Name: Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos para estudiar la propagación de potenciales de acción en superficie cardíaca. Esta técnica de alta resolución permite analizar la actividad eléctrica cardiaca en tiempo real.

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Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL068915; HL088206) y las contribuciones al Fondo de conducción cardiaca en el Hospital de Niños de Boston.

Parte 1: Preparar las soluciones y el sistema de corazón aislado perfundido <ol><li> En la mañana del experimento, 4,0 L de Krebs-Henseleit solución se prepara como se describió previamente [5, 6]. </li><li> 11 mmol / l 2,3-butanodiona monoxima (BDM) se disuelve en 1.0 L de Krebs-Henseleit solución decantada de la perfusión preparada en la etapa 1.1. </li><li> Un adicional de 150 ml de Krebs-Henseleit se retira de la perfusión preparada en el paso 1.1 y se mezcla con 5 mol / l di-8-ANEPPS (diluido en un 10 mmol / L de valores disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO)). </li><li> Estas tres soluciones se transfiere al agua con camisa de vidrio embalses (Radnoti), donde se pre-calentado a 41,0 ° C y oxigenada con un pelele sumergida (Radnoti) con 0,2 m con filtro de 95% O 2, 5% de CO 2 gas. Las soluciones de los tres depósitos de valores se bombea al sistema de pared con Langendorff Masterflex ™ L / S y las bombas peristálticas de baja absorción de tubo de silicona (Cole-Parmer). </li><li> Antes del montaje, el sistema de Langendorff cristalería (Radnoti) está cuidadosamente lavadas con E-TOXA-CLEAN reactivo (Sigma-Aldrich) y enjuagar con 0,1 M / L HCl, 100% de etanol y agua destilada. </li><li> El aparato no recirculación Langendorff fue construido para ofrecer 70 mm Hg de presión constante de 3 depósitos separados oxigenada, que están separados desde el corazón de serpentines de calefacción camisa de agua y trampas de burbujas (Radnoti) [7]. Las 3 líneas independientes de perfusión convergen por encima del corazón en dos llaves de paso de 3 vías, lo que nos permite controlar con precisión la entrega de las soluciones preparadas en pasos de 1,1 a 1,3. Con camisa de agua de vidrio se conecta en serie con un tubo Masterflex BPT PharMed (Cole-Parmer) y se calienta a 39 ° C con agua destilada con dos circuladores E100 (Lauda). La pérdida de calor a través del tubo de silicona curada con platino (Cole-Parmer) que conecta los yacimientos carga de presión a los serpentines de calefacción y trampas de burbujas como resultado un 37 º C perfundido llegar al corazón. </li></ol> Parte 2: Cosecha del corazón de rata y puesta en marcha de perfusión Langendorff <ol><li> Para inducir la anestesia general profunda en ratas 200-250 g Lewis, 100 mg / kg de ketamina y xilacina 10 mg / kg se inyecta en la cavidad intraperitoneal. A esta mezcla, se añaden 500 U / kg de heparina para prevenir la coagulación de la sangre y la isquemia miocárdica durante el procedimiento de explantación. </li><li> Para facilitar el acceso al corazón y grandes vasos, la pared anterior del tórax se ha eliminado. Después de eso, el tejido circundante se diseca cuidadosamente y abrió el saco pericárdico. </li><li> Tras la identificación de la vena cava inferior, este vaso se liga con seda 5-0 (Ethicon) y todo el bloque corazón-pulmón explantado es. El tejido se coloca inmediatamente en helado de Krebs-Henseleit solución contenida en un vaso de 50 ml en hielo. </li><li> La aorta ascendente es rápidamente identificado y disecado de los tejidos circundantes. Una cánula de tamaño adecuado (Harvard Apparatus) se inserta en la aorta, teniendo cuidado de evitar la interrupción de la perfusión obligatoria de las arterias coronarias mediante la inserción de la cánula demasiado lejos en la raíz aórtica. La cánula se asegura a la aorta ascendente con 5-0 seda (Ethicon). </li><li> El corazón de rata se coloca en el aparato Langendorff sin introducir burbujas de aire dentro de la cánula. Retrógrada perfusión vascular coronaria se ha establecido con la cálida y oxigenada de Krebs-Henseleit solución de la presión de cabeza se describe en el paso 1.6. </li><li> Tejido extra, incluyendo los pulmones, ahora se retira y el corazón se perfundidos durante 20 minutos para permitir la recuperación de la función y estabilizar el ritmo. Durante este tiempo, una sonda de temperatura termopar muy delgado (Cole-Parmer) se introduce en la cavidad del ventrículo izquierdo y se sutura en su lugar con 5-0 Prolene sutura (Ethicon). La sonda está conectada a un termo-regulador (Digi-Sense) para asegurar la temperatura del corazón se mantiene a 37 ° C mediante el ajuste de la configuración de las bombas de agua circulatorio. Movimiento de perfusión que gotea de la punta cardiaca se reduce al mínimo mediante la colocación de una gasa en el receptáculo de efluentes. </li></ol> Parte 3: el corazón de carga con el tinte potenciométrica y adquirir señales electroencefalográficas y ópticas <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) se carga en el corazón por el cambio a la línea de perfusión que contiene la mezcla de Krebs-Henseleit con el colorante fluorescente utilizando una llave de paso. Además, una cánula de 18G se coloca en la aurícula izquierda y / oa la derecha y otros 50 ml de solución de colorante es administrado lentamente en cada una de estas cámaras, ya que no están lo suficientemente preservados con medio de contraste introducido a través de las arterias coronarias. </li><li> Durante el procedimiento de carga, 3 derivaciones del ECG (Harvard Apparatus) se coloca suavemente sobre la superficie del corazón, que no se enfrenta a la óptica utilizada para el mapeo. Electrodo n º 1 se coloca en la parte posterior apical del ventrículo izquierdo, N ° 2 en la aurícula izquierda, y N <su> p&gt; o 