Monitoreo hormonas vegetales en las respuestas de estrés

Este procedimiento comienza con la homogeneización del material vegetal utilizando perlas cerámicas y la subsiguiente extracción con metano diclorado para obtener la fase orgánica. Tras la centrifugación, las muestras se secan al aire y se preparan para la extracción en fase de vapor. Después de la elución proveniente de los filtros de extracción en fase de vapor, se puede proceder al análisis de hormonas vegetales mediante espectrometría de masas y cromatografía de gases.

Hola, soy Marie Engelberg del Laboratorio JU Engelberg en el Departamento de Biología de la Universidad de Texas aquí en San Antonio, y yo soy Ju Engelberg. Hoy les mostraremos un procedimiento sencillo para la cuantificación simultánea de hormonas vegetales importantes. Utilizamos este método rutinariamente para monitorear los cambios en estas hormonas y en las plantas frente a la técnica de recompensa por insectos.

También podemos monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos. Comencemos. Para la extracción, primero debe preparar viales de dos mililitros con tapa roscada.

Para hacer esto, agregue 400 microlitros de solución de extracción y 10 microlitros del estándar interno respectivo a 10 nanogramos por microlitro a un vial. A continuación, congele los viales en nitrógeno líquido. Después de congelar, agregue las perlas cerámicas a los viales.

Mientras los viales aún estén colocados en nitrógeno líquido, agregue el material vegetal entre 50 y 200 miligramos. Tenga en cuenta que el peso del material vegetal añadido debe estimarse antes del procesamiento posterior para permitir una cuantificación exacta más adelante, la cual se basa en el peso fresco. Asegúrese de que todo el nitrógeno líquido se haya evaporado antes de cerrar herméticamente el vial con una tapa.

Asegúrese de que la tapa tenga un sello de goma para evitar derrames de disolventes y compuestos extraídos durante la homogeneización. Homogenice el tejido en un homogeneizador rápido o en un molino de bolas PSUs. Utilice el homogeneizador a una velocidad de 6.000 para PSUs durante 30 segundos.

Una vez homogeneizado, retire los viales del homogeneizador individualmente y abra cuidadosamente la tapa para añadir un mililitro de diclorometano a cada muestra, cierre nuevamente los viales firmemente y homogenice durante 10 a 15 segundos a 6.000, después de la homogeneización, transfiera los viales a una centrífuga de banco y separe la fase orgánica de la fase acuosa a 10.000 veces G durante 60 segundos. Tras la separación de fases, transfiera la capa verde inferior de los viales individuales a un vial de vidrio limpio de cuatro mililitros.

Esta es la fase orgánica que contiene las hormonas y los estándares internos. Evite la transferencia de agua o de la fase superior; evapore el disolvente con aire mediante un sistema de aspiración durante aproximadamente de 10 a 25 minutos. La duración dependerá de la muestra.

Verifique con una punta de flujo de aire para observar cuidadosamente si las muestras están secas. Asegúrese de no secar en exceso las muestras, ya que esto podría provocar la pérdida de compuestos. Una vez que las muestras estén secas, podemos comenzar la metilación de los compuestos que contienen ácido carboxílico en nuestras muestras.

Primero, agregue 100 microlitros de una mezcla de éter D etílico y metanol nueve a uno en volumen a volumen a cada vial. A continuación, agregue cuatro microlitros de una solución dos molar de diazometano trimetil Cyl en hexano. Cierre inmediatamente los viales con una tapa roscada de apertura superior provista de un septo de silicona revestido con teflón y agite suavemente los viales; incube a temperatura ambiente durante 25 a 30 minutos.

Encienda un bloque calefactor y ajústelo a la temperatura deseada de recolección. La volatilidad de los compuestos metilados variará según su tamaño y el número de grupos polares. Las temperaturas pueden oscilar entre 80 y 200 grados; después de una incubación de 30 minutos, detenga la reacción de metilación añadiendo cuatro microlitros de una solución de ácido acético dos molar en hexano a cada vial.

Esto se hace para evitar reacciones secundarias no deseadas. Los filtros utilizados para la extracción en fase de vapor son hechos a mano. Están hechos de tubos de teflón.

