Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Este procedimiento comienza con la preparación de una larva de Drosophila de modo que se haya volteado al revés para exponer la pared del cuerpo, la superficie de las células musculares, las neuronas motoras asociadas y las células ggl mediante la combinación de tinción fluorescente para las terminales de las neuronas presinápticas, la expresión endógena de GFP y DS rojo, dirigida a las membranas de las células musculares gliales y postsinápticas y la visualización del espacio parasináptico Uso de tintes fluorescentes, Se puede observar una imagen clara de los cambios estructurales que ocurren en la unión neuromuscular glial en una preparación en vivo. Hola, soy D Brink en el laboratorio de ELA de Vanessa en la Universidad de Columbia Británica en el departamento de zoología. Hoy les mostraré una preparación de tejido y dos técnicas de marcaje celular para obtener imágenes de tejido de larvas vivas para microscopía confocal.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar las células gliales en la sinapsis del músculo nervioso. Así que ahora para algo completamente diferente, la preparación del tejido de adentro hacia afuera comienza con la estadificación de las larvas. Este procedimiento se demostrará en terceras larvas errantes porque son grandes y fáciles de diseccionar, use solo tres larvas que se arrastran activamente.

A continuación, limpie la superficie de las larvas con un pincel muy suave en una placa de Petri con agua bidestilada. La limpieza de las larvas es importante porque da como resultado una mejor óptica y también reduce las bacterias. Después de que se hayan limpiado las larvas, transfiéralas a una pequeña placa de Petri con tres mililitros de HL seis helada con cinco milimolares de glutamato.

Ponga el plato en hielo hasta que el animal deje de moverse y se relaje, lo que suele tardar unos dos minutos. Una vez que las larvas hayan dejado de moverse, puede comenzar la disección del tejido utilizando un microscopio de disección sosteniendo las tijeras de resorte en su mano dominante y las pinzas de punta muy fina. Por otro lado, haz un pequeño agujero en la pared del cuerpo con las tijeras para equilibrar la presión a través de la pared del cuerpo mientras sostienes al animal suavemente en el fondo del plato.

Con las pinzas, corte los dos segmentos posteriores, diseccione las vísceras. Es probable que parte del cuerpo graso salga de la cavidad corporal a través de la incisión. Corta también este tejido.

Continúe sosteniendo las larvas suavemente contra el fondo del plato con las pinzas finas. Con la otra mano, sostenga un alfiler de insecto con número cero de punta roma y empújelo contra las partes de la boca de las larvas. Empuja las partes de la boca a través de la cavidad corporal como si le dieras la vuelta a un calcetín con el puño.

El tejido de adentro hacia afuera debe verse así. Con las tijeras de resorte de disección ultrafinas, diseccione el cuerpo de grasa y las traqueosas de la pared del cuerpo. Retira la mayor cantidad de grasa corporal que puedas.

Esfuérzate mucho por no tirar de las traqueosas o desconectar el sistema nervioso. Rasgar las traqueosas hará agujeros en el músculo de la pared del cuerpo. Cuando hayas terminado la disección, el músculo debe estar translúcido y relajado, no opaco ni contraído.

Si pones el músculo en HL six sin glutamato a temperatura ambiente, es probable que se contraiga rítmicamente. Debido a que los generadores de patrones motores en el SNC están activos, la pared corporal intacta de adentro hacia afuera tiende a doblarse por la mitad a lo largo de las líneas medias dorsal y ventral. Por lo tanto, la preparación da un animal hemi izquierdo o derecho para visualizar.

Finalmente, monte el tejido en un portaobjetos de microscopio con una disposición de cubreobjetos puenteados. Los procedimientos para montar el tejido se mostrarán más adelante. Para comenzar a marcar los bastones neuronales, pipetee 30 microlitros de solución de anticuerpos primarios anti HRP marcados con fluorescencia en HL six y coloque una gota en una placa de Petri.

A continuación, sumerja la preparación de la pared del cuerpo del revés. En el baño de troquel. Es posible que vea el etiquetado de las terminales neuronales después de unos cinco minutos, pero incube durante 10 a 20 minutos para obtener una etiqueta completa y brillante.

Para enjuagar el exceso de etiqueta HRP, coloque el pañuelo en medio mililitro de HL seis durante 10 a 30 segundos a temperatura ambiente. El tinte no unido se enjuaga rápidamente, por lo que el ciclo de enjuague no necesita ser largo ni vigoroso. El tejido marcado ya está listo para ser montado y visualizado por microscopía.

