Name: Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a evocar potenciales sinápticos en larvas de Drosophila usando Channelrhodopsin2 y luz azul. Este método optogenético ofrece una alternativa accesible para estudiar la fisiología de la unión neuromuscular en investigación y docencia.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones RO1GM MH-33205 y 067284-LC a Griffith y por una beca de la Universidad de Brandeis de investigación de verano para universitarios NJ Hornstein. Los experimentos preliminares de esta técnica se realizaron en el Laboratorio de Biología Marina, como parte de los 2.008 sistemas neurales y por supuesto el comportamiento de verano (NIMH subvención: R25 MH059472) en Woods Hole, MA.

Parte 1: cuidado de los animales y cruces genéticos <ol><li> Mantener la UAS-ChR2 y OK371-GAL4 líneas de mosca en botellas separadas con los medios de comunicación estándar de mosca 8. </li><li> Recoger las vírgenes de las líneas de vuelo OK371-GAL4 y los hombres de UAS-ChR2 líneas. </li><li> Poner a hombres y mujeres en un frasco que contiene los medios de comunicación estándar de mosca se mezcló con 1 mM de todo-trans retinal (ATR). ATR alimentos debe ser hecha por los primeros medios de fusión vuelo regular en el microondas durante ~ 1 minuto. Una vez fundido, dejar enfriar durante unos 30 segundos a un minuto y añadir 100 ml de 100 mM ATR en EtOH al 100% por cada 10 ml de los medios de volar. Viales lugar en el hielo, a continuación, almacenar en un lugar oscuro a 4 ° C. </li><li> Vamos compañero de moscas y ponen sus huevos en un lugar oscuro a 22-25 º C. </li><li> Espere de 3-4 días hasta el 3 de larvas son visibles, en ese momento, disponer de las moscas adultas. </li></ol> Parte 2: configuración del Rig <ol><li> Adjunte cualquier pieza de 10x disección del ojo alcance (en nuestro caso, de Carl Zeiss, Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), a la fuente de luz LED azul con disipador de calor (laboratorios de Thor, www.thorlabs.com, Newton, Nueva Jersey ). Adjuntar a base magnética con un mensaje y una pinza. Cubierta del disipador de calor con un escudo de una toma de tierra para reducir el ruido eléctrico generado por la fuente de luz. </li><li> Un lugar magnético base con fuente de luz en la mesa de aire de la electrofisiología equipo. </li><li> Conecte la fuente de luz para controlar el circuito y conectar el circuito de control de fuente de alimentación externa (Powerlab 30.04, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO). </li><li> Dar 1-5 pulsos V al circuito de control para activar la luz azul. </li><li> Ajuste base magnética y fuente de luz hasta haz de luz azul se centra en el área a ser ocupada por la disección de las larvas. </li></ol> Parte 3: Disección <ol><li> Coloque seis pines 0,1 mm de insectos en el suelo de un plato Sylgard a ambos lados. </li><li> Eliminar un 3 º estadio las larvas de los medios de comunicación de alimentos y el lugar en cualquier plástico Petri plato. </li><li> Enjuague las larvas con solución salina para eliminar la comida. </li><li> Coloque las larvas en la disección plato cerca de las clavijas tiró y añadir solución salina a nivel medio. </li><li> Orientar a las larvas de modo que usted puede ver dos tubos plateados (tráquea) que se ejecuta a lo largo de la superficie dorsal del animal. </li><li> Inserte un alfiler directamente en la cola entre los tubos traqueales. Mantenga las larvas y coloque un alfiler segundo en su cabeza, asegurándose de estirar el cuerpo a lo largo. </li><li> Haga una pequeña incisión cerca de la cola, y continuar hasta la longitud del cuerpo. Asegúrese de que las puntas de las tijeras son criados para no cortar accidentalmente nervios ventral y / o los músculos del cuerpo de la pared. </li><li> Coloque los cuatro pernos en las cuatro esquinas de los animales ahora abdomen abierto. Los puso en el plato de disección con el fin de redondear los animales. Preparación pasador enseñado. </li><li> El uso de pinzas y tijeras, quitar las tripas del animal, la tráquea y los cuerpos grasos. </li><li> Enjuague la preparación con solución salina. </li><li> Localice los lóbulos frontales (como se ve en la figura A) y el ganglio ventral de la preparación. </li><li> Utilizando micro-tijeras, corte con cuidado a través del ganglio ventral justo detrás de los lóbulos frontales. </li></ol> Parte 4: grabación de los músculos y la estimulación de luz azul <ol><li> Tirar de un electrodo 10-20 μω utilizando un extractor de electrodos electrónico (Sutter Instruments). </li><li> Rellene el electrodo tiró con 3 M KCl. </li><li> Lugar lleno de electrodos en el soporte del electrodo y la punta del electrodo maniobra con un micromanipulador cerca de preparación de las larvas bajo microscopio de disección en la electrofisiología equipo. </li><li> Identificar los músculos 6 (M6) en cualquier segmento de la pared del cuerpo (figura A). </li><li> Inserte con cuidado el electrodo en M6 y el reloj para hiperpolarización rápida. Potenciales músculo en reposo la membrana debe estar entre -30 mV a -70 mV. </li><li> Ajuste la luz azul para que diseca preparación se centra en el haz de luz. </li><li> Dar 20-100 pulsos de tensión ms al circuito de control. Incremental incremento de la tensión suministrada al circuito de control. Esté atento a potenciales de unión de excitación en la célula muscular (fig. 1B). </li></ol> Los resultados representativos: La figura 1A muestra un esquema del sistema de grabación y preparación de filetes. La figura 1B muestra EJP típica provocada por los pulsos de luz corta. Amplitud EJP muestra se resume la amplitud de dos neuronas motoras inervan conocida tanto por M6. Menor intensidad de la luz sólo se activa una unidad de motor (datos no mostrados). <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Figura 1" width="600" height="373" /> Figura 1: Un diagrama esquemático) General de un equipo de grabación intracelular y con LED azul. Cerebro (Br) se retira para inhibir la actividad rítmica en el ganglio ventral (VG). ChR2 se expresa en las neuronas motoras mediante el sistema GAL4-UAS. B) el registro intracelular de un músculo M6. 40 ms pulsos de luz azul (de 127 mW / mm 2) de forma fiable evocan grandes potenciales sinápticos (asteriscos) en M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

