Name: Fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Aprende a fabricar construcciones de ingeniería tisular miogénica con colágeno y mioblastos esqueléticos para reparación cardíaca. Este método permite crear conductos eléctricos atrioventriculares como alternativa a marcapasos.

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Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL068915; HL088206), un Premio al Investigador Nuevo en el Fondo de Investigación Thrasher, y las contribuciones al Fondo de conducción cardiaca en el Hospital de Niños de Boston.

Parte 1: Montar la construcción de moldes de fundición <ol><li> Use una hoja de afeitar para reducir a la mitad el tubo de silicona (VWR) y cortarlo en tres pedazos cm de largo. </li><li> Coloque una gota de RTV adhesivo implantes de silicona de calidad (Rhodia) en el interior de cada extremo de la tubería. </li><li> Rápidamente coloque un pedazo pequeño (1 cm x 1 cm) de malla de poliéster (McMaster-Carr) sobre la caída de adhesivo de silicona y alinearla con el extremo de la tubería. Esto proporcionará una superficie ligeramente elevada y plana para la conexión construir. Repita para el otro extremo. </li><li> Deje que el molde para secar a temperatura ambiente durante 3 días. Es útil para hacer moldes de 20 a 30 a la vez, ya que son esencialmente desechables. </li><li> Una vez que el adhesivo esté completamente seco, almacenar estos moldes en un vaso lleno de etanol al 70% hasta que se necesiten. Este paso ayudará a esterilizar los moldes y el producto terminado se muestra en la Figura 1. </li></ol> Parte 2: Preparación para el aislamiento de células con mioblastos <ol><li> Diluir 1 mg laminina (Sigma) en 250 ml de 0,22 micras, esterilizada por filtración de buffer fosfato salino (PBS) que contiene 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) y el 1% Fungizone (Invitrogen). </li><li> Escudo 150 mm placas de cultivo tisular (BD Falcon) con 4 ml de la solución diluida de laminina paso 1.1 e incubar a 37 º C durante al menos 4 horas antes de la galjanoplastia mioblastos esqueléticos primaria. </li><li> Hacer que el medio de mioblastos mediante la mezcla de F-10 de Ham mezcla de nutrientes (Sigma) con 20% de SFB (Atlanta Biologicals), 5 ng / L Factor de crecimiento de fibroblastos (Promega), 1% penicilina / estreptomicina (Invitrogen), y el 1% Fungizone ( Invitrogen). </li><li> Prepare la solución de los músculos esqueléticos digestión mediante la disolución de 1 g de ~ 295 U / mg de colagenasa 2 (Worthington) en 100 ml de 2,4 U / mL Dispasa-2 (Roche). Añadir 0,037 g de CaCl 2 y mezclar bien. Filtro de esterilizar el tampón de digestión con un disco de 0.2 micras de filtro instalado en una jeringa de 10 ml y almacenar alícuotas a -20 ° C. Coloque la cantidad necesaria para la digestión de los tejidos a 37 ° C, junto con los medios de comunicación de mioblastos. </li></ol> Parte 3: Aislamiento de mioblastos de músculo esquelético <ol><li> El uso de pinzas y tijeras pequeñas, eliminar músculos paravertebrales de la muerte neonatal ratas Lewis por corte en la parte posterior de la médula espinal, quitando la piel y las capas de la fascia y los músculos de la escisión. </li><li> En una campana de cultivo de tejidos, el lugar de los músculos extirpado en un tubo cónico de 50 ml (BD Falcon) llena con 40 ml de solución salina Hanks 1X (Balanced HBSS) (Invitrogen) en el hielo. Dejar que las tiras musculares que se depositan en el fondo del tubo y retire con cuidado la mayor parte de los restos de líquido y sangre por succión al vacío con una pipeta Pasteur estéril en una campana de la cultura (Baker). </li><li> Vierta las piezas del músculo recogieron sobre una placa de cultivo de 150 mm y eliminar la mayor cantidad de líquido que queda como sea posible con la succión. Usando dos de un solo filo hojas de afeitar pelos en el tejido hasta formar una pasta espesa. Vierta precalentado solución de digestión de la pasta y la transferencia de la mezcla a un tubo de 50 ml fresca con una pipeta de 10 ml. Durante la digestión enzimática, el tejido es de vez en cuando triturado (sin burbujas) con una pipeta de 10 mL equipado en un teléfono inalámbrico con una pipeta-Aid (Drummond). Una vez más, permitir que el tejido para