Name: Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a visualizar sinapsis gliales en la unión neuromuscular de Drosophila mediante preparación de tejido invertido y tinciones fluorescentes. Este método permite estudiar interacciones celulares en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este proyecto fue financiado por el CIHR y NSERC. Nos gustaría agradecer Jusiak Barb para contribuir a la creación de las cepas de moscas que expresan dsRed etiquetados SSR (línea BJ), y el Fondo para el UBC Bio-imágenes.

Parte 1: Preparación del tejido <ol><li> Nuestro objetivo es una preparación de tejidos de larvas de mosca en el sistema nervioso está intacto, pero la superficie interior de la pared muscular del cuerpo se expone a una hemolinfa artificial, y se pueden colocar cerca de un cubreobjetos microscopio para ópticas. En otras palabras, un interior a cabo la preparación de larvas. Dado que las preparaciones convencionales de tejidos se refieren al corte, fijación y estiramiento de la pared muscular del cuerpo, ya veces la eliminación de parte del sistema nervioso, necesitamos un enfoque diferente. Queríamos que los animales de dentro a fuera porque quería conseguir un buen vistazo a las características estructurales y los cambios estructurales en el tiempo en la sinapsis, y hemos querido mantener el sistema nervioso intacto. También hemos querido evitar el estiramiento del tejido, y la activación de los receptores de estiramiento, lo que haría que los músculos de contracción y la ruina de nuestras imágenes. </li> <li> Para empezar, el estadio de los animales. La alimentación de las larvas de tercer y errante larvas de tercera son grandes y fáciles de diseccionar lo que vamos a demostrar en W3 larvas. Este animal se tiene el fenotipo Tubby, y es muy amplia, por lo que es fácil de Evert. Hemos utilizado las larvas que vimos activamente gatear, incluyendo larvas de W3. </li><li> Limpie la superficie de un gusano con un pincel muy suave en una placa de Petri de H2O bidestilada. Las larvas tienen una mejor óptica limpia y la limpieza reduce las bacterias. </li><li> La transferencia de los animales a una pequeña placa de Petri de alrededor de 3 ml de hielo frío HL-6, y en la hemolinfa artificial. Coloque el plato en el hielo hasta que el animal deja de moverse, y se relaja (unos 5 minutos). </li><li> Sujete con fórceps punta muy fina en una mano y las tijeras de primavera en el otro. Yo uso las tijeras con la mano dominante. Haz un pequeño agujero en la pared del cuerpo con las tijeras para equlibrate la presión a través de la pared del cuerpo. </li><li> Sujetar al animal suavemente con las pinzas hacia abajo en la parte inferior de la placa y cortar la parte posterior de dos segmentos. Diseccionar las vísceras y la grasa corporal es probable que se mueven fuera de la cavidad del cuerpo. Cortar este tejido también. </li><li> Mantenga las larvas contra la parte inferior plato con unas pinzas finas. Mantenga un pin # 0 de insectos en (con punta roma) y empujarla contra la partes de la boca de las larvas. Empuje el aparato bucal a través de la cavidad del cuerpo como el que está girando un calcetín del revés. </li><li> El revés del tejido se parecerá a la figura: a continuación. Con ultra-fino de herramientas de disección, diseccionar los de grasa corporal y trachioles de la pared del cuerpo. Realmente difícil tratar de no tirar la trachioles, o desconectar el sistema nervioso. Rasga el trachioles rasgar los agujeros en la pared muscular del cuerpo. Extraer el cuerpo tanta grasa como sea posible. Ambas estructuras alterar la calidad óptica de sus tejidos. Es posible que desee omitir el café antes de hacer esta preparación. </li> <li> Cuando haya terminado el músculo será transparente, no opaco o blanco. Si ponemos la preparación de tejidos en HL-6 sin glutamato, a temperatura ambiente, es probable que se contraen rítmicamente, porque los generadores de patrón motor en el sistema nervioso central están trabajando. Evite el uso de preparaciones con los músculos contraídos, obviamente, o contratados irregularmente pared del cuerpo. El interior de la pared del cuerpo intacto fácilmente tiende a doblar por la mitad a lo largo de la línea media dorsal y ventral, por lo que la preparación le da a la izquierda oa la derecha &quot;hemi-animal&quot; para visualizar. </li><li> 1.9 Montar el tejido, ya sea en una cámara de pequeño volumen comercial, tales como la cámara de Warner, o un portaobjetos de microscopio con una disposición de cubierta antideslizante puente. Ver la parte 3 de sugerencias sobre el tejido de montaje. </li></ol> Parte 2: Etiquetado de Bouton neuronal con anticuerpos marcados con fluorescencia primaria contra el HRP. <ol><li> Poner 50 microlitros de la etiqueta fluorescente primario anti-cuerpo contra el HRP en HL-6 en una gota en una placa de Petri. Sumergir la preparación del cuerpo de adentro hacia afuera de la pared en el baño de tinte. Usted puede ver el etiquetado neurona terminal después de unos 5 minutos, pero se incuba durante 10-20 minutos, de una etiqueta completa y brillante. </li><li> Enjuague el tinte fuera durante 10-30 segundos en HL-6 a temperatura ambiente. No obligado tinte enjuaga rápidamente, así que el ciclo