3 como un electrodo de referencia de la raíz aórtica (Figura 1). Las señales electroencefalográficas auriculares y ventriculares posteriormente se amplifica, digitaliza, y se muestra junto con las señales ópticas utilizando el software (camisa roja de imagen) (Figura 2). Un osciloscopio (Tektronix TDS modelo 1002) también se utiliza para visualizar el ECG de superficie s en tiempo real y asegurar el ritmo adecuado. </su></li><li> Amplificador de ECG (Hugo Sachs Elektronik) opciones: filtro de paso alto: 0,1 Hz Filtro de paso bajo: 150 Hz </li><li> La cámara CMOS (camisa roja de imagen) y macroscópico se coloca con los ajustes XYZ para que la superficie del corazón está enfocada y centrada en el marco de la adquisición. La cámara y la óptica están montadas sobre una mesa de aislamiento de vibración (menos K Technology) para reducir al mínimo las frecuencias de resonancia. Al mismo tiempo, un electrodo de estimulación coaxial (Harvard Apparatus), controlada con un hecho aislado, S48-estimulación eléctrica de la unidad (hierba), se coloca en la aurícula derecha y el corazón es un ritmo de 300 pulsaciones por minuto (Figura 1). </li><li> La estimulación eléctrica (hierba) la configuración: Precio: 5 pulsos por segundo Demora: 0,2 ms Duración: 2 ms V: 6-12 V Modo: Repita Pulso: Single </li><li> Para las grabaciones ópticas que carecen de los artefactos de movimiento de contracción, el corazón tiene que ser electromecánico acoplado. Esto lo hacemos de nuevo el cambio de líneas de perfusión Krebs-Henseleit solución que contiene 11 mmol / L BDM. Entre las adquisiciones, el corazón es puro perfundidos con Krebs-Henseleit para ayudar a preservar la viabilidad de la preparación. </li><li> Los parámetros de grabación se establecen con el software (Imagen camisa roja) con la configuración de la adquisición de lo siguiente: Configuración: 2.000 Hz; 128x128 píxeles que Intervalo de fotogramas: 0,5 ms Cámara de ganancia del amplificador: 5 veces On-Chip de ganancia: 8x-12m-, así Obturador: 500 ms retraso Número de fotogramas: 4000 Duración: 2000 ms </li><li> Todas las luces de la sala y los equipos están apagados o protegidos para eliminar el ruido de fondo durante la grabación. La luz ilumina el corazón sólo durante la grabación óptica para reducir el foto-blanqueo y tinte de toxicidad. El obturador fuente de luz es controlado con un pulso de 5 V entrega a través del panel de control a través de una D a un tablero en el ordenador (Imagen camisa roja). </li></ol> Parte 4: Analizar la información utilizando el software de adquisición de imágenes de camisa roja <ol><li> Tras la adquisición, los datos se procesan utilizando diferentes configuraciones de filtros. Por lo general, utilizar la configuración predeterminada, excepto cuando se ajusta la banda de parada / filtro de paso, que se encuentra con el límite a la izquierda en 44.0 y el límite a la derecha en 98.0. Después de la información registrada es procesada y una película se genera (Imagen camisa roja). </li><li> Los datos de una adquisición se corresponde con la activación eléctrica local en 16.384 sitios en la superficie del corazón durante un período de 2 segundos. El software permite que estas señales locales para ser comparados directamente entre sí y con las grabaciones electroencefalográficas auriculares y ventriculares. Datos se visualizan mediante la asignación de la activación eléctrica local a color y la representación de esta información como una animación que muestra la activación espacio-temporal eléctrica en la superficie cardíaca. Para crear este tipo de animación, que utilizará el software para: <ul><li> temporal y / o filtrar los datos espacialmente </li><li> seleccionar una hora de inicio y fin de la animación </li><li> mapa de señales ópticas a color en función de la intensidad de la luz en reposo de cada píxel </li><li> superposición de los datos de color con una imagen del corazón </li><li> generar la animación </li></ul></li></ol> Parte 5: Los resultados representativos Si la preparación del corazón perfused estaba inmóvil durante la grabación, las señales ópticas muestran un pico distinto para cada pixel implicados en un cambio de la intensidad de las emisiones de di-8-ANEPPS. Las películas correspondientes (Figuras 3 y 4) muestran un frente de onda de excitación se propagan a través de la superficie epicárdica del corazón, así como las grabaciones de adquisición simultánea electroencefalográficas (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Diagrama de configuración cardíaca de Langendorff para el estudio de estimulación cardíaca, destacando los componentes numerados." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Una fotografía de una preparación de corazón Langendorff perfundidos que representan las posiciones de los electrodos de estimulación en la aurícula derecha y el ECG conduce como se describe en el paso 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Diagrama de proceso biológico con señales; análisis de datos de resultados de microscopía de fluorescencia." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante de las señales ópticas y grabaciones electroencefalográficas de un corazón de rata perfundido Lewis. El panel A muestra una imagen de la superficie del epicardio utilizados para obtener imágenes ópticas. La posición de los píxeles seleccionados para demostrar los cambios en la emisión de fluorescencia con el tiempo en el Panel B se indican con flechas de colores. Señales electroencefalográficas se muestran en el panel de C con la línea roja que indica la activación auricular y la línea azul que corresponde a la señal ventricular. Por favor,ve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt; haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Hospital de Niños de Boston.

