Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Hola, soy Yon Ziv del laboratorio del Dr. Cohen en el Departamento de Anestesiología del Hospital de Niños y la Escuela de Medicina de Howard. Hoy vamos a mostrar un procedimiento de mapeo óptico en corazones rojos perfundidos por Lal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la propagación de la actividad eléctrica en la superficie cardíaca.

Así que comencemos. En la mañana del experimento, mezcle cuatro litros de solución ligera de Krebs Hensel. Después de mezclar la solución, elimine las partículas no disueltas con un filtro de 200 micras mediante filtración al vacío.

Primero, use un litro de la solución preparada de Krebs Henzel lite para disolver 11 milimoles de BDM. En segundo lugar, tome otros 100 mililitros de Krebs Henzel lite y mezcle 10 milimolares D ocho NFS en DMSO hasta una concentración final de cinco micromolares D ocho anexo en solución. La camisa de agua, los depósitos de vidrio, el burbujeador y la cristalería utilizada aquí son todos de color rojo. Travieso.

Transfiera las dos soluciones a los embalses de antes de la guerra a 41 grados centígrados. Oxigenar las soluciones con gas filtrado de 0,2 micras utilizando un burbujeador sumergido, bombear las soluciones de los tres depósitos de stock a través del sistema Ling Endorf montado en la pared con bombas peristálticas y tubos de silicona de baja absorción para recolectar el corazón de rata. En primer lugar, inyectar por vía intraperitoneal a una rata Lewis de 200 a 250 gramos con ketamina y xilacina para inducir anestesia general profunda y con heparina para prevenir la coagulación de la sangre y la isquemia miocárdica durante la explicación.

Una vez que la rata esté completamente anestesiada y no responda a un pellizco en el dedo del pie, proceda a extraer el corazón. Comience la cirugía extirpando primero la pared torácica anterior para acceder fácilmente al corazón y a los grandes vasos. A continuación, diseccione cuidadosamente el tejido circundante y abra el saco pericárdico.

Una vez identificada la vena cava inferior, ligar este vaso con cinco suturas de Prolina O y explicar todo el bloqueo corazón-pulmón. Coloque inmediatamente el tejido en una solución ligera helada de Krebs Henzel en un vaso de precipitados de 50 mililitros sobre hielo, identifique rápidamente la aorta ascendente y diseccione del tejido circundante. Inserte una cánula de tamaño adecuado en la aorta.

Teniendo cuidado de evitar introducir la cánula demasiado adentro de la raíz aórtica e interrumpir la perfusión obligatoria de las arterias coronarias. Asegure la cánula a la aorta ascendente. A continuación, coloque el corazón de rata en el aparato Ling Endorf sin introducir burbujas de aire en la cánula.

La perfusión vascular coronaria retrógrada ahora se establece con la solución tibia y oxigenada de Krebs Hensel lite. De la cabeza de presión del aparato de Ling Endorf, ahora retire el tejido adicional, incluidos los pulmones, después de la limpieza, perfunda el corazón durante 20 minutos para permitir la recuperación de la función y estabilizar el ritmo a medida que el corazón se perfuntra. Introduzca una sonda de temperatura de termopar muy delgada en la cavidad ventricular izquierda.

Sutura la sonda en su lugar con cinco suturas de prolene y ajusta la configuración de las bombas circulatorias de agua para mantener la temperatura del corazón. A 37 grados centígrados, minimice el movimiento de la Perfusión ocho que gotea desde el ápice cardíaco. Al colocar un pedazo de gasa en el receptáculo de efluentes, el corazón ahora está listo para ser cargado con tinte métrico potente para adquirir señales electrográficas y ópticas para cargar el tinte métrico potencial ocho NEP en el corazón.

Cambie a la línea de profusión que contiene Krebs, por lo tanto, luz mezclada con tinte fluorescente. Debido a que las aurículas no están suficientemente perfundidas con el tinte introducido a través de las arterias coronarias, se coloca una cánula de calibre 18 en la aurícula izquierda o derecha. Y se administran lentamente 50 mililitros adicionales de solución de tinte en cada una de estas cámaras.

Durante el procedimiento de carga, coloque suavemente tres derivaciones de ECG en la superficie del corazón. Eso no es frente a la óptica utilizada para el mapeo. El primer electrodo se coloca en la porción apical posterior del ventrículo izquierdo.