resolver y eliminar el exceso de líquido. </li><li> Coloque el tubo en una plataforma oscilante y digerir a 37 º C durante unos 30 minutos. </li><li> Una vez que el músculo está licuado, pasar a través de un colador celular 70 micras (BD Falcon) y se centrifuga a temperatura ambiente durante 10 minutos a 600 xg (Beckman GP). Con una pipeta de Pasteur y de succión, retire la mayor cantidad de líquido posible y resuspender el precipitado con 10 ml de medio de mioblastos caliente. </li><li> Pre-placa de las células en una placa de 150 mm sin recubrimiento de cultivo de tejidos durante 15 minutos para ayudar a eliminar los fibroblastos. </li><li> Transferencia de las células que aún no han conectado a la cultureware laminina recubierto y se diluye de modo que no es un plato para cada 1 a 2 crías de rata. Colocar la placa en una incubadora humidificada conjunto a 37 º C con CO2 al 5%. </li></ol> Parte 4: Usar las construcciones de ingeniería tisular (5 ml) <ol><li> Después de 1 a 2 días, retire 10 de los 150 mm placas de cultivo de tejidos de mioblastos de la incubadora, lavar dos veces con 37 ° C PBS 1X, y añadir 4 ml de agua tibia 0,05% de tripsina-EDTA a cada plato. Retorno de las placas a la incubadora durante 5 min. </li><li> Cosecha de los mioblastos separado de las placas en la cubierta la cultura y recoger el líquido en un tubo de 50 ml (BD Falcon). Utilizar 10 ml de medio de mioblastos para lavar todos los platos y combinar esto con las células en el tubo de centrífuga. Que sedimenten las células a temperatura ambiente durante 10 minutos a 600 xg (Beckman GP) y eliminar el exceso de líquido como se describe en el paso 3.5. </li><li> Resuspender las células con mioblastos en 1,6 ml de medio de mioblastos y el lugar en el hielo. </li><li> Con unas pinzas, retire con cuidado la construcción de 4 moldes de paso 1,5 y enjuague dos veces con PBS 1X. Vacío de aspiración de todos los rastros de PBS con una pipeta Pasteur antes de colocar cada molde en un cu tejidos de 6 pocilloslture placa (BD Falcon). </li><li> Reúna a los otros reactivos necesarios para la preparación de la construcción (F10 Jamón de 10X, los antibióticos, el colágeno tipo 1 [3,9 mg / ml] [6] y Matrigel ™) en el hielo y mantener los medios de comunicación de mioblastos a 37 º C. Combine 500 l 10 veces más de Ham F10, 100 l de penicilina / estreptomicina, 100 Fungizone l, 1,6 mL de colágeno, y 750 ™ l Matrigel en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar la solución durante 10 segundos utilizando una Mini-vórtice (VWR) establece en 10 y el lugar en el hielo. </li><li> A continuación, añadir 80 l de NaHCO3 y la suspensión de mioblastos a partir del paso de 3,3 a la mezcla del paso 3.5. Vortex toda la mezcla durante 10 segundos y volver el tubo al cubo de hielo durante unos minutos para limpiar la solución de burbujas. </li><li> Con cuidado, tire la mezcla en los moldes antes de que comience a solidificarse con una pipeta de 10 ml. Cada molde tiene capacidad para aproximadamente 1 ml de líquido viscoso. Trate de evitar la introducción de burbujas de aire durante este procedimiento. </li><li> Transferir cuidadosamente la placa que contiene las construcciones de fundición a la incubadora. Después de aproximadamente 30 minutos, retire las construcciones solidificado de la incubadora y añadir con cuidado a cada medio de mioblastos y para cubrir el tejido construir. Devolver la placa a la incubadora (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Los resultados representativos Cuando este protocolo se ejecuta correctamente, la construcción del tejido de mioblastos que contienen está listo para la implantación in vivo (es decir, cuando se saca del molde) o más en los análisis in vitro después de 2 días. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> Figura 1. Ejemplos de completar la construcción de moldes (ver Paso 1.5). <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> Figura 2. A solidificado mioblastos tejido que contiene la construcción [1]. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> Figura 3. Perfiles en H &amp; E manchadas de un tejido que contiene la construcción de mioblastos. &quot;A&quot; representa un corte longitudinal y &quot;B&quot; muestra una sección transversal.