La extracción del corazón de ratas anestesiadas debe realizarse rápidamente para evitar la isquemia miocárdica. Si la perfusión de la isquemia o insuficiencia coronaria se produce, el corazón es probable que desarrollar arritmias y puede llegar a ser del infarto. Además, estos corazones se muestran insuficientes emisión de fluorescencia de las grabaciones de información y los análisis posteriores. Antes de cargar el medio de contraste, las células del miocardio deben ser adecuadamente preservados con solución de Krebs-H...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Equipo</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software CardioPlex</td><td>Equipo</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz LED LUXEON 460-490 nm</td><td>Equipo</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de ECG Tipo 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Equipo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicróico 505 nm</td><td>Equipo</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión paso alto 605 nm</td><td>Equipo</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Sideways</td><td>Equipo</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de bola miniatura</td><td>Equipo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Juego de electrodos de estimulación pequeño</td><td>Equipo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de aislamiento de vibraciones BM-6 de banco</td><td>Equipo</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de ECG monopolares</td><td>Equipo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica SCI 400</td><td>Equipo</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica MasterFlex Easy Load II</td><td>Equipo</td><td>Cole-Parmer</td><td>Modelo 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Marprene #14</td><td>Equipo</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>Tubo MasterFlex</td><td>Equipo</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de pulso cuadrado S48</td><td>Equipo</td><td>Grass Technologies</td><td>Modelo S48</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de aislamiento con transformador RF SIU5</td><td>Equipo</td><td>Grass Technologies</td><td>Modelo SIU5</td><td></td></tr><tr><td>Reservorio con camisa de agua de 5 litros</td><td>Equipo</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>Reservorio con camisa de agua de 2 litros</td><td>Equipo</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>Reservorio con camisa de agua de 0,5 litros</td><td>Equipo</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>Reservorio con camisa de agua de 0,25 litros</td><td>Equipo</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>Bobina de calentamiento de 10 ml</td><td>Equipo</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Trampa de burbujas de conformidad</td><td>Equipo</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Cánula con desconexión Luer</td><td>Equipo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías, FLL a MLT, sin tapas de puerto</td><td>Equipo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro con termopar</td><td>Equipo</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Microsonda flexible ultrafina serie IT</td><td>Equipo</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio Tektronix TDS 1002</td><td>Equipo</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>Monoxima de 2,3-butano</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Reactivo</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Reactivo</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

