Name: Gibberella zeae ascósporas de producción y de recolección de experimentos de microarrays. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 24 s
Description: Aprenda a producir y recolectar ascosporas de Gibberella zeae mediante procedimientos estériles filmados para perfiles de expresión genómica. Este protocolo mejora la reproducibilidad en estudios de biología fúngica.

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Los autores agradecen a Karen Hilburn para el apoyo técnico excelente. Este proyecto fue financiado por la Iniciativa Nacional de Investigación del USDA Servicio Cooperativo Estatal de Investigación, Educación y Extensión (Premio # 2004-35604-14327). Matías Pasquali es apoyado por Branco Weiss Comunidad. El trigo de los EE.UU. y la Iniciativa de la sarna La cebada es también reconocido por el continuo apoyo de la investigación.

<ol><li> Agar zanahoria (Klittich y Leslie, 1988) se preparó en un diámetro de 9 cm de placas de Petri. </li><li> Un cubo de 2 mm de agar que contiene micelio frescos cultivados en agar dextrosa papa se aplicó en el centro de cada placa de Petri. </li><li> Las culturas se desarrollaron a 25 ° C y un fotoperíodo de 12 h durante 96 horas. </li><li> Un ml de una solución acuosa 2,5% Tween 60 se aplicó a la superficie de la cultura (Camino y Common, 2000) y se extendió a través de la cultura con una barra de plástico, presionando suavemente. </li><li> Tiro peritecios ascosporas desarrollado 7-10 días después de este tratamiento de inducción cuando se mantienen en un ambiente de alta humedad a 25 ° C con fotoperíodo mismo. </li><li> La recolección de esporas se realiza mediante el cambio de la tapa la placa de Petri, dejando peritecios a disparar por un tiempo limitado (por ejemplo 12 horas) en la oscuridad. </li><li> Agua estéril se añade a la tapa, la suspensión de ascosporas moviendo suavemente el agua en la superficie. </li><li> Las ascosporas se recogen en tubos estériles Falcon, lavar y usar para su posterior análisis. </li></ol>

<ol><li>Beyer, M., Verreet, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+Gibberella+zeae+ascospores+as+affected+by+age+of+spores+after+discharge+and+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors.</a> , (2005).</li>
<li>Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+inoculum+levels+of+Gibberella+zeae+on+wheat+spikes.+Plant+Disease+83%2C662-666%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666.</a> , (1999).</li>
<li>Goswami, R. S., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heading+for+disaster%2C+Fusarium+graminearum+on+cereal+crops.+Molecular+Plant+Pathology+5%2C515%26%23x2013%3B525%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515&#x2013;525.</a> , (2004).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+in+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuroi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi.</a> Genetics. 118, 417-2013 (1998).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecium+development+in+Gibberella+zeae%2C+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study.</a> , (2000).</li>
<li>Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+uniform+production+of+perithecia+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae.</a> Mycologia. , 67-1101 (1975).</li>
<li>Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+environment+on+sexual+reproduction+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae.</a> , (1976).</li>
</ol>

El protocolo que aquí se presenta se basa en los procedimientos previos para la producción perithecial de Fusarium spp. (Klittich y Leslie, 1988; Trail y Common, 2000). Normalización del procedimiento por el cual grandes cantidades de ascosporas (suficientes para el análisis de microarrays) se han generado era esencial para la reproducibilidad del experimento. Se ha informado de que las diferencias de los factores ambientales, la edad y el sustrato puede cambiar el carácter biológico de ascosporas (Beyer y Verreet, 2005). Por lo tanto el us...

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 9 cm de diámetro</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 60 (20%)</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar zanahoria (zanahorias orgánicas al 20% p/v y agar al 1,5% p/v)</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gibberella zeae ascósporas de producción y de recolección de experimentos de microarrays.