El segundo se coloca en la aurícula izquierda y el tercero actúa como electrodo de referencia en la raíz aórtica. Las señales electrográficas auriculares y ventriculares se amplifican, digitalizan y muestran posteriormente mediante el software. También se utiliza un osciloscopio para visualizar los ECG de superficie en tiempo real y para asegurar una estimulación adecuada.

Ajuste el amplificador de ECG a 0,1 hercios para el filtro de paso alto y 150 hercios para el filtro de paso bajo, coloque la cámara CMO utilizando los ajustes X, Y, Z. Una pieza de vidrio que se coloca en el plano focal de la cámara se coloca en la superficie del corazón para que el área de interés esté enfocada y centrada en el marco de adquisición. La cámara y la óptica están montadas en una mesa de aislamiento de vibraciones para minimizar las frecuencias de resonancia.

Al mismo tiempo. En la aurícula derecha se coloca un electrodo de estimulación coaxial controlado con una unidad de estimulación eléctrica aislada S 48. Esto marcará el ritmo del corazón a 300 latidos por minuto, configure la estimulación eléctrica de la siguiente manera.

La velocidad debe ser de cinco pulsos por segundo, un retraso de 0,2 milisegundos, una duración de estimulación de dos milisegundos con una potencia de seis a 12 voltios y un modo configurado para repetir y pulso único. Para las grabaciones ópticas que carecen de artefactos de movimiento por contracción, el corazón necesita estar desacoplado electromecánicamente. Para ello, cambie de nuevo las líneas de perfusión a una solución de Krebs Hensel que contenga 11 milimolares de BDM.

Entre adquisiciones. Perfunda el corazón con luz Krebs HENSEL sin adulterar para ayudar a preservar la viabilidad de la preparación. Configure los parámetros de grabación del software a 2000 hercios con una matriz de 1 28 por 1 28 píxeles.

El intervalo de fotogramas debe establecerse en 0,5 milisegundos y las ganancias deben establecerse en cinco veces para el amplificador de la cámara y ocho veces para la ganancia en el chip. La ganancia en el chip también debe establecerse en 12. Configure el control de la cámara del software para un retardo del obturador de 500 milisegundos y grabe 4.000 fotogramas con una duración de 2000 milisegundos.

Apague o proteja todas las luces de la habitación y del equipo para eliminar el ruido de fondo durante la grabación, la luz LED ilumina el corazón solo durante la grabación óptica. Para reducir el fotoblanqueo y la toxicidad del tinte, controle el obturador de la fuente de luz con un pulso de cinco voltios enviado a través del panel de control a través de una placa D dos A en la computadora después de la adquisición. Procese los datos utilizando diferentes configuraciones de filtro.

La configuración predeterminada se usa generalmente, excepto cuando se ajusta el filtro de paso de parada de banda, que se establece con el límite izquierdo en 44.0 y el límite derecho en 98.0. Posteriormente, la información grabada se procesa y se utiliza para generar una película. Los datos de una adquisición corresponden a la activación eléctrica local en 16.384 sitios de la superficie del corazón durante un período de dos segundos.

El software permite que estas señales locales se comparen directamente entre sí y con los datos de los registros electrográficos auriculares y ventriculares mediante el mapeo de la activación eléctrica local para colorear y representar esta información como una animación que muestra la activación eléctrica espacio-temporal en la superficie cardíaca. Para crear una animación de este tipo, primero utilice el software para filtrar los datos temporal y/o espacialmente. A continuación, seleccione una hora de inicio y finalización para la animación.

En tercer lugar, asigne las señales ópticas al color en función de la intensidad de la luz en reposo de cada píxel. En cuarto lugar, superponga los datos de color resultantes con una imagen del corazón y, finalmente, genere la animación si la preparación del corazón perfundido estaba inmóvil Durante la grabación, las señales ópticas muestran un pico distinto para cada píxel involucrado en un cambio de la intensidad de emisión de D ocho anep. Estas películas de imágenes en tiempo real muestran un frente de onda de excitación que se propaga a través de la superficie epicárdica del corazón, así como las grabaciones electrográficas adquiridas simultáneamente.

Acabamos de demostrar una técnica de alta resolución para obtener imágenes ópticas del movimiento potencial de acción en la superficie de Alanor Perfuse Red Heart. Al realizar este procedimiento, es importante extraer rápidamente el corazón del rojo anestesiado. Para evitar la isquemia miocárdica, las células miocárdicas deben perfundirse adecuadamente y el corazón debe estar completamente cargado con un tinte sensible al agua.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.