de enjuague no es necesario ser agresivo. </li><li> Variar la concentración de colorante y el tiempo de incubación, según sea necesario. </li></ol> Parte 3: etiquetado espacio Perisynaptic con dextrano conjugado flurophore <ol><li> Diluir con fluorescencia conjugada con dextrano tintura diluida en HL-6. Una concentración que funcionó bien para nuestros propósitos fue: </li><li> Si usted no está preocupado por el tiempo de acceso medio de contraste dentro de su espacio extracelular, poner una gota 20 micro litros de colorante en un &quot;puente&quot; cubreobjetos (véase la parte 4) y el depósito de preparación en el baño de tinte. </li></ol> Parte 4: Montaje del tejido para la visualización (con microscopía confocal). Si no es necesario para perfundir su preparación (breves observaciones) o si desea mantener el volumen de baño HL-6 pequeños, utilice el método de doble cara en puente Si desea perfundir su preparación, pruebe a usar una cámara de perfusión. Se utilizó un moCámara dified de instrumentos de Warner. Detalles para los dos siguientes. Montaje de preparación en un portaobjetos de doble puente. <ol><li> Use un portaobjetos muy limpio. Superglue dos cuadrados de 18 mm (# 1.5) cubreobjetos sobre el portaobjetos. Deje un espacio de 2 mm entre los bordes del cubreobjetos. </li><li> Deje que el pegamento seque completamente, o se forma una película extraña en los medios acuosos alrededor de su preparación. </li><li> Posición de la parte interior de larvas entre los bordes de los cubreobjetos. Es posible que necesite la posición de la preparación en una diagonal, si las larvas es grande y su sistema de adquisición de imágenes tiene una matriz de píxeles limitados. </li><li> Cubrir el tejido con un cubreobjetos # 1.5 mm, 18 mm (muy limpio). Se adhieren al &quot;top&quot; de la diapositiva colocada cubreobjetos se desliza el tejido de acompañamiento, con vaselina mínimo. </li><li> Ponga una gota de aceite de Cargill objetivo personalizado con un índice de refracción de 1,3379 (si se utiliza HL-6) en el cubreobjetos encima y voltear esta asamblea otra vez. </li><li> Coloque el conjunto del tejido en el microscopio de lado el petróleo, hacia el objetivo, y enfocará su objetivo. Montaje del tejido en una cámara de perfusión modificado. </li><li> Pegue un cubreobjetos de 1,5 a formar un piso en la cámara de RC 20. Coloque el tejido en la cámara de acuerdo con las instrucciones de RC-20. Use un pedazo de malla en lugar de Nytex un cubreobjetos para formar un techo de la cámara. </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: <ol><li> De adentro hacia fuera la preparación del tejido disección de la secuencia: <img src="/files/ftp_upload/1154/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> W3 larvas, se lavó (&quot;Tubby&quot; fenotipo) (5.1.1). W3 larvas, posterior dos segmentos disecados. Usted puede ver el cuerpo de grasa empujado fuera de la cavidad del cuerpo por cuerpo trans-presión de la pared (flecha). Trate de minimizar visceral &quot;erupción&quot;, haciendo un pequeño agujero en la pared del cuerpo un minuto antes de la disección (5.1.2). La preparación de las vísceras disecados antes de encender la preparación de adentro hacia afuera (5.1.3). La preparación, en su mayoría evertido, con el pasador (flecha) dentro de la luz de la preparación (5.1.4). El músculo se encuentra ahora en el exterior y la cutícula está en el interior, con alguna grasa corporal y trachioles adjunta (5.1.5). Un tejido completamente disecados preparación con casi todos los de la grasa corporal y trachioles disecados (5.1.6). <img src="/files/ftp_upload/1154/fig2a.jpg" alt="la figura 2" width="600" height="200" /></li><li> Vivir el etiquetado el uso de anti-HRP en la UNM larval. Un representante W3 larval músculos y nervios hacen sinapsis con una extensión gliales (de adentro hacia afuera-prep). Los terminales de las neuronas motoras bouton se etiquetan con un primario anti-cuerpo contra HRP (magenta), que se conjuga con Cy5. Los procesos gliales están etiquetados con las buenas prácticas agrarias (verde). <img src="/files/ftp_upload/1154/fig2b.jpg" alt="la figura 3" /></li><li> Espacio Perisynaptic fluorescencia visualiza con Alexa 680 dextrano en un revés de preparación. El proceso gliales (verde) está marcada con GFP membrana específicos. La República Socialista Soviética de post-sináptica en la superficie del músculo (azul) está marcado con dsRed. El dextrano Alexa (rojo) formas concentra en las zonas extracelular. El tinte de dextrano forma piscinas en forma de anillo en los espacios perisynaptic. El etiquetado de dextrano y SSR dsRed etiqueta se muestra en escala de grises. Tenga en cuenta las piscinas con forma de donut múltiples tinte destacando los espacios perisynaptic (flecha). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicles%3A+Test+for+a+role+in+presynaptic+Calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium-channel+currents+in+normal+and+csp+mutant+Drosophila+peptidergic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals.</a> Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).</li>
<li>Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Function+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li>
</ol>

