Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Este procedimiento comienza preparando una larva de drosófila de manera que quede vuelta del revés para exponer la superficie de las células musculares de la pared corporal, así como las neuronas motoras y las células ggl asociadas, combinando la tinción fluorescente de terminales neuronales presinápticos, la expresión endógena de GFP y DS red dirigida a las membranas celulares gliales y musculares postsinápticas, y la visualización del espacio parasináptico mediante colorantes fluorescentes. De este modo, puede observarse claramente en una preparación viva los cambios estructurales que ocurren en la unión neuromuscular glial. Hola, soy D Brink en el laboratorio de ALS de Vanessa en el departamento de zoología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostraré una preparación de tejido y dos técnicas de marcado celular para obtener imágenes de tejido larval vivo de al mediante microscopía confocal.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar las células gliales en la sinapsis neuromuscular. Ahora, para algo completamente diferente, la preparación de tejido de dentro hacia fuera comienza con la clasificación por etapas de las larvas. Este procedimiento se demostrará en larvas de tercer estadio errantes porque son grandes y fáciles de diseccionar; utilice únicamente larvas W3 que estén arrastrándose activamente.

A continuación, limpie la superficie de las larvas con un pincel de pintura muy suave en una placa de Petri con agua doblemente destilada. Limpiar las larvas es importante porque mejora la calidad óptica y también reduce la presencia de bacterias. Después de limpiar las larvas, transfiéralas a una placa de Petri pequeña con tres mililitros de HL6 frío con hielo conteniendo cinco milimolares de glutamato.

Coloque el recipiente sobre hielo hasta que el animal deje de moverse y se relaje, lo cual generalmente tarda unos dos minutos. Una vez que las larvas hayan dejado de moverse, puede comenzar la disección del tejido utilizando un microscopio de disección, sosteniendo las tijeras de resorte con la mano dominante y la pinza de punta muy fina. Con la otra mano, haga un pequeño orificio en la pared corporal con las tijeras para equilibrar la presión a través de la pared corporal, mientras sostiene suavemente al animal en el fondo del recipiente.

Con la pinza, corte los dos segmentos posteriores y separe las vísceras. Es probable que algo del cuerpo graso salga de la cavidad corporal a través de la incisión. Corte también este tejido.

Siga sosteniendo suavemente las larvas contra el fondo del recipiente con la pinza fina. Con la otra mano, sostenga una aguja de insecto número cero de punta roma e insértela contra las piezas bucales de las larvas. Empuje las piezas bucales a través de la cavidad corporal como si estuviera volteando un calcetín del revés sobre su puño.

El tejido con el interior hacia afuera debe tener este aspecto. Con las tijeras de disección finas de resorte, separe el cuerpo graso y las tráqueas de la pared corporal. Retire tanto cuerpo graso como sea posible.

Intente con mucho cuidado no tirar de las tráqueas ni desconectar el sistema nervioso. Rasgar las tráqueas provocará perforaciones en el músculo de la pared corporal. Cuando haya terminado la disección, el músculo debe estar translúcido y relajado, no opaco ni contraído.

Si coloca el músculo en HL6 sin glutamato a temperatura ambiente, es probable que se contraiga rítmicamente. Debido a que los generadores de patrones motores en el SNC están activos, la pared corporal intacta invertida tiende a plegarse por la mitad a lo largo de las líneas medias dorsal y ventral. Por lo tanto, la preparación proporciona un animal hemi izquierdo o derecho para su visualización.

Finalmente, monte el tejido en un portaobjetos de microscopio con una disposición de cubreobjetos elevado. Los procedimientos para el montaje del tejido se mostrarán más adelante. Para comenzar la marcación de los bastones neuronales, aspire 30 microlitros de solución del anticuerpo primario anti-HRP marcado con fluorescencia en HL6 y coloque una gota en una placa de Petri.

A continuación, sumerja la preparación del muro corporal invertido en el baño de tinte. Es posible que observe marcado de terminales neuronales tras unos cinco minutos, pero incube durante 10 a 20 minutos para obtener una etiqueta completa y brillante.

Para eliminar el exceso de marcador de HRP, coloque el tejido en medio mililitro de HL seis durante 10 a 30 segundos a temperatura ambiente. El colorante no unido se elimina rápidamente, por lo que el ciclo de lavado no necesita ser largo ni vigoroso. El tejido marcado ya está listo para ser montado y visualizado mediante microscopía.