No tenemos ningún conflicto de intereses a revelar.

Los pasos críticos incluyen tanto la disección inicial y la entrada de las células musculares. Si los nervios se cortan o músculo dañado durante la disección inicial es difícil continuar con el resto del experimento. Durante la disección, se debe tener mucho cuidado con el ángulo de la disección de las tijeras hacia arriba tanto como sea posible durante la incisión dorsal. Durante el paso crucial en segundo lugar, entrar en una célula muscular, se debe vigilar a una hiperpolarización últimos ~ 30 mV. Valores por encima ...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Alfileres minutens</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Plato para disección</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Amplificador intracelular Neuroprobe y etapa frontal</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Sistema de adquisición de datos Powerlab 4/30&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Estimulador Grass</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Computadora de escritorio</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lupa de disección</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Fuente de luz</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Medio para moscas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retinal todo-trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; Moscas</td><td>Centro de Reserva Bloomington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; Moscas</td><td>Laboratorio Fiala, laboratorio Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circuito controlador de LED</td><td>Construido en el laboratorio Griffith</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;Compuesto por: &lt;br/&gt;1. Buck Puck de 200 mA&lt;br/&gt;2. LED azul&lt;br/&gt;3. Cable aislado&lt;br/&gt;4. Protoboard&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Disipador de calor para LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mesa antivibraciones</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>Construida en el laboratorio Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipulador Leica Leitz M</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Vidrio borosilicato</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tirador de electrodos</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solución salina HL 3.1 con Ca2+ 0,8 mM</td><td></td><td></td><td>Contenido (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0,8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4 Sacarosa:115&lt;br/&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehalosa: 5 HEPES</td></tr><tr><td>Herramientas para microdisección</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en drosophila las uniones neuromusculares

