Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Las imágenes de células vivas son particularmente útiles cuando se estudia la dinámica del tráfico de órganos. Este video destacará un procedimiento utilizado para obtener imágenes de las células del núcleo denso en neuronas del hipocampo cultivadas. Los complejos de transfección se obtienen primero mezclando el medio D-N-A-M-E-M y el reactivo de transfección de lipectomía.

Dado que las neuronas del hipocampo se cultivan en cubreobjetos invertidos enfrentados a una monocapa glial, estos cubreobjetos deben voltearse para exponerlos al reactivo de transfección. Después de permitir suficiente tiempo para la expresión de las proteínas viscales del núcleo denso de la etiqueta GFP, se construye una cámara de imagen. Se puede obtener una imagen de ICALs de núcleo denso en neuronas cultivadas utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio.

Este protocolo es flexible y se puede adaptar para obtener imágenes de otros orgánulos como mitocondrias, endosomas y peroxisomas. Hola, soy Michael Silverman y bienvenido a mi laboratorio de neurociencia celular en la Universidad Simon Fraser. Estamos interesados en cómo se mueven los orgánulos en las células nerviosas.

Para abordar esta pregunta, etiquetamos orgánulos de membrana, específicamente vesículas de núcleo denso en neuronas del hipocampo cultivadas. Y para mostrarles cómo hacemos esto, se lo voy a pasar a David. Hola, soy David del laboratorio Silverman.

Hoy les mostraré un procedimiento para obtener imágenes de células vivas de vesículas de núcleo denso y neuronas cultivadas utilizando microscopía occidental de campo amplio. Empecemos. Para la mayoría de los experimentos, utilizamos placas de neuronas de hipocampo de rata que se han cultivado a una densidad celular de 250.000 células por placa de seis centímetros para cada transfección etiquetada con dos tubos de 1,5 mililitros, uno para el plásmido, el ADN y el otro para el reactivo de transfección.

En una campana de flujo laminar, para combinar un microgramo de ADN plasmídico con cien microlitros de MEM en un solo tubo a temperatura ambiente, asegúrese de usar MEM que no contenga ningún suplemento. Combina seis microlitros de labio con cien microlitros de MEM en el otro tubo. La misma cantidad se puede utilizar para el doble transefecto, aunque la proporción de ADN del labio se reducirá a la mitad en tales casos.

Para preservar la vida útil del reactivo labial, manténgalo refrigerado o en un refrigerador de sobremesa en todo momento, incube los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Transfiera la mezcla de ADN en MEM al tubo lipídico y mezcle suavemente con APE Next incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 25 minutos, agregue 60 microlitros de ácido neuronal K de 50 milimolares para minimizar el daño citotóxico a las neuronas cultivadas.

Dado que cultivamos neuronas en la parte inferior de los cubreobjetos suspendidos sobre una monocapa de GL, es necesario invertir los cubreobjetos y exponer las neuronas a la solución de transfección. Voltee con cuidado la cubierta, deslice los pies hacia arriba con pinzas estériles. Colócalos de manera que no se superpongan.

Tenga cuidado de no raspar la superficie recubierta de neuronas del cubreobjetos o la superficie recubierta de ggl del plato. Al final de la incubación de 30 minutos, tome aproximadamente 0,5 mililitros de medio del plato de seis centímetros y mezcle suavemente con el ADN en el tubo. Transfiera la solución de ADN de nuevo a la placa, goteando uniformemente sobre la superficie del medio.

Deslice suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás en una dirección, pero asegúrese de no hinchar el medio. Después de mezclar en una dirección, deténgase y repita en la dirección perpendicular para distribuir uniformemente los complejos de lipectomía de ADN por todo el plato. Incubar durante 90 minutos en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados C y 5% de dióxido de carbono.

Después de la incubación, voltee los deslizadores de la cubierta con los pies hacia abajo y colóquelos de manera que no se superpongan. Finalmente, permita que la expresión del ADN continúe durante el tiempo deseado, que generalmente es de toda la noche a 48 horas en la incubadora. La obtención de imágenes en vivo de células de núcleo denso marcadas con GFP en neuronas del hipocampo cultivadas requiere un microscopio fluorescente equipado con una cámara CCD.

Se necesitará una cámara de imágenes con un controlador de temperatura y un calentador de objetivos. La cámara no debe contener puertos abiertos, una modificación que se puede incluir al pedir la cámara. A continuación, encienda la cámara del microscopio, la lámpara fluorescente y el software de adquisición de imágenes.

Encienda la alimentación, la plataforma de la cámara y los calentadores de objetivos. Este también es un buen momento para aplicar una gota de aceite a los objetivos. Ahora prepare la plataforma calentada y la cámara de imágenes.

Para facilitar la manipulación. Etiquete un lado de la parte superior de la cámara con un marcador permanente. Coloque la parte superior de la cámara hacia arriba en la tapa de un tubo de 50 mililitros, que es un soporte de cámara ideal.