Una variación del protocolo de marcado con anticuerpos en vivo mostrado anteriormente consiste en usar dextrina conjugada con fluorescencia para resaltar los espacios extracelulares llenos de líquido. Para comenzar este procedimiento, diluya el colorante de dextrina conjugada con fluorescencia en HL6 a 0,001 miligramos por mililitro. Es posible que necesite variar la concentración de dextrina si no le interesa el momento exacto de entrada del eje di al espacio extracelular.

Pipetee una gota de 20 microlitros de colorante sobre un cubreobjetos con puente y transfiera la preparación del tejido al baño de colorante. Si no es necesario perfundir el tejido invertido o si el volumen de HL seis debe mantenerse pequeño, puede montarse sobre un portaobjetos con doble puente. Comience pegando con superadhesivo dos cubreobjetos cuadrados de 18 milímetros sobre un portaobjetos muy limpio.

Deje un espacio de dos milímetros entre los bordes de las laminillas y centre el espacio, aproximadamente en la mitad del portaobjetos. Deje secar completamente el pegamento, ya que de lo contrario formará una película sobre el medio acuoso alrededor de su preparación de tejido.

A continuación, coloque una gota de 30 microlitros de HL seis en el espacio entre las laminillas. Coloque el tejido invertido dentro de la gota de HL seis. Es posible que necesite colocar el tejido en diagonal si la larva es grande y su sistema de adquisición de imágenes tiene una matriz de píxeles limitada.

Aplique una pequeña cantidad de vaselina en los bordes de un tercer cubreobjetos de 18 milímetros y colóquelo con la cara engrasada hacia abajo sobre los dos cubreobjetos pegados, encima del tejido, presionando suavemente. A continuación se muestran los resultados de nuestros dos métodos de marcado fluorescente agudo de la preparación de larva invertida, obtenidos con un microscopio confocal de disco giratorio. La primera imagen es una serie óptica de una sinapsis nerviosa glial-muscular con terminales de botón marcados con anti-HRP en vivo.

En la superficie de la célula muscular, podemos observar terminales de tipo botón neuronal intensamente marcados, pseudocoloreados en azul. En el centro del corte de imagen, encontramos extensiones gliales marcadas con GFP mostradas en verde, así como botones marcados con HRP en azul. Al rodear los botones, podemos ver secciones transversales de la SSR con forma de bolsillo, las retículas subsinápticas, que están coloreadas en rojo; también en el plano medio y más profundo del corte se observan la SSR marcada en rojo DS.

Las SSR son las regiones sinápticas especializadas de la célula muscular. Los bns se ubican dentro de los bolsillos de las células musculares, al igual que algunas partes de las extensiones gliales verdes. Las extensiones de las células gliales se intercalan alrededor de los bns y las SSR, pero no cubren la superficie de la sinapsis como una manta en las capas más profundas de la pila.

Observamos extensiones gliales verdes y el SSR rojo, pero no tantos terminales de botón. También podemos encontrar secciones transversales del nervio motor que inerva el músculo. Las células gliales envuelven el nervio motor, por lo tanto también es verde.

El segundo resultado de la etiquetación fluorescente aguda del preparado larval invertido es la sinapsis marcada con dextrina fluorescente. Aquí, el líquido en el espacio parasináptico o hendidura sináptica está marcado en rojo. En las capas superficiales de la imagen de la serie óptica, hay una capa de líquido de colorante de dextrina roja, y se puede observar dónde se acumula en las depresiones onduladas de la membrana plasmática muscular.

En capas más profundas de la serie, el colorante fluorescente de dextrina ha penetrado en las hendiduras sinápticas; se forman pequeños anillos con forma de rosquilla de colorante en el espacio entre los terminales neuronales y los compartimentos SSR marcados en azul. Esta es la hendidura sináptica resaltada con colorante. La lámina glial verde no bloquea la penetración del colorante en la hendidura en las capas más profundas de la serie de imágenes.

Las características más destacadas son la SSR o región sináptica del músculo marcada en azul, y las extensiones gliales aplanadas que son verdes. Asimismo, la vaina glial alrededor de los axones nerviosos observada en capas profundas es verde. La vaina glial parece excluir el colorante de dextrina.

Acabo de mostrarle un método novedoso para visualizar la sinapsis nervio-músculo glial en una preparación de tejido al revés de larvas de drosófila. Al preparar el tejido, es importante recordar tratarlo con cuidado y asegurarse de que el músculo esté relajado y de que los nervios periféricos no resulten dañados. Me gustaría concluir con una cita de Marx.

El tiempo vuela como una flecha. El miedo vuela como un plátano.