargada con 30 ml de albúmina humana. Una vez que los tubos se hacen girar, aspiración el sobrenadante y lavar el precipitado con solución de lavado en frío. Girar los tubos cónicos a 1100 RPM (revoluciones por minuto) durante 1 minuto, 4 ˚ C. </li><li> Combine todos los tubos de recogida de suspensión de tejido pancreático digieren en un solo cónico de 500 ml. Cuando el tubo está lleno de tejido lavado, centrifugado y repita el proceso de lavado hasta que todo el tejido ha sido lavada varias veces. Girar el tubo y la transferencia de los tejidos en un solo tubo de 250 ml cónico. Llevar el volumen hasta 250 ml conM199 solución de lavado suplementado con HA y prepararse para el muestreo. </li><li> Tomar una muestra de 1 ml con una pipeta y se añade a un tubo cónico de 15 ml precargada con 9 ml de solución de lavado. A continuación, mezclar suavemente invirtiendo el tubo cónico de 15 ml y de esto, la muestra de 1 ml directamente en una placa de red de conteo. Contar las células, y calcular el número de células con un factor de dilución de 2500 (10x250). </li><li> Girar el tubo de 250 ml y añadir 150 ml de la Universidad de Washington (Universidad de Wisconsin), solución que suele utilizar para la preservación de órganos. Cuando la Universidad de Washington, se añade, mezcla de la suspensión celular a fondo con la pipeta. Registrar y comunicar al operador de la purificación, el tiempo de inicio en la Universidad de Washington. Deje el tubo (s) en el hielo y agitar de vez en cuando. Ahora los islotes se pueden purificar aún más. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Hay una variedad de factores que afectan el resultado de aislamiento 9,10. Entre ellos, la digestión del tejido pancreático desempeña un papel destacado. Con base en nuestra propia experiencia humana aislamiento de islotes, se resumieron los siguientes puntos críticos, que podrían influir en el rendimiento y la calidad de los islotes. <ol><li> El tiempo de digestión es diferente cuando los diferentes tipos de enzimas que se utilizan. </li><li> Tan pronto como el 40-50% de los islotes completamente separados del teji...

<table><tbody><tr><td>Máquina para hielo picado</td><td>equipo</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>producir hielo estéril</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido MZ6 TLBD4.1</td><td>equipo</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular con cuadrícula de 2 mm</td><td>equipo</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>conteo de islotes</td></tr><tr><td>Baño de agua digital EX7</td><td>equipo</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>equipo</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>Balanza MonoBloc AB 104-S</td><td>equipo</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>medir el peso del páncreas</td></tr><tr><td>Controlador de velocidad MasterFlex II</td><td>equipo</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>ajustar la velocidad de flujo durante la digestión</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>equipo</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de perfusión</td><td>equipo</td><td>Hecho a medida</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Enfriador para unidad de perfusión</td><td>equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Ricordi</td><td>equipo</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Solución de dilución RPMI</td><td>reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>Solución de la Universidad de Wisconsin (UW)</td><td>reactivo</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina amortiguada de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina humana al 25 %</td><td>reactivo</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>Medio M199 (solución de lavado)</td><td>reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa NB1 grado GMP</td><td>reactivo</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa neutra NB1 grado GMP</td><td>reactivo</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>reactivo</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>reactivo</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Ditizona</td><td>reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento humanos islote pancreático: parte i: la digestión y la acumulación de tejido pancreático

