Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares

Este procedimiento comienza con el crecimiento de la drosophila. En tercer lugar, los gusanos del estadio con el genotipo apropiado en los alimentos que contienen todo el retinol trans. Cada gusano está clavado en la cabeza y la cola.

A continuación, FLA plano. A continuación, se cortan el cerebro y los nervios posteriores para detener la actividad motora rítmica. A continuación, la fuente de luz LED azul con caja de control se ajusta y se centra en la preparación.

Finalmente, use un electrodo afilado para empalar el músculo seis. A continuación, suministre pulsos de luz con una fuente de voltaje. Hola, soy Nicholas Marstein y trabajo del laboratorio del Dr. Leslie Griffith, del Departamento de Biología de la Universidad de Brandeis.

Hola, soy Stefan Pulver, también del Griffith Lab. Hoy vamos a mostrar el procedimiento para evocar potenciales sinápticos con la raíz del canal ausente dos en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la fisiología sináptica y la drosophila.

También lo usamos para enseñar a los estudiantes fisiología sináptica y laboratorios de enseñanza. Así que comencemos. Para comenzar con este protocolo, mantenga el canal UAS rojo en dos y bien, 3 7, 1 gal cuatro líneas de mosca en botellas separadas que contengan medios de mosca estándar.

Recoja vírgenes de, está bien, 3 7, 1 gal, cuatro líneas de mosca y machos del canal UAS redsin. Dos líneas. A continuación, haga medios para moscas que se mezclen con un milimolar, todo trans retinol o un TR.To haga esto derrita medios para moscas regulares en un microondas durante aproximadamente un minuto.

Una vez derretido, deje que el medio se enfríe durante unos 30 a 60 segundos, y luego agregue 100 microlitros de 100 milimolares a TR en etanol al 100% por cada 10 mililitros de medio para moscas. Cuando los viales que contienen un medio TR estén listos, coloque los machos y hembras recolectados en cada vial. Coloque los viales en un área oscura a 22 a 25 grados centígrados para permitir que las moscas se apareen y pongan huevos, espere de cuatro a cinco días hasta que se vea la tercera larva en estrella.

En este punto, puede deshacerse de las moscas adultas. Ahora estamos listos para proceder con la configuración de la plataforma de electrofisiología. Conecte cualquier ocular de telescopio de disección a una fuente de luz LED azul con un disipador de calor.

Utilice un poste y una abrazadera para fijar una base magnética al ocular y a la fuente de luz LED. Coloque la base magnética en la mesa de aire del equipo de electrofisiología. A continuación, conecte la fuente de luz a un circuito de control y luego conecte el circuito de control a una fuente de voltaje externa.

Utilizamos la salida de voltaje del sistema de adquisición de datos de electrofisiología del laboratorio de energía realizado por ad instruments. Una vez conectado a la fuente de voltaje, dé pulsos de uno a cinco voltios al circuito de control para activar la luz azul, ajuste la base magnética y la fuente de luz hasta que el haz de luz azul se enfoque en el área que ocupará la disección larvaria. Después de hacer los ajustes adecuados, estamos listos para pasar a la disección larvaria.

Para comenzar con la disección, coloca seis alfileres de 0,1 milímetros en el suelo de un plato forrado con sogar. Retire un tercio de las larvas de estrella del medio alimentario y colóquelo en cualquier placa de Petri de plástico. Enjuague las larvas con solución salina para eliminar cualquier alimento que esté adherido a las larvas.

Luego colocó las larvas en el plato de disección cerca de los alfileres tirados y llenó el plato hasta la mitad con solución salina. Ahora orienta las larvas de manera que puedas ver dos tubos plateados que corren a lo largo de la superficie dorsal del animal. Estos tubos plateados son la tráquea.

Inserte un alfiler grande directamente en la cola entre los tubos traqueales. Sostenga las larvas y coloque un segundo alfiler grande en su cabeza. Asegúrese de estirar el cuerpo a lo largo a medida que se inserta el pasador.

Usa unas tijeras para hacer una pequeña incisión cerca de la cola. Continúe la incisión a lo largo del cuerpo. Asegúrese de que las puntas de las tijeras estén levantadas para evitar cortar los nervios ventrales o los músculos de la pared corporal.

Coloca cuatro alfileres en las cuatro esquinas de los animales. Ahora abre la sección media. Coloque los alfileres en el plato de disección para filetear el animal.

También sujete la preparación con alfileres para que se enseñe con pinzas y tijeras. Retire los órganos digestivos, la tráquea y los cuerpos grasos del animal. Enjuague la preparación con solución salina.

Después del enjuague, ubique los lóbulos frontales y el ganglio ventral de la preparación con microtijeras. Corta con cuidado el ganglio ventral justo detrás de los lóbulos frontales. Una vez completada la disección, proceda con la estimulación con luz azul y el registro muscular.

Para realizar el registro muscular, tire de un electrodo de resistencia de 10 a 20 mega ohmios. Usando un extractor de electrodos electrónico, llene el electrodo extraído con KCL de tres molares. Coloque el electrodo lleno en el portaelectrodos.

Ahora coloque la preparación de larvas bajo un microscopio de disección en la plataforma. Ajuste la luz azul para que la preparación diseccionada se centre en el haz de luz. Identifique el músculo seis o M seis en cualquier segmento de la pared corporal de la larva usando un micromanipulador, inserte cuidadosamente el electrodo en el músculo M seis y observe si el músculo se hiperpolariza rápidamente.

Los potenciales de membrana en reposo deben estar entre 30 milivoltios negativos y 70 milivoltios negativos. Una vez que el electrodo esté insertado correctamente, dé pulsos de voltaje de 20 a 100 milisegundos al circuito de control. Aumente gradualmente el voltaje suministrado al circuito de control.

Esté atento a los potenciales de unión exci en la célula muscular. Aquí hay un resultado representativo que muestra un potencial de unión exci evocado por pulsos de luz cortos. La amplitud del potencial de unión exci que se muestra aquí es la amplitud sumada de dos neuronas motoras que se sabe que comen.

M seis. Intensidades más bajas o duraciones más cortas de luz pueden exponer el potencial de unión excitatoria de menor amplitud de una sola neurona motora. Acabamos de mostrarle cómo realizar la estimulación de los potenciales sinápticos en ausencia de dos vías mediadas por dos canales en la unión neuromuscular oph.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que no se debe dañar la pared corporal de la preparación durante la disección. También es importante recordar que, aunque una preparación puede estar sobreexcitada justo después de una disección, se calmará con el tiempo y permitirá buenas grabaciones. Al empalar los músculos, tenga cuidado de no pasar por debajo de la primera capa de músculos en la pared del cuerpo.

Cuando el electrodo está clavado en la pared del cuerpo. A veces se pueden obtener potenciales hiperpolarizados, pero en realidad no se está en una célula muscular. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.