Por un lado, se inserta un tubo de vidrio bien ajustado de aproximadamente cuatro centímetros de longitud. Puede observarse los dos discos de malla de acero inoxidable, que contienen entre 20 y 30 miligramos de absorbente. Lave los filtros que se utilizarán para la recolección de las hormonas vegetales metiladas y volátiles usando 200 microlitros de metanol.

A continuación, lave los filtros dos veces con 200 microlitros de cloruro de metileno. Deje secar al aire para eliminar el disolvente restante de los filtros. Ahora los filtros pueden utilizarse para la captura de hormonas volátiles mediante extracción en fase de vapor.

Después de 30 minutos de incubación de las muestras, los septos de goma de los tapones de los viales de cuatro mililitros se cortan con un bisturí. Ahora el material extraído está listo para ser recolectado y así recoger las hormonas vegetales mediante extracción en fase de vapor. Los filtros limpios se conectan a líneas de vacío individuales con un caudal de aproximadamente 800 mililitros por minuto.

A continuación, los filtros se insertan en el vial a través de las septas cortadas. También se inserta una punta de pipeta pequeña para actuar como entrada de aire. Durante esta parte inicial del procedimiento, los viales con los filtros insertados deben mantenerse en posición vertical para evitar que cualquier líquido dentro del vial entre en contacto con la punta del filtro, lo cual contaminaría el filtro.

Y posteriormente, sostenga los viales a mano hasta que todo el líquido se evapore a través del filtro. Luego, coloque los viales con los filtros sujetos sobre el bloque calefactor y recoja los compuestos evaporados por calor durante tres minutos. Después de este último paso de extracción en fase de vapor, coloque los viales con los filtros aún sujetos en un soporte y déjelos enfriar.

Prepare viales de GC de 1,5 mililitros con insertos cuando los filtros hayan alcanzado la temperatura ambiente. Nuevamente, agregue con un bucle 150 microlitros de diclorometano a los viales. Después de expulsar el disolvente restante del filtro, tápese los viales y ahora pueden analizarse mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.

Para el análisis, utilice un cromatógrafo de gases equipado con un inyector split-splitless acoplado a un espectrómetro de masas que funcione en modo de ionización química; tras la inyección, los compuestos se separan en una columna HP-1 MS mantenida a 40 grados Celsius durante un minuto. La temperatura se programa a 15 grados Celsius por minuto hasta alcanzar 250 grados Celsius, donde se mantiene durante 10 minutos, utilizando helio como gas portador a un flujo constante de 0,7 mililitros por minuto. Para el análisis basado en MS, tanto un espectrómetro de masas cuádruplo como uno basado en trampa de iones pueden utilizarse como gas CI.

Se puede utilizar isobutano o metanol. Sin embargo, en cada caso, se deben verificar los fragmentos de la reacción de ionización antes de crear los programas de conteo de iones seleccionados. Utilizamos un sistema de cromatógrafo de gases GC 3,900 acoplado a un espectrómetro de masas Saturn MS 2200, empleando metanol como reactivo de ionización por química de gases.

Consulte nuestro protocolo escrito para obtener una descripción de nuestro programa. Asegúrese de que todos los compuestos se identifiquen mediante comparación con estándares auténticos disponibles comercialmente. La cuantificación de JA, SA y ABA se realiza correlacionando el área del pico de los iones extraídos con el área del pico de los iones extraídos del estándar interno respectivo, y también se basa en el peso fresco del material vegetal utilizado.

Después de extraer los datos de los archivos GCM S y realizar algunos cálculos, descubrimos que el ethin indujo acumulaciones considerables de ácido salicílico, ácido monico y también ácido abscísico en comparación con los controles no tratados. Los datos para cada hormona individual se obtuvieron de una sola corrida y demuestran la capacidad de este método para el análisis multiplex de hormonas. Acabamos de mostrarle un procedimiento sencillo pero efectivo para extraer y cuantificar hormonas vegetales importantes y otros compuestos señalizadores.

Es fácil de realizar y la mayoría de las herramientas que ha visto pueden fabricarse fácilmente con materiales de laboratorio estándar. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.