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Hospital de Niños de Boston.

Los moldes en los que será la construcción de tejido reparto se puede hacer en cualquier forma y tamaño, sin embargo, es necesario que haya al menos dos puntos de fijación. De lo contrario, la matriz y las células forman una estructura esférica y las células mueren. En el presente Protocolo, se describe el uso de una malla de poliéster para este propósito, sin embargo, también hemos utilizado con éxito una malla de acero inoxidable. Obviamente, los moldes más grandes requieren más células, y un mayor volumen de los demá...

<table><tbody><tr><td>Tubo de silicona</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo de silicona</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Malla de poliéster</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla nutriente F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa-2</td><td>Roche Group</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos básico</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 150 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA al 0,05 % (1X)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks 1X</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; al 7,5 %</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular de 70 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Vial cónico de 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Vial cónico de 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,2 &amp;mu;m</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

A pesar de que los marcapasos electrónicos para salvar vidas los dispositivos médicos, su rendimiento a largo plazo en pacientes pediátricos puede ser problemática debido a las restricciones impuestas por el tamaño pequeño de un niño y su crecimiento inevitable. En consecuencia, hay una verdadera necesidad de terapias innovadoras diseñadas específicamente para los pacientes pediátricos con trastornos del ritmo cardíaco. Proponemos que una alternativa conductor biológica que consiste en una matriz a base de colágeno que contiene autologously células derivadas de una mejor podrían adaptarse al crecimiento, reducir la necesidad de cirugías recurrente, y en gran medida a mejorar la calidad de vida de estos pacientes. En el presente estudio, se describe un procedimiento para la incorporación de cultivos primarios de células con mioblastos esqueléticos dentro de una matriz de hidrogel para diseñar una construcción de tejido quirúrgicamente implantable que servirá como un conducto eléctrico entre las cámaras superior e inferior del corazón. En última instancia, esperamos con este tipo de ingeniería tisular para restablecer la conducción eléctrica auriculoventricular en los niños con bloqueo cardíaco completo. En vista de ello, aislamos los mioblastos de músculo esquelético de ratas Lewis neonatal y la placa que en laminina recubierto platos de cultivo de tejidos utilizando una versión modificada de los protocolos establecidos<sup&gt; [2, 3]</sup&gt;. Después de uno o dos días, las células cultivadas se recogen y se mezclan con los antibióticos, el colágeno tipo 1, Matrigel ™, y NaHCO<sub&gt; 3</sub&gt;. El resultado es una solución viscosa, uniforme que se puede convertir en un molde de casi cualquier forma y tamaño<sup&gt; [1, 4, 5]</sup&gt;. Para construcciones de nuestro tejido, empleamos el colágeno tipo 1 aisladas de piel de cordero fetal mediante el procedimiento habitual<sup&gt; [6]</sup&gt;. Una vez que el tejido ha consolidado a 37 ° C, los medios de cultivo se agrega cuidadosamente a la plancha hasta que la construcción se encuentra sumergido. La ingeniería tisular se deja condensar aún más a través de la deshidratación durante 2 días más, momento en el que está listo para<em&gt; In vitro</em&gt; Evaluación o implantación quirúrgica.