mapeo óptico de corazones de ratas langendorff perfundidos

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Mapeo óptico de la superficie cardíaca con sensibles al voltaje tintes fluorescentes se ha convertido en una herramienta importante para investigar la excitación eléctrica en modelos experimentales que van en escala de cultivos de células de órganos de todo el<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. El estado actual de la técnica de los sistemas de formación de imágenes ópticas, la generación y propagación de potenciales de acción en el ritmo cardíaco normal o en toda la iniciación y el mantenimiento de las arritmias se pueden visualizar casi al instante<sup&gt; [1]</sup&gt;. El último disponible en el mercado de sistemas pueden proporcionar información a las resoluciones espacio-temporal muy alta y se basa en la costumbre-construido el equipo inicialmente desarrollado para superar los obstáculos impuestos por los métodos electrofisiológicos más convencionales<sup&gt; [1]</sup&gt;. Los avances en alta resolución y alta velocidad complementary metal-oxide-semiconductor cámaras (CMOS) y la intensidad de brillo, diodos emisores de luz (LED), así como los tintes sensibles al voltaje, la óptica y filtros han empezado a hacer la adquisición de señales eléctricas prácticas para los biólogos celulares cardiovasculares que están más acostumbrados a trabajar con los microscopios. A pesar de la nueva generación de cámaras CMOS pueden adquirir 10.000 fotogramas por segundo en una matriz de píxeles 16.384, dependiendo del tipo de preparación de muestras, establecidas desde hace tiempo tecnologías de adquisición de fluorescencia, tales como arrays de fotodiodos, los sistemas de escaneo láser, y se enfría acusados-Coupled Device (CCD cámaras) todavía tienen algunas ventajas con respecto al rango dinámico, relación señal-ruido y la eficiencia cuántica<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. En el presente estudio, los corazones de ratas Lewis fueron perfundidos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Con una perfusión de cristaloides (solución de Krebs-Henseleit) a 37 ° C en un aparato Langendorff modificada. Después de un período de estabilización de 20 minutos, los corazones fueron perfundidos de forma intermitente con 11 mmol / L 2,3-butanodiona monoxima para eliminar la contracción asociada al movimiento durante la adquisición de la imagen. De mapeo óptico, cargamos los corazones con la sonda potenciométrica de respuesta rápida di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) y brevemente iluminada la preparación con 475 ± 15 nm de luz de excitación. Durante un típico período de 2 segundos de la iluminación,&gt; 605 nm de luz emitida desde la preparación cardiaca fue fotografiada con una cámara CMOS de alta velocidad conectado a un macroscopio horizontal. Para esta demostración, los corazones estaban ritmo de 300 pulsaciones por minuto con un electrodo coaxial conectado a una unidad de estimulación eléctrica aislada. Simultánea los registros bipolares electrográficos fueron adquiridos y analizados junto con las señales de voltaje utilizando el software fácilmente disponible. De esta manera, los potenciales de acción en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos puede ser visualizado y registrado con las señales electroencefalográficas.

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

El mapeo óptico de la superficie cardíaca mediante colorantes fluorescentes sensibles al voltaje se ha convertido en una herramienta importante para investigar la excitación eléctrica en ...

