Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

La imagenología de células vivas es particularmente útil al estudiar la dinámica del tráfico organular. Este video destacará un procedimiento utilizado para obtener imágenes de gránulos densos en neuronas hipocampales en cultivo. Primero se obtienen complejos de transfección mezclando medio D-N-A-M-E-M y el reactivo de transfección lipectomía.

Dado que las neuronas del hipocampo se cultivan sobre cubreobjetos invertidos frente a una monocapa de células gliales, estos cubreobjetos deben darse vuelta para exponerlos al reactivo de transfección. Después de permitir suficiente tiempo para la expresión de las proteínas de vesículas de núcleo denso marcadas con GFP, se construye una cámara de imagen. Se puede realizar una imagen de ICALs de núcleo denso en neuronas cultivadas utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio.

Este protocolo es flexible y puede adaptarse para obtener imágenes de otros orgánulos, como mitocondrias, endosomas y peroxisomas. Hola, soy Michael Silverman y bienvenidos a mi laboratorio de neurociencia celular en la Universidad Simon Fraser. Estamos interesados en cómo se mueven los orgánulos en las células nerviosas.

Para abordar esta pregunta, marcamos orgánulos de membrana don, específicamente vesículas de núcleo denso en neuronas hipocampales en cultivo. Y para mostrarles cómo lo hacemos, voy a cedérselo a David. Hola, soy David del laboratorio de Silverman.

Hoy les mostraré un procedimiento para la obtención de imágenes de células vivas de vesículas de núcleo denso y neuronas en cultivo mediante microscopía de campo amplio. Comencemos. Para la mayoría de los experimentos, utilizamos placas de neuronas hipocampales de rata que se han cultivado a una densidad celular de 250.000 células por placa de seis centímetros, para cada transfección se etiquetan dos tubos de 1,5 mililitros, uno para el ADN plasmídico y el otro para el reactivo de transfección.

En una cabina de flujo laminar, para combinar un microgramo de ADN plasmídico con cien microlitros de MEM en un solo tubo a temperatura ambiente, asegúrese de usar MEM que no contenga suplementos. Combine seis microlitros de lip con cien microlitros de MEM en el otro tubo. Se puede usar la misma cantidad para una doble transfección, aunque en tales casos la relación lip-ADN se reducirá a la mitad.

Para preservar la vida útil del reactivo lipídico, manténgalo siempre refrigerado o en un refrigerador de banco, e incube los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transfiera la mezcla de ADN en MEM al tubo lipídico y mezcle suavemente con APE Next; luego incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 25 minutos, agregue 60 microlitros de ácido K neurónico 50 milimolar para minimizar el daño citotóxico en las neuronas cultivadas.

Dado que cultivamos neuronas en la cara inferior de laminillas suspendidas sobre una monocapa de GL, es necesario invertir las laminillas y exponer las neuronas a la solución de transfección. Doble cuidadosamente la laminilla, colocando los pies hacia arriba, utilizando pinzas estériles. Colóquelas de forma que no se superpongan.

Tenga cuidado de no rayar la superficie del cubreobjetos recubierta con neuronas ni la superficie del plato recubierta con ggl. Al final de la incubación de 30 minutos, retire aproximadamente N 0,5 mililitros de medio del plato de seis centímetros y mézclelos suavemente con el ADN en el tubo. Transfiera la solución de ADN de vuelta al plato, dejándola gotear uniformemente sobre la superficie del medio.

Deslice suavemente el recipiente de un lado a otro en una dirección, pero asegúrese de no agitar el medio. Después de mezclar en una dirección, deténgase y repita en la dirección perpendicular para distribuir uniformemente los complejos de lipofección de ADN en todo el recipiente. Incube durante 90 minutos en el incubador de cultivo celular a 37 grados C y 5 % de dióxido de carbono.

Después de la incubación, dé la vuelta a las laminillas con el lado de los pies hacia abajo y colóquelas de manera que no se superpongan. Finalmente, permita que la expresión del ADN continúe durante el tiempo deseado, que normalmente es de toda la noche hasta 48 horas en el incubador. La obtención de imágenes en vivo de gránulos densos marcados con GFP en neuronas hipocampales en cultivo requiere un microscopio fluorescente equipado con una cámara CCD.

Se necesitará una cámara de imagen con un controlador de temperatura y un calentador de objetivo. La cámara no debe contener puertos abiertos, una modificación que puede incluirse al pedir la cámara. A continuación, encienda la cámara del microscopio, la lámpara fluorescente y el software de adquisición de imágenes.

Encienda la energía hacia la plataforma de la cámara y los calentadores del objetivo. Este también es un buen momento para aplicar una gota de aceite sobre los objetivos. Ahora prepare la plataforma calefaccionada y la cámara de imágenes.