Este procedimiento permite a largo plazo de imágenes en vivo de proteínas marcadas y los procesos celulares. La preparación en el tejido in situ que se describe tiene un sistema nervioso central intacto y funcionando, PNS y circuitos reflejos. Esta preparación de tejidos tiene ventajas sobre los protocolos estándar de larvas de mosca de los músculos, donde se estira el músculo de la pared del cuerpo larval (cuando se fija a cabo). El estiramiento puede distorsionar la morfología sináptica y desencadena...

<table><tbody><tr><td>HL-6: Hemolinfa artificial de Drosophila, con 5 mM de L-glutamato añadido y 2 mM de calcio.</td><td>Reactivo</td><td>N/A</td><td>NA</td><td>El 5 mM de L-glutamato bloqueó las contracciones musculares. Utilizamos L-glutamato de grado molecular (Sigma). El 2 mM de calcio se aproxima a los niveles fisiológicos de calcio en la hemolinfa larvaria natural. Referencias: Macleod et al. 2002 y Macleod 2004</td></tr><tr><td>Dextrano, Alex Fluor 680; peso molecular de 10.000, aniónico, fijable</td><td>Reactivo</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D34680</td><td>Utilice una cámara de perfusión de pequeño volumen para mantener bajo el volumen total del colorante</td></tr><tr><td>Conjugado Anti-HRP-CY5 (de cabra)</td><td>Reactivo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-175-021</td><td>Diluya 2,0 mg en 1 ml de ddH2O; alícuotas de 4 microlitros. Congele a &amp;#8211;20 °C. Diluya una alícuota en 100 microlitros de HL-6</td></tr><tr><td>Kit de etiquetado con anticuerpo Alexa 647</td><td>Reactivo</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A10475</td><td>Preparamos un total de 80 microlitros de anticuerpo primario conjugado y lo almacenamos en alícuotas de 2 microlitros. Diluimos cada alícuota en 100 microlitros de HL-6 para la marcación.</td></tr><tr><td>Aceite de inmersión formulado a medida, índice de refracción 1,3379</td><td>Reactivo</td><td>Cargill Labs</td><td>Formulado a medida</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23 o 11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras cortantes ultrafinas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de perfusión serie RC 20</td><td>Herramienta</td><td>Warner Instruments</td><td>64-02222</td><td></td></tr><tr><td>Confocal de disco giratorio</td><td>Microscopio</td><td>Quorum Technologies</td><td>Quorum Wave FX</td><td>Montado en un microscopio invertido Leica DMI6000</td></tr></tbody></table>

