Fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica

Este procedimiento comienza con la extracción de tejido muscular esquelético de ratas Lewis neonatales. De este tejido aislamos células mioblásticas. Estos mioblastos se cultivan en placas de cultivo de tejidos durante dos días y luego se recolectan y mezclan en una mezcla de constructo tisular basada en colágeno.

Esta mezcla se pipetea cuidadosamente dentro de un molde sumergido en medio de cultivo y se incuba a 37 grados Celsius. Hola, soy Christina Pesach del laboratorio de Douglas Cowan en el Departamento de Anestesiología del Hospital Pediátrico de Boston y la Escuela Médica de Harvard. Hoy les mostraremos un procedimiento para crear tejido ingenieril miogénico.

Utilizamos este procedimiento para fabricar un tejido ingenierizado destinado a ser insertado en el corazón. Nuestro objetivo es crear una conexión eléctrica entre las cámaras superior e inferior del corazón como terapia alternativa al implante de marcapasos cardíaco en niños con bloqueo cardíaco completo. Así que comencemos.

En el montaje, se utiliza un molde de fundición para proporcionar una forma al constructo tisular a base de colágeno que se implantará quirúrgicamente. En este video, se describe el proceso de creación de constructos tisulares diseñados que contienen mioblastos esqueléticos en un video complementario. Se demuestra el implante cardíaco del tejido celularizado elaborado mediante este protocolo.

Un molde de tejido puede fabricarse en prácticamente cualquier forma o tamaño para satisfacer los requisitos fisiológicos de cualquier corazón para el cual esté diseñado el tejido. En esta demostración, el molde formará un fragmento de tejido que puede cortarse para adaptarse al surco AV de un corazón de rata adulta. Comience a construir el molde utilizando una cuchilla de afeitar para cortar el tubo de silicona en trozos de tres centímetros de longitud y luego divida longitudinalmente cada trozo por la mitad.

Corte un pequeño trozo de malla de poliéster. A continuación, coloque una gota de adhesivo de silicona RTV de grado implante en el interior del extremo del tubo. Intente mantener la cantidad de adhesivo depositada al mínimo porque es algo tóxico para las células cultivadas.

Coloque rápidamente un pequeño trozo de malla de poliéster sobre la gota de adhesivo de silicona y alinéelo con el extremo del tubo. Esto proporcionará una superficie ligeramente elevada y plana para la fijación del constructo. Repita el proceso para el otro extremo del tubo.

Deje que el molde se seque a temperatura ambiente durante tres días. Es útil preparar de 20 a 30 moldes a la vez, ya que estos son esencialmente desechables. Una vez que el adhesivo esté completamente seco, para ayudar a esterilizar los moldes, guárdelos en un recipiente lleno de etanol al 70 % hasta que sean necesarios, con los moldes preparados.

A continuación, determine si todas las soluciones requeridas también están listas para usar para prepararse para el aislamiento celular. Prepare una solución diluida de laminina de un miligramo de laminina en 250 mililitros de PBS esterilizado por filtración de 0,2 micrones que contenga antibióticos y un fungicida.

A continuación, recubra placas de cultivo celular de 150 milímetros con cuatro mililitros de la solución diluida de laminina e incúbelas a 37 grados Celsius durante al menos cuatro horas antes de su uso. También deben prepararse otras dos soluciones: el medio para mioblastos y la solución de digestión de músculo esquelético.

Consulte la sección de texto del protocolo para conocer sus formulaciones. Filtrar. Esterilice el tampón de digestión utilizando un disco de filtro de 0,2 micrones acoplado a una jeringa de 10 mililitros. Los alícuotas del tampón de digestión pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius.

Estime que necesitará cinco mililitros de tampón de digestión por camada de rata Lewis. Incube la cantidad requerida de tampón de digestión de tejido, y 10 mililitros de medio de mioblastos a 37 grados Celsius. Y continúe con la disección de las crías de rata.

Primero, obtenga al menos una camada de ratas Lewis neonatales sacrificadas utilizando pinzas y tijeras pequeñas. Retire los músculos paravertebrales de las ratas Lewis neonatales muertas cortando por la espalda a lo largo de la médula espinal, separando las capas de piel y fascia y luego extirpando los músculos. Coloque los músculos extirpados en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con 40 mililitros de H-B-S-S 1X en hielo.

Deje que las tiras musculares se asienten en el fondo del tubo y retire cuidadosamente la mayor parte del líquido y restos sanguíneos mediante succión al vacío con una pipeta Pasteur estéril en un cultivo. A continuación, vierta los fragmentos musculares recolectados sobre una placa de cultivo de 150 milímetros y aspire todo el líquido restante que sea posible. Utilizando dos hojas de bisturí de borde simple, triture el tejido hasta obtener una pasta espesa.