Una variación del protocolo de marcaje de anticuerpos vivos que se acaba de mostrar es utilizar una dextrina conjugada con fluorescencia para resaltar los espacios extracelulares llenos de líquido. Para comenzar este procedimiento, diluya el colorante de dextrina conjugado con fluorescencia en HL seis a 0,001 miligramos por mililitro. Es posible que deba variar la concentración de dextrina si no le preocupa el momento exacto del eje di en el espacio extracelular.

Pipetee una gota de tinte de 20 microlitros en un cubreobjetos puenteado y transfiera la preparación de tejido al baño de tinte. Si no es necesario perfundir el tejido de adentro hacia afuera o si el volumen de HL six debe mantenerse pequeño, se puede montar en un portaobjetos de doble puente. Comience pegando dos cubreobjetos cuadrados de 18 milímetros en un portaobjetos de microscopio muy limpio.

Deje un espacio de dos milímetros entre los bordes de los cubreobjetos y centre el espacio. Más o menos en el centro de la diapositiva. Deje que el pegamento se seque por completo o formará una película sobre el medio acuoso alrededor de la preparación de tejidos.

A continuación, coloque una gota de 30 microlitros de HL six en el espacio entre los cubreobjetos. Coloque el pañuelo de adentro hacia afuera en la gota de HL six. Es posible que deba colocar el tejido en diagonal si la larva es grande y su sistema de adquisición de imágenes tiene una matriz de píxeles limitada.

Aplique una pequeña cantidad de vaselina en los bordes de un tercer cubreobjetos de 18 milímetros y colóquelo con el lado de la grasa hacia abajo sobre los dos cubreobjetos pegados sobre el pañuelo, presione suavemente. Estos son los resultados de nuestros dos métodos de marcaje fluorescente agudo de la preparación de larvas de adentro hacia afuera obtenidos con un microscopio confocal de disco giratorio. La primera es una imagen óptica de una sinapsis muscular del nervio glial con terminales Buton marcados con anti HRP en vivo.

En la superficie de la célula muscular, podemos ver terminales de tipo butón de neurona brillantemente etiquetados, pseudo coloreados en azul. En el centro de la pila de imágenes, encontramos extensiones gliales etiquetadas con GFP que se muestran en verde, así como bastones etiquetados con HRP en azul. Al rodear los bastóns, podemos ver secciones transversales de la bolsa como SSR, los submarinos, la retícula sináptica, que son de color rojo también en la mitad de la pila y en lo profundo de la pila están los DS rojos etiquetados como SSR.

Las SSR son las regiones sinápticas especializadas de la célula muscular. Los bns anidan dentro de las bolsas en las células musculares, al igual que algunas partes de las extensiones gliales verdes. Las extensiones de las células gliales se intercalan alrededor de la BNS y la SSR, pero no cubren la superficie de la sinapsis como una manta en las capas más profundas de la pila.

Encontramos extensiones gliales verdes y el SSR rojo, pero no tantos de los terminales buton. También podemos encontrar secciones transversales del nervio motor que inerva el músculo. Las células gliales envuelven el nervio motor, por lo que también es verde.

El segundo resultado del marcaje fluorescente agudo de la preparación larvaria de adentro hacia afuera es la sinapsis marcada con dextrina fluorescente. Aquí, el líquido en el espacio sináptico paras o hendidura sináptica se etiqueta como rojo. En las capas superficiales de la imagen de la pila óptica, hay una capa fluida de tinte rojo de dextrina, y se puede ver dónde se acumula en las depresiones onduladas de la membrana plasmática muscular.

En las capas más profundas de la pila, el tinte fluorescente de dextrina se ha filtrado en las hendiduras sinápticas, se forman pequeños anillos en forma de rosquilla de tinte de piscina entre los terminales de las neuronas y las bolsas SSR etiquetadas en azul. Esta es la hendidura sináptica resaltada con tinte. La lámina glial verde no bloquea la penetración del tinte en la hendidura en las capas más profundas de la pila de imágenes.

Las características más prominentes son la SSR o región sináptica del músculo marcada en azul, y las extensiones gliales planas que son verdes. Del mismo modo, la vaina glial alrededor de los desconcertantes axones que se ven en las capas profundas es verde. La vaina glial parece excluir el colorante de dextrina.

Acabo de mostrarles una forma novedosa de visualizar la sinapsis muscular del nervio glial en una preparación de tejido de adentro hacia afuera de larvas de Drosophila. Al preparar el tejido, es importante recordar que debe esforzarse por manipular el tejido con cuidado y asegurarse de que el músculo esté relajado y que los nervios periféricos no se dañen. Me gustaría concluir con una cita de Marx.

El tiempo vuela como una flecha. El miedo vuela como un plátano.