Hola, soy Yon Ziv del laboratorio del Dr. Cohen en el Departamento de Anestesiología del Hospital de Niños y la Escuela Médica Howard. Hoy mostraremos un procedimiento de mapeo óptico en corazones rojos perfundidos con solución de Langendorff. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la propagación de la actividad eléctrica en la superficie cardíaca.Así que comencemos. Por la mañana del experimento, prepare cuatro litros de solución de Krebs Hensel. Después de preparar la solución, elimine las partículas no disueltas con un filtro de 200 micrones utilizando filtración al vacío.Primero, utilice un litro de la solución preparada de Krebs Henzel lite para disolver 11 milimoles de BDM. Segundo, tome otros 100 mililitros de Krebs Henzel lite y mezcle 10 milimolar D ocho NFS en DMSO hasta una concentración final de cinco micromolar D ocho annex en solución. Los reservorios de vidrio con camisa de agua, el burbujeador y el material de vidrio utilizados aquí son todos de red.Naughty.Transfiera las dos soluciones a los reservorios precalentados a 41 grados Celsius. Oxygene las soluciones con gas filtrado de 0,2 micrones utilizando una bomba de burbueo sumergida. Pase las soluciones desde los tres reservorios de almacenamiento a través del sistema montado en la pared Ling Endorf, con bombas peristálticas y tubos de silicona de baja absorción, para extraer el corazón de rata. Primero, inyecte intraperitonealmente una rata Lewis de 200 a 250 gramos con ketamina y xilacina para inducir anestesia general profunda y con heparina para prevenir la coagulación sanguínea y la isquemia miocárdica durante la exsanguinación.Una vez que la rata esté completamente anestesiada y no responda a un apretón en el dedo del pie, proceda a extraer el corazón. Comience la cirugía retirando primero la pared torácica anterior para acceder fácilmente al corazón y a los grandes vasos. Luego, disecte cuidadosamente el tejido circundante y abra la bolsa pericárdica.Después de identificar la vena cava inferior, ligue esta vena con suturas de prolina 5-0 y explante el bloque completo de corazón y pulmón. Coloque inmediatamente el tejido en solución fría de Krebs-Henzel en un vaso de precipitados de 50 mililitros sobre hielo, identifique rápidamente la aorta ascendente y deséquela del tejido circundante. Introduzca una cánula de tamaño adecuado en la aorta.Teniendo cuidado de evitar insertar la cánula demasiado dentro de la raíz aórtica e interrumpir la perfusión obligatoria de las arterias coronarias. Fije la cánula a la aorta ascendente. Luego coloque el corazón de rata en el aparato Ling Endorf sin introducir burbujas de aire en la cánula.La perfusión vascular coronaria retrógrada ahora se establece con la solución de Krebs Hensel lite tibia y oxigenada. Desde la cabeza de presión del aparato Ling Endorf, retire ahora el tejido adicional, incluidos los pulmones, después de limpiarlo, y perfunda el corazón durante 20 minutos para permitir la recuperación de la función y estabilizar el ritmo mientras el corazón está siendo perfundido. Introduzca una sonda muy fina de termopar para medir la temperatura en la cavidad del ventrículo izquierdo.Suture la sonda en su lugar con cinco suturas de prolene 5-0 y ajuste la configuración de las bombas del circuito de agua para mantener la temperatura del corazón a 37 grados Celsius. Minimice el movimiento provocado por el perfusado que gotea desde el ápice cardíaco. Colocando un trozo de gasa en el recipiente de efluente, el corazón ya está listo para cargarse con el colorante potenciométrico y obtener señales electrográficas y ópticas, cargando así el colorante potenciométrico di-8-ANEPS en el corazón.Cambie a la línea de perfusión que contiene Krebs, por lo tanto luz mezclada con colorante fluorescente. Dado que los atrios no se perfunden suficientemente con el colorante introducido a través de las arterias coronarias, se coloca una cánula de calibre 18 en el atrio izquierdo y/o derecho. Y se administra lentamente una cantidad adicional de 50 mililitros de solución de colorante en cada una de estas cámaras.Durante el procedimiento de colocación, coloque suavemente tres derivaciones de ECG sobre la superficie del corazón, en la cara que no está orientada hacia la óptica utilizada para el mapeo. El primer electrodo se posiciona en la porción apical posterior del ventrículo izquierdo.El segundo se coloca sobre la aurícula izquierda y el tercero actúa como electrodo de referencia en la raíz aórtica. Las señales electrográficas auriculares y ventriculares se amplifican, digitalizan y muestran posteriormente como señales ópticas mediante el software. También se utiliza un osciloscopio para visualizar en tiempo real los ECG superficiales y asegurar un adecuado estimulación. Configure