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas preparación neuromuscular ha demostrado ser una herramienta útil para el estudio de la fisiología sináptica<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. En la actualidad, el único medio disponible para evocar potenciales excitatorios de la unión (EJPs) en esta preparación implica el uso de electrodos de succión. En los dos laboratorios de investigación y enseñanza, los estudiantes suelen tener dificultades para maniobrar y manipular este tipo de electrodo de estimulación. En el presente trabajo, se muestra la forma de estimular de forma remota los potenciales sinápticos en el larval NMJ sin el uso de electrodos de succión. Al expresar channelrhodopsin2 (ChR2)<sup&gt; 4,5,6</sup&gt; En<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuronas motoras con el<em&gt; GAL4-UAS</em&gt; Sistema de<sup&gt; 7</sup&gt;, Y hacer cambios menores a un equipo de electrofisiología básica, hemos sido capaces de evocar de forma fiable EJPs con pulsos de luz azul. Esta técnica podría ser de particular utilidad en los laboratorios de neurofisiología en la enseñanza plataforma estudiante de tiempo la práctica y los recursos son limitados.

Este procedimiento utiliza una luz azul activa el canal de las algas y las células específicas de las herramientas de la expresión genética para evocar los potenciales sinápticos con pulsos de luz en la unión neuromuscular (UNM), en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Esta técnica es un barato y fácil de usar alternativas a la estimulación de electrodos de aspiración para los estudios de la fisiología sináptica en laboratorios de investigación y enseñanza.

Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares

La preparación neuromuscular de larvas de Drosophila ha demostrado ser una herramienta útil para estudiar la fisiología sináptica1,2,3. Actualmente, el único medio disponible...