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Gestión de la diabetes tipo 1 es una carga, tanto para el individuo y la sociedad, con un costo de más de 100 millones de dólares anuales. A pesar del uso generalizado de la monitorización de la glucosa y las nuevas formulaciones de insulina, muchas personas aún se desarrollan devastadoras complicaciones secundarias. El trasplante de islotes pancreáticos puede restaurar un control casi normal a la glucosa en pacientes diabéticos<sup&gt; 1</sup&gt;, Sin el riesgo de episodios hipoglucémicos graves que se asocian a la terapia intensiva de insulina. Proporcionar la masa suficiente de islotes es importante para el trasplante de islotes exitosos. Pero lo más característico de los donantes, la obtención de órganos y la preservación de afectar el resultado de aislamiento<sup&gt; 2</sup&gt;. En la Universidad de Illinois en Chicago (UIC), hemos desarrollado un protocolo de éxito en el aislamiento con un gradiente de depuración mejorada<sup&gt; 3</sup&gt;. El programa se inició en enero de 2004, y más de 300 aislamientos se realizaron hasta noviembre de 2008. El páncreas se enviaron en soluciones de preservación en frío (UW de la Universidad de Wisconsin o HTK, histidina-triptófano-cetoglutarato)<sup&gt; 7.4</sup&gt; Para el Laboratorio de aislamiento de células en la UIC para el aislamiento de los islotes. Islotes pancreáticos fueron aislados usando el método de la UIC, que es una versión modificada del método descrito originalmente por Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. En pocas palabras, después de limpiar el páncreas del tejido circundante, que fue perfundido con solución enzimática (colagenasa Serva + neutro de la proteasa o enzima Sigma V). El páncreas distendido fue trasladado a la cámara de digestión Ricordi, conectado a una modificación, el sistema de tubería cerrada la circulación, y calentado a 37 ° C. Durante la digestión, la cámara se agita suavemente. Las muestras se toman de forma continua para controlar el progreso de digestión. Una vez islotes libres fueron detectados en el microscopio, la digestión fue detenido por lavado en frío (4 ° C) RPMI solución de dilución (Mediatech, Herndon, VA) en el sistema de circulación para diluir la enzima. Después de ser recogidos y lavados en los medios de comunicación M199 suplementado con albúmina humana, el tejido se tomaron muestras para el recuento de pre-purificación y se incubaron con solución UW antes de la purificación. Proceso de purificación se describe en la Parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes.

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

El manejo de la diabetes tipo 1 representa una carga tanto para el individuo como para la sociedad, con un coste anual superior a los 100 mil millones de dólares. A pesar del uso generalizado de...

Este procedimiento comienza con la obtención de tejido pancreático de donante normal. Tras un breve paso de recorte, el páncreas distendido se corta en trozos uniformes y se traslada a la cámara de digestión. El páncreas se canula y una solución de colagenasa se infunde a través de la cánula mediante una máquina de perfusión automatizada.Finalmente, el tejido pancreático se recoge en tubos cónicos de gran volumen y, en última instancia, se purifica aún más para el trasplante de islotes, lo cual se mostrará en un video posterior. Hola, soy American Chief del Laboratorio del Programa de Islotes Humanos del Departamento de Encuestas de la Universidad de Illinois en Chicago. Hola, mi nombre es Barbara Barbero y también pertenezco al Programa de Islotes Humanos.Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento de islotes pancreáticos humanos. Utilizamos este procedimiento en nuestra instalación para obtener islotes humanos de alta calidad con fines clínicos. Comencemos.El aislamiento de islotes humanos es un procedimiento sensible al tiempo que requiere trabajo en equipo, por lo que se necesitan cuatro personas para llevarlo a cabo. El equipo está liderado por el cirujano, quien

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Biología

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes), utilizando un método modificado automatizado.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Las células metaplásicas pancreáticas son precursoras de células malignas que dan lugar a tumores pancreáticos. Sin embargo, aislar células pancreáticas viables intactas es un desafío. Aquí, presentamos un método eficiente para la disociación del tejido pancreático. A continuación, las células pueden utilizarse para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) o para el cocultivo bidimensional o tridimensional.

Disección de tejido pancreático para aislar células individuales viables

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Aprenda el aislamiento de islotes pancreáticos humanos mediante digestión automatizada con colagenasa y recolección de tejido. Este método mejora la calidad y cantidad de islotes para trasplante clínico en diabetes.

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