el amplificador de ECG en 0,1 hercios para el filtro de paso alto y en 150 hercios para el filtro de paso bajo. Posicione la cámara de los CMO mediante los ajustes X, Y, Z. Coloque sobre la superficie del corazón un trozo de vidrio que se sitúa en el plano focal de la cámara, de modo que la zona de interés quede enfocada y centrada en el marco de adquisición. La cámara y la óptica están montadas sobre una mesa de aislamiento de vibraciones para minimizar las frecuencias resonantes.Al mismo tiempo, coloque un electrodo de estimulación coaxial en la aurícula derecha, controlado mediante una unidad de estimulación eléctrica aislada S 48. Esto hará que el corazón lata a 300 latidos por minuto; configure la estimulación eléctrica de la siguiente manera.La frecuencia debe ser de cinco pulsos por segundo, con un retardo de 0,2 milisegundos, una duración de estimulación de dos milisegundos, una intensidad de seis a 12 voltios y el modo configurado en repetición y pulso único. Para grabaciones ópticas que carezcan de artefactos de movimiento provocados por la contracción, es necesario desacoplar electro-mecánicamente el corazón. Para ello, cambie nuevamente las líneas de perfusión a solución de Krebs-Henseleit que contenga 11 milimolares de BDM.Entre adquisiciones, perfunda el corazón con solución de Krebs-Henseleit no modificada para ayudar a preservar la viabilidad del preparado. Configure los parámetros de grabación del software a 2000 hercios con una matriz de píxeles de 128 por 128.El intervalo entre cuadros debe establecerse en 0,5 milisegundos y las ganancias deben ajustarse a cinco x para el amplificador de la cámara y ocho x para la ganancia en el chip. La ganancia en el chip también debe establecerse en 12. Configure en el software el control de la cámara con un retardo de obturación de 500 milisegundos y registre 4.000 cuadros durante una duración de 2000 milisegundos.Apague o proteja todas las luces de la habitación y del equipo para eliminar el ruido de fondo durante la grabación; la luz LED ilumina el corazón únicamente durante la grabación óptica. Para reducir el fotoblanqueo y la toxicidad del colorante, controle el obturador de la fuente de luz mediante un pulso de cinco voltios entregado a través del panel de control por medio de una tarjeta D dos A en la computadora tras la adquisición. Procese los datos utilizando diferentes configuraciones de filtro.Los ajustes predeterminados se utilizan generalmente, excepto al modificar el filtro de banda rechazada, que se configura con el límite izquierdo en 44,0 y el límite derecho en 98,0. Posteriormente, la información registrada se procesa y se utiliza para generar una película. Los datos de una adquisición corresponden a la activación eléctrica local en 16.384 sitios de la superficie cardíaca durante un período de dos segundos.El software permite comparar directamente estas señales locales entre sí y con los datos de grabaciones electrográficas auriculares y ventriculares mediante la asignación de la activación eléctrica local a un color y representa esta información como una animación que muestra la activación eléctrica espacio-temporal en la superficie cardíaca. Para crear dicha animación, primero utilice el software para filtrar los datos temporal o espacialmente. A continuación, seleccione un momento inicial y final para la animación.En tercer lugar, asigne señales ópticas a colores basándose en la intensidad luminosa en reposo de cada píxel. En cuarto lugar, superponga los datos de color resultantes con una imagen del corazón, y finalmente genere la animación si la preparación del corazón perfundido permaneció inmóvil durante la grabación. Las señales ópticas muestran un pico distinto para cada píxel implicado en un cambio de la intensidad de emisión de D eight anep. Estas películas de imágenes en tiempo real demuestran un frente de excitación que se propaga a través de la superficie epicárdica del corazón, así como los registros electrográficos adquiridos simultáneamente.Acabamos de demostrar una técnica de alta resolución para obtener imágenes ópticas del movimiento del potencial de acción en la superficie del Corazón Rojo Perfundido Alanor. Al realizar este procedimiento, es importante extraer rápidamente el corazón del rojo anestesiado. Para evitar la isquemia miocárdica, las células miocárdicas deben estar adecuadamente perfundidas y el corazón debe cargarse completamente con un colorante sensible al agua.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

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Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

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Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

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