Este procedimiento comienza con el cultivo de drosófila. Tercer estadio larval con el genotipo adecuado en alimento que contiene todo el trans-retinol. Cada larva se fija por la cabeza y la cola.Luego, aplanar la preparación. A continuación, se cortan el cerebro y los nervios posteriores para detener la actividad motora rítmica. Después, se ajusta y enfoca la fuente de luz LED azul con su caja de control sobre la preparación.Finalmente, use un electrodo afilado para empalar el músculo seis. Luego, aplique pulsos de luz con una fuente de voltaje. Hola, soy Nicholas Marstein del laboratorio de la Dra. Leslie Griffith, del Departamento de Biología de la Universidad de Brandeis.Hola, soy Stefan Pulver, también del Laboratorio Griffith. Hoy les mostraremos el procedimiento para evocar potenciales sinápticos con canal de fuga ausente dos en la unión neuromuscular de larvas de drosófila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la fisiología sináptica y la drosófila.También lo utilizamos para enseñar fisiología sináptica y laboratorios docentes. Así que comencemos. Para iniciar este protocolo, mantenga las líneas de moscas UAS channel redsin two y okay, 3 7, 1 gal four en frascos separados que contengan medio estándar para moscas.Recolecte vírgenes de las líneas de moscas 3 7, 1 gal, cuatro y machos de las líneas UAS channel redsin. Dos líneas. A continuación, prepare un medio para moscas mezclado con retinol todo-trans de un milimolar o a TR. Para ello, derrita el medio estándar para moscas en un microondas durante aproximadamente un minuto.Una vez fundido, deje que el medio se enfríe durante aproximadamente 30 a 60 segundos, y luego agregue 100 microlitros de 100 milimolar de a TR en etanol al 100% por cada 10 mililitros de medio para moscas. Cuando los frascos que contienen el medio con a TR estén listos, coloque los machos y hembras recolectados en cada frasco. Coloque los frascos en un área oscura a 22-25 grados Celsius para permitir que las moscas se apareen y pongan huevos; espere cuatro o cinco días hasta que las larvas de tercer estadio sean visibles.En este momento, puede desechar las moscas adultas. Ahora estamos listos para proceder con la configuración del equipo de electrofisiología. Conecte cualquier ocular de microscopio de disección a una fuente de luz LED azul con un disipador de calor.Utilice un soporte y una abrazadera para fijar una base magnética al ocular y a la fuente de luz LED. Coloque la base magnética sobre la mesa antivibratoria del equipo de electrofisiología. A continuación, conecte la fuente de luz a un circuito de control y luego conecte el circuito de control a una fuente de voltaje externa.Utilizamos la salida de voltaje del sistema de adquisición de datos de electrofisiología PowerLab fabricado por AD Instruments. Una vez conectado a la fuente de voltaje, aplique pulsos de uno a cinco voltios al circuito de control para activar la luz azul; ajuste la base magnética y la fuente de luz hasta que el haz de luz azul esté enfocado en la zona que ocupará la disección de la larva. Tras realizar los ajustes adecuados, estamos listos para pasar a la disección larval.Para comenzar con la disección, coloque seis alfileres de 0,1 milímetros en el fondo de un recipiente revestido con Sogar. Retire una larva de tercer estadio del medio de cultivo y colóquela en cualquier placa de Petri de plástico. Enjuague las larvas con solución salina para eliminar cualquier alimento adherido a ellas.Luego coloque las larvas en el platillo de disección cerca de los alfileres estirados y llene el platillo hasta la mitad con solución salina. Ahora oriente las larvas de manera que pueda ver dos tubos plateados que corren a lo largo de la superficie dorsal del animal. Estos tubos plateados son la tráquea.Inserte un alfiler grande directamente en la cola, entre los tubos traqueales. Sujete las larvas y coloque un segundo alfiler grande en la cabeza. Asegúrese de estirar el cuerpo longitudinalmente al insertar el alfiler.Utilice tijeras para hacer una pequeña incisión cerca de la cola. Continúe la incisión a lo largo del cuerpo. Asegúrese de mantener las puntas de las tijeras levantadas para evitar cortar los nervios ventrales y/o los músculos de la pared corporal.Coloque cuatro alfileres en las cuatro esquinas del animal. Ahora abra la sección media. Inserte los alfileres en el recipiente de disección para filetear al animal.Fije también la preparación para que se manipule con pinzas y tijeras. Retire los órganos digestivos, la tráquea y los cuerpos grasos del animal. Enjuague la preparación con solución salina.Después de enjuagar, localice los lóbulos frontales y el ganglio ventral de la preparación utilizando tijeras microquirúrgicas. Corte cuidadosamente a través del ganglio ventral justo detrás de los lóbulos frontales. Una vez completada la disección, proceda con la estimulación con luz azul y la grabación muscular.Para realizar el registro muscular, prepare un electrodo con una resistencia de 10 a 20 megaohmios. Utilizando un tirador electrónico de electrodos, llene el electrodo preparado con KCl 3 M. Coloque el electrodo lleno en el porta-electrodos.Ahora coloque la preparación larval bajo un microscopio estereoscópico en el aparato. Ajuste la luz azul de modo que la preparación diseccionada quede centrada en el haz de luz. Identifique el músculo seis o M seis en cualquier segmento de la pared corporal de la larva utilizando un micromanipulador, inserte cuidadosamente el electrodo en el M seis y observe la rápida hiperpolarización del músculo.Los potenciales de membrana en reposo deben estar entre menos 30 milivoltios y menos 70 milivoltios. Una vez que el electrodo esté correctamente insertado, aplique pulsos de voltaje de 20 a 100 milisegundos al circuito de control. Aumente progresivamente el voltaje suministrado al circuito de control.Observe los potenciales de unión excitatoria en la célula muscular. A continuación se muestra un resultado representativo que ilustra un potencial de unión excitatoria provocado por pulsos luminosos breves. La amplitud del potencial de unión excitatoria mostrada aquí corresponde a la amplitud sumada de dos neuronas motoras que se sabe que hacen sinapsis.M seis. Intensidades más bajas o duraciones más cortas de luz pueden revelar el potencial de unión excitatorio de menor amplitud proveniente de una sola neurona motora. Acabamos de mostrarle cómo realizar la estimulación mediada por ausencia de canal, mediante dos vías, de los potenciales sinápticos en la unión neuromuscular del oph.Al realizar este procedimiento, es importante recordar no dañar la pared corporal de la preparación durante la disección. También es fundamental tener en cuenta que, aunque una preparación pueda estar sobreexcitada inmediatamente después de la disección, con el tiempo se calmará y permitirá grabaciones adecuadas. Al atravesar los músculos, tenga cuidado de no penetrar por debajo de la primera capa muscular hacia la pared corporal.Cuando el electrodo queda atrapado en la pared corporal, a veces se pueden obtener potenciales hiperpolarizados pero sin estar realmente dentro de una célula muscular. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Este video muestra la técnica para registrar las corrientes sinápticas de un botón sináptico en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorizar la actividad de un único botón sináptico, lo que es importante para el estudio de líneas de moscas mutantes con una mayor actividad sináptica espontánea o asíncrona.

Registro de corrientes sinápticas en la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila

Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en...

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

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Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

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Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

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