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae) es un patógeno de las plantas que causan enfermedades costra sobre el trigo y la cebada que reduce el rendimiento de los cultivos y la calidad del grano. F. graminearum también causa pudriciones de tallo y mazorca de maíz y es un productor de micotoxinas como los tricotecenos que contaminan el grano y son perjudiciales para los seres humanos y el ganado (Goswami y Kistler, 2004). El hongo produce dos tipos de esporas. Ascosporas, los propágulos derivados de la reproducción sexual, son la principal fuente de infección primaria. Estas esporas son dados de alta de la fuerza peritecios maduros y dispersadas por el viento (Francl et al 1999). Las infecciones secundarias son causadas principalmente por macroconidios que se producen por medios asexuales en la superficie de la planta. Para estudiar los procesos de desarrollo de las ascosporas de este hongo, un procedimiento para su obtención en grandes cantidades bajo condiciones estériles, se requería. El protocolo fue filmado el fin de generar el mayor nivel de información para la comprensión y la reproducibilidad, aspectos cruciales cuando genoma completo del perfil de expresión génica se generan y se interpretan. En particular, la variabilidad de la germinación de las ascosporas y la actividad biológica depende de la previa manipulación del material. El uso del vídeo para documentar cada paso en la producción de ascosporas se propone con el fin de incrementar la estandarización, cumpliendo con los requisitos cada vez más estrictas para el análisis de microarrays. El procedimiento sólo requiere equipo de laboratorio estándar. Pasos se muestran para evitar la contaminación y la sincronización de tiempo a favor de las ascosporas.

Para estudiar los procesos de desarrollo de ascosporas en Gibberella zeae, un procedimiento para la recolección en condiciones estériles se filmó con el fin de generar el mayor nivel de información para la descripción del protocolo. Esto debería facilitar la reproducibilidad del experimento, un aspecto crucial en el genoma completo del perfil de expresión de las pruebas de cumplimiento.

Gibberella zeae ascósporas de producción y de recolección de experimentos de microarrays.

*Fusarium graminearum* Schwabe (teleomorfo *Gibberella zeae*) es un patógeno vegetal que provoca la fusariosis en el trigo y la cebada, lo que reduce el rendimiento de los cultivos y la calidad del grano...

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Investigación

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Biología

En este protocolo, la expresión de genes en la levadura...

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

La devastación de los cultivos de cereales de semillas por los hongos que infectan ha llevado a los numerosos esfuerzos de investigación para comprender mejor las interacciones planta-patógeno. Para estudiar las interacciones entre las semillas de hongos en un entorno de laboratorio, hemos desarrollado un método robusto para la cuantificación de reproducción de los hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas mediante bioensayos del kernel.

La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

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Desarrollo Sexual y descarga en las ascosporas Fusarium graminearum</em

Este video muestra un método para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra. Las esporas de hongos se microinyectan en el ventrículo posterior del cerebro de las larvas y las larvas se incuban para permitir el desarrollo de la infección. Las larvas infectadas se recolectan a intervalos definidos y el progreso de la infección se evalúa mediante la enumeración de las unidades formadoras de colonias.

Una técnica para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra

El video muestra una técnica de dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para observar la infección por patógenos fúngicos marcados con fluorescencia en larvas de pez cebra. La infección inicial atrae a los macrófagos y, a medida que la infección persiste, el reclutamiento de neutrófilos progresa en el lugar de la inyección.

Una técnica zWEDGI para visualizar larvas de pez cebra infectadas con patógenos fúngicos

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Un cuello de botella en el ciclo de ingeniería microbiana en el ciclo de "diseño-construcción-prueba" es la velocidad a la que podemos realizar pantallas funcionales de cepas. Describimos un método de alto rendimiento para el cribado de deformación unitaria aplicado a cientos a miles de células de levadura por experimento que utiliza la secuenciación de ARN basada en gotas.

Fenotipado de tensión de levadura de alto rendimiento con secuenciación de ARN basada en gotas

Este protocolo describe un modelo de infección por Aspergillus en larvas de pez cebra. Las esporas de Aspergillus se microinyectan en el cerebro posterior de las larvas, y el tratamiento químico se utiliza para inducir la inmunosupresión. La progresión de la infección se supervisa a través de una configuración de imágenes diaria para controlar el crecimiento de hongos y las respuestas inmunitarias, así como la enumeración de esporas vivas por la colonia que forma el revestimiento de la unidad.

Infección De Larvas De Pez Cebra Con Esporas De Aspergillus Para El Análisis De Las Interacciones Huésped-Patógeno

Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.

Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.

Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

Aprenda a producir y recolectar ascosporas de Gibberella zeae mediante procedimientos estériles filmados para perfiles de expresión genómica. Este protocolo mejora la reproducibilidad en estudios de biología fúngica.

Gibberella zeae ascósporas de producción y de recolección de experimentos de microarrays.

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