Aplique un anillo de grasa a la ranura que rodea el orificio en el costado de la cámara etiquetada como superior. Evite usar la grasa en exceso, ya que ingresará a la cámara y reducirá el área observable. Uso de fórceps.

Coloque un cubreobjetos de 18 centímetros limpio y sin usar en la parte superior de la cámara. Aplique una presión suave al deslizamiento de la cubierta en sus bordes para crear un sello hermético dentro de la ranura empotrada de la cámara. Dé la vuelta a la cámara y aplique un anillo similar de grasa a la ranura en el lado opuesto o inferior de la cámara.

Transfiera 750 microlitros de medio de imagen a la cámara. Esta es una cantidad excesiva, pero la grasa debe evitar que el medio se derrame y el exceso evitará que las burbujas queden atrapadas cuando se aplique el cubreobjetos cubierto de celdas. Mantenga la cámara preparada en la incubadora de cultivo de tejidos hasta que la necesite.

Deben evitarse las incubaciones prolongadas, como una hora o más, ya que el medio de imagen se evaporará y cambiará de composición. Para el ensamblaje final de la cámara para la adquisición de imágenes de estilo de vida, mueva la cámara preparada y un plato de cubreobjetos transfectados de la incubadora a la campana de cultivo de tejidos. Con pinzas estériles, retire con cuidado un cubreobjetos de la placa transfectada.

A continuación, toque el borde de la cubierta con una toallita kim para extraer el medio de crecimiento. A continuación, coloque la neurona de cubreobjetos hacia abajo sobre la cámara preparada. Toque un lado de la cubierta, deslícela primero sobre la grasa y aplique presión alrededor de los bordes para que la cubierta quede plana sin que queden burbujas.

Se espera que el exceso de medio de imagen se derrame, limpie el exceso de medio de imagen, pero tenga cuidado de no deslizar el cubreobjetos fuera de su posición. Mueva la cámara al calentador de plataforma precalentado y fije la cámara en su lugar. A continuación, transfiera la cámara a la etapa para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad.

Ajuste la lámpara a la cantidad mínima de intensidad necesaria para encontrar las células transfectadas. Ahora encuentra una celda de interés. Al utilizar un objetivo de aceite de bajo aumento, como 40x, es beneficioso ceñirse a un patrón de búsqueda planificado para garantizar la máxima cobertura de cubreobjetos y evitar adquisiciones de imágenes redundantes.

Una vez que se ha localizado un campo deseado, cambie el canal de una proteína de interés marcada con fluorescencia. Cambie a un objetivo de aceite de alto aumento, como de 60 a cien x, y devuelva la intensidad de la lámpara a un ajuste alto, utilice la adquisición de flujo o una función comparable de su software de imágenes para registrar la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia para los orgánulos que se mueven rápidamente. El tiempo de exposición y el retardo entre exposiciones deben minimizarse para producir grabaciones con una alta velocidad de fotogramas.

El desviación focal que se observa en la vista previa en pantalla se puede corregir en tiempo real mediante el ajuste manual del enfoque. Asegúrese de tomar una imagen de fase y cualquier otra imagen adjunta necesaria para su posterior análisis y presentación. Guarde todas las imágenes antes de explorar más a fondo el cubreobjetos y realizar la siguiente grabación.

Por lo general, de tres a cinco grabaciones de un cubreobjetos se consideran exitosos y se obtienen imágenes de los cubreobjetos durante 30 a 60 minutos, cada uno debe tenerse en cuenta la fototoxicidad en la salud general de las células, ya que los transportadores se reducen en las células dañadas. Las observaciones de imágenes de células vivas suelen consistir en grabaciones, también conocidas como pilas de imágenes, que muestran el movimiento de orgánulos marcados con fluorescencia dentro del campo de visión. Aquí hay una película representativa del transporte iCal de núcleo denso.

El color se ha invertido para facilitar la observación. Fíjate en las partículas en movimiento. Los gráficos CH son imágenes que ilustran el movimiento de las partículas mediante la yuxtaposición de escaneos lineales en los que cada punto de tiempo está representado por una columna en el gráfico.

Esta figura muestra cómo se representan dos partículas que se mueven en direcciones opuestas en un gráfico CH. Un análisis más detallado de los cronógrafos puede proporcionar información sobre la velocidad del flujo de las partículas, las inversiones de la longitud de ejecución y las partículas estacionarias. Hola, acabamos de mostrarle cómo adquirir grabaciones de alta velocidad del transporte de vesículas dsco y neuronas capitales de hipopótamo cultivadas.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar precalentar todos los componentes de la cámara de imágenes y la plataforma para reducir el estrés en las células durante su transición de la incubadora a la etapa. Debes trabajar rápido pero con cuidado. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.