Este sentido, demuestran la fabricación de estructuras a base de colágeno del tejido, con mioblastos esqueléticos. Estas construcciones de ingeniería 3-D se puede utilizar para sustituir o reparar los tejidos<em&gt; In vivo</em&gt;. Para nuestros propósitos, hemos diseñado estos como un canal atrioventricular eléctricos para la reparación de un bloqueo cardíaco completo<sup&gt; [1]</sup&gt;.

Fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica

A pesar de que los marcapasos electrónicos son dispositivos médicos que salvan vidas, su rendimiento a largo plazo en pacientes pediátricos puede ser problemático debido a...

Este procedimiento comienza con la extracción de tejido muscular esquelético de ratas Lewis neonatales. De este tejido aislamos células mioblásticas. Estos mioblastos se cultivan en placas de cultivo de tejidos durante dos días y luego se recolectan y mezclan en una mezcla de constructo tisular basada en colágeno.Esta mezcla se pipetea cuidadosamente dentro de un molde sumergido en medio de cultivo y se incuba a 37 grados Celsius. Hola, soy Christina Pesach del laboratorio de Douglas Cowan en el Departamento de Anestesiología del Hospital Pediátrico de Boston y la Escuela Médica de Harvard. Hoy les mostraremos un procedimiento para crear tejido ingenieril miogénico.Utilizamos este procedimiento para fabricar un tejido ingenierizado destinado a ser insertado en el corazón. Nuestro objetivo es crear una conexión eléctrica entre las cámaras superior e inferior del corazón como terapia alternativa al implante de marcapasos cardíaco en niños con bloqueo cardíaco completo. Así que comencemos.En el montaje, se utiliza un molde de fundición para proporcionar una forma al constructo tisular a base de colágeno que se implantará quirúrgicamente. En este video, se describe el proceso de creaci

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Investigación

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Biología

Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas...

Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

Tejido muscular Engineered tiene un gran potencial en medicina regenerativa, como modelo de la enfermedad y también como una fuente alternativa para la carne. Aquí se describe la ingeniería de una construcción de músculo, en este caso a partir de células progenitoras de mioblastos de ratón y la estimulación por impulsos eléctricos.

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Este sistema modelo se inicia a partir de un gel de fibrina-miofibroblastos poblado que se puede utilizar para estudiar colágeno endógeno (re) organización en tiempo real de una manera no destructiva. El modelo de sistema es muy sintonizable, ya que se puede utilizar con diferentes fuentes de células, aditivos de medio, y se puede adaptar fácilmente a las necesidades específicas.

Ingeniería fibrina basado en construcciones de tejido de miofibroblastos y de aplicación de las restricciones y la tensión para inducir la organización de células y colágeno (Re)

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

En este trabajo, presentamos una técnica para la fabricación rápida de tejidos vasculares vivos mediante el cultivo directo de colágeno, células musculares lisas y células endoteliales. Además, se describe un nuevo protocolo para la caracterización mecánica de tejidos vasculares artificiales.

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Hasta la fecha, los defectos de tejido grueso se reconstruyen típicamente mediante la aplicación de colgajos de tejido autólogo o tejidos de ingeniería. En este protocolo, presentamos un nuevo método para diseñar un colgajo de tejido vascularizado con un pedículo autólogo, para que sirva como sustituto de los colgajos autólogos.

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

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Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.

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Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

Este protocolo proporciona métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D y describe su uso en modalidades preclínicas de detección de fármacos. Los métodos descritos utilizan un sistema de detección magnética para facilitar la evaluación simultánea de 24 tejidos en paralelo.

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