La pasta muscular se digerirá en una solución de digestión precalentada. Vierta parte de la solución de digestión sobre la pasta muscular y transfiera la mezcla de solución y pasta muscular a un tubo nuevo de 50 mililitros. Utilizando generalmente una pipeta de 10 mililitros para una digestión eficiente de los músculos procedentes de tres litros de ratas Lewis, empleamos entre 10 y 15 mililitros de solución.

Coloque el tubo en una plataforma oscilante y realice la digestión a 37 grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos. Durante la digestión enzimática, se agita ocasionalmente la muestra sin formar burbujas. Utilice una pipeta de 10 mililitros acoplada a una pipeta sin cable.

Una vez que el músculo esté licuado, pase la solución a través de un filtro celular de 70 micrones. Luego, centrifugue las células filtradas a temperatura ambiente durante 10 minutos a 600 G; con una pipeta de Pasteur y succión, aspire la mayor cantidad posible del líquido y re suspenda el precipitado con 10 mililitros de medio para mioblastos tibio. Incube las células en una placa de cultivo tisular no recubierta de 150 milímetros durante 15 minutos para ayudar a eliminar cualquier fibroblasto, ya que estos se adhieren más rápidamente que los mioblastos.

Coloque la placa en un incubador humedecido ajustado a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Retire la placa del incubador y transfiera las células que aún no se han adherido al cultivo recubierto con Lamin. Incúbrelas y dilúyalas en medio de mioblastos de manera que haya una placa por cada una o dos crías de rata.

Si las células se siembran demasiado densas, se diferenciarán en tubos miotubulares. Por último, permita que las células crezcan en un ambiente humedecido a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Después de uno a dos días de incubación, las células estarán listas para ser moldeadas en constructos de tejido.

Después de uno o dos días de incubación, retire cuatro de las placas de cultivo celular de mioblastos de 150 milímetros del incubador. No espere más de 48 horas, ya que los fibroblastos dominarán la población de mioblastos. Aspire el medio de las células.

Luego, lave las células dos veces con un XPBS calentado a 37 grados Celsius para desprender los mioblastos de la placa y agregue cuatro mililitros de solución tibia de tripsina-EDTA al 0,05 % a cada placa; regrese las placas al incubador durante cinco minutos. Recoga los mioblastos en la cabina de cultivo y reúna el líquido en un tubo de 50 mililitros. Utilice 10 mililitros de medio para mioblastos para enjuagar todas las placas y combínelos con las células en el tubo del centrífugo.

Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos a 600 G y aspirar la mayor cantidad posible del líquido excedente. Ahora, resuspender los mioblastos en 1,4 mililitros de medio para mioblastos y colocarlos en hielo. Utilizando pinzas con cuidado, retirar un molde de constructo del baño de etanol y enjuagarlo dos veces sumergiéndolo en un XPBS; aspirar todas las trazas de PBS con una pipeta de Pasteur antes de colocar el molde en un pocillo vacío de una placa de cultivo celular de seis pocillos.

En este momento, se debe formular una solución. Recolecte los siguientes reactivos sobre hielo. 10 x hams F 10 zonas de hongos penicilina estreptomicina.

Células de colágeno tipo uno resuspendidas en medio de mioblastos, bicarbonato de sodio y gel. Combine los reactivos según el protocolo escrito. Vortexee la mezcla durante 20 segundos; adquirirá un color rosa.

Téngase en cuenta que las variedades de colágeno tipo uno disponibles comercialmente tienen un efecto variable sobre la mezcla, la solidificación y la consistencia. En el producto final. Devuelva el tubo al recipiente con hielo durante unos minutos para eliminar las burbujas de la solución.

Es que el colágeno tipo I no se irradia o no se gelatinizará. Aquí utilizamos un producto derivado de la piel de ovide. Antes de que la mezcla se solidifique, vierta cuidadosamente la mezcla en el molde de la placa de cultivo.

Cada molde contendrá aproximadamente un mililitro del líquido viscoso. Trate de evitar introducir burbujas de aire durante este procedimiento. Transfiera cuidadosamente la placa que contiene los moldes del constructo al incubador a 37 grados Celsius.

A medida que la mezcla se solidifica, cambiará de color de un rosa oscuro a un rosa claro, mientras que el molde solidifica, caliente un poco de medio para mioblastos a 37 grados Celsius. Después de aproximadamente media hora de incubación, sumerja cuidadosamente cada constructo tisular en medio para mioblastos previamente calentado y regrese la placa al incubador. Cuando este protocolo se ejecuta correctamente, el constructo tisular que contiene mioblastos está listo para la implantación in vivo o para análisis adicionales.

Después de dos días de incubación, acaban de mostrarle cómo fabricar un constructo de tejido ingenierizado miogénico. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener todos los reactivos necesarios para la solución del constructo sobre hielo para evitar la solidificación prematura. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.