Para facilitar la manipulación, etiquete un lado de la tapa de la cámara con un marcador permanente. Coloque la tapa de la cámara con el lado superior hacia arriba sobre la tapa de un tubo de 50 mililitros, que es un soporte ideal para la cámara.

Aplique un anillo de grasa al surco que rodea el orificio en el lateral de la cámara etiquetada como superior. Evite usar demasiada grasa, ya que entrará en la cámara y reducirá el área observable. Utilice pinzas.

Coloque un cubreobjetos limpio y sin usar de 18 centímetros en el lado superior de la cámara. Aplique presión suave sobre los bordes del cubreobjetos para crear un sello hermético dentro del surco empotrado de la cámara. Gire la cámara y aplique un anillo similar de grasa en el surco del lado opuesto o inferior de la cámara.

Transfiera 750 microlitros de medio de imagen al compartimento. Esta es una cantidad excesiva, pero la grasa debería evitar que el medio se derrame, y el exceso impedirá que queden atrapadas burbujas cuando se coloque el cubreobjetos con las células. Mantenga el compartimento preparado en el incubador de cultivo de tejidos hasta que sea necesario.

Se deben evitar incubaciones prolongadas, como una hora o más, ya que el medio de imagen se evaporará y cambiará en composición. Para el ensamblaje final de la cámara para imágenes de ciclo vital, traslade la cámara preparada y un plato con cubreobjetos transfectados del incubador a la cabina de cultivo de tejidos. Utilizando pinzas estériles, retire cuidadosamente un cubreobjeto del plato transfectado.

Luego, toque el borde de la cubreobjetos con una toalla de papel kim para absorber el medio de crecimiento. A continuación, coloque la cubreobjetos con la neurona hacia abajo sobre la cámara preparada. Toque un lado de la cubreobjetos con la grasa primero y aplique presión alrededor de los bordes para aplanar la cubreobjetos sin atrapar burbujas.

Se espera que el exceso de medio de imagen se derrame; elimine el exceso de medio de imagen, pero tenga cuidado de no deslizar el cubreobjetos de su posición. Mueva la cámara al calentador de plataforma precalentado y sujete la cámara en su lugar. A continuación, transfiera la cámara al portaobjetos para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad.

Ajuste la lámpara a la intensidad mínima necesaria para encontrar las células transfectadas. Ahora localice una célula de interés. Utilizando un objetivo de aceite de baja magnificación, como 40 x, es recomendable seguir un patrón de búsqueda planificado para asegurar una cobertura máxima del cubreobjetos y evitar adquisiciones de imágenes redundantes.

Una vez localizado un campo deseado, cambie al canal de una proteína marcada con fluorescencia de interés. Pase a un objetivo de inmersión en aceite de alta magnificación, como de 60 a cien aumentos, y restablezca la intensidad de la lámpara a un valor alto. Utilice la adquisición continua o una función equivalente de su software de imagen para registrar la dinámica de la proteína marcada con fluorescencia en orgánulos de rápido movimiento. El tiempo de exposición y el retraso entre exposiciones deben minimizarse para producir grabaciones con una alta tasa de cuadros por segundo.

La deriva focal que se observa en la vista previa en pantalla puede corregirse en tiempo real mediante ajuste manual del enfoque. Asegúrese de tomar una imagen de contraste de fase y cualquier otra imagen complementaria necesaria para el análisis y la presentación posteriores. Guarde todas las imágenes antes de explorar más el cubreobjetos y realizar la siguiente grabación.

Normalmente, se considera exitoso obtener tres a cinco grabaciones de un portaobjetos, y cada portaobjetos se imagina durante 30 a 60 minutos. Debe tenerse en cuenta la fototoxicidad para la salud celular general, ya que los transportadores se reducen en células dañadas. Las observaciones mediante microscopía de células vivas suelen consistir en grabaciones, también conocidas como series de imágenes, que muestran el movimiento de orgánulos marcados con fluorescencia dentro del campo de visión. A continuación se muestra una película representativa del transporte de iCal de núcleo denso.

El color se ha invertido para facilitar la observación. Observe las partículas en movimiento. Los gráficos CH son imágenes que ilustran el movimiento de partículas al yuxtaponer escaneos lineales en los que cada punto temporal está representado por una columna en el gráfico.

Esta figura muestra cómo se representan en un gráfico CH dos partículas que se mueven en direcciones opuestas. Un análisis adicional de los cronogramas puede proporcionar información sobre la velocidad del flujo de partículas, los cambios en la longitud de recorrido y las partículas estacionarias. Hola, acaban de mostrarte cómo obtener grabaciones de alta velocidad del transporte de vesículas dsco y de neuronas hipocampales cultivadas.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar precalentar todos los componentes de la cámara de imagen y la plataforma para reducir el estrés en las células durante su traslado del incubador al microscopio. Debe trabajar rápidamente pero con cuidado. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.