visualizar el vivo drosophila gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Nuestro proyecto identificó GFP etiquetados estructuras gliales en la mosca en desarrollo larval sinapsis neuromuscular. Para ver el desarrollo de vida de la glía sinapsis nervio-músculo, hemos desarrollado una preparación de tejidos larvarios que tenían características de las larvas intactas en vivo, sino que también tenía buenas propiedades ópticas. Esta nueva preparación también se permitió el acceso de perfusates a la sinapsis. Hemos utilizado larvas de mosca, inmerso en la hemolinfa artificial, y se relajó sus contracciones rítmicas normales del cuerpo por el frío ellos. A continuación se diseca los segmentos posteriores de cada animal y con un alfiler de insectos contundente empujó la partes de la boca hacia atrás a través de la cavidad del cuerpo. Esta eversión de la pared cuerpo de la larva, como convertir un calcetín del revés. Hemos completado la disección con tijeras de disección ultra-fino y por lo tanto expuesto el lado visceral de los músculos de la pared del cuerpo. Las estructuras gliales en la UNM expresa GFP membrana dirigidos bajo el control de promotores específicos gliales. La membrana post-sináptica, la República Socialista Soviética (Reticula subsináptica) en el músculo expresado sinápticamente objetivo dsRed. Necesitábamos etiqueta agudamente la terminales de las neuronas motoras, la tercera parte de la sinapsis. Para ello se aplicaron anticuerpos primarios a HRP, conjugado con una emisión flurophore rojo lejano. Para probar las propiedades de la difusión de color en el espacio perisynaptic entre los terminales de las neuronas motoras y la SSR, se aplicó una solución de grandes moléculas de dextrano conjugado con flurophore emitiendo ahora de color rojo y las imágenes recogidas.

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Nuestro proyecto identificó estructuras gliales marcadas con GFP en la sinapsis neuromuscular de la larva de mosca en desarrollo. Para observar el desarrollo en vivo de la unidad glía-nervio-músculo...

Este procedimiento comienza preparando una larva de drosófila de manera que quede vuelta del revés para exponer la superficie de las células musculares de la pared corporal, así como las neuronas motoras y las células ggl asociadas, combinando la tinción fluorescente de terminales neuronales presinápticos, la expresión endógena de GFP y DS red dirigida a las membranas celulares gliales y musculares postsinápticas, y la visualización del espacio parasináptico mediante colorantes fluorescentes. De este modo, puede observarse claramente en una preparación viva los cambios estructurales que ocurren en la unión neuromuscular glial. Hola, soy D Brink en el laboratorio de ALS de Vanessa en el departamento de zoología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostraré una preparación de tejido y dos técnicas de marcado celular para obtener imágenes de tejido larval vivo de al mediante microscopía confocal.Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar las células gliales en la sinapsis neuromuscular. Ahora, para algo completamente diferente, la preparación de tejido de dentro hacia fuera comienza con la clasificación por etapas de las larvas. Este procedimiento se dem

visualizing-live-drosophila-glial-neuromuscular-junction-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Este protocolo describe la disección en vivo...

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Fuente: Guan, W., et. al. Visualiza Drosophila Axones de la neurona motora de la pierna a través de la cutícula adulta. J. vis. exp. (2018) Este video muestra imágenes de Drosophila patas con neuronas motoras fluorescentes verdes que expresan proteínas utilizando microscopía confocal. Un láser y dos detectores capturan la GFP y la autofluorescencia de la cutícula. Las imágenes se procesan dividiendo canales, restando la autofluorescencia y fusionándose en una imagen compuesta en color para...

Imágenes de neuronas motoras marcadas con fluorescencia en una pata adulta de Drosophila

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Aquí se describe un protocolo para visualizar la orientación axonal con una proteína fluorescente en piernas de adultos del Drosophila por fijación, montaje, proyección de imagen y la proyección de imagen de pasos.

Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Aprenda a visualizar sinapsis gliales en la unión neuromuscular de Drosophila mediante preparación de tejido invertido y tinciones fluorescentes. Este método permite estudiar interacciones celulares en tiempo real.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Explorar más videos