Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Se coloca un cubreobjetos recubierto con sågol, elaborado untando una gota de sågol sobre el vidrio y dejándolo curar durante la noche, en la cavidad circular de la cámara de registro prefabricada y se cubre con solución de registro. Se coloca un gusano en el centro y se adhiere a la superficie del soporte comenzando por la cabeza o la cola, aplicando pegamento sobre el lado dorsal del gusano mediante una pipeta de pegamento. Una vez finalizada la adhesión, se realiza una incisión adyacente a la vulva en la interfase entre la cutícula y el pegamento, utilizando una aguja de vidrio, y se extiende hacia la cabeza tras la extracción de las vísceras y los huevos de la cavidad corporal.

El borde cortado de la incisión se suelda puntualmente con el adhesivo al sogar, exponiendo el nervio ventral y los músculos de la pared corporal. Se realiza un registro de parche en el músculo ventral medial anterior a la vulva y se coloca el electrodo estimulante aguas arriba en la cuerda nerviosa. Hola, soy Janet Richmond, profesora asociada en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Illinois en Chicago.

Hoy les voy a mostrar una técnica de disección que nos permite exponer las uniones neuromusculares del erizo de mar. Para la grabación electrofisiológica. Utilizamos este preparado para estudiar la transmisión sináptica.

De acuerdo, comencemos. Antes de trabajar con los nematodos, se debe elaborar cierto material al menos un día antes del procedimiento. Una cámara de grabación para disección, cubreobjetos de vidrio recubiertos con guardia S, pipetas viejas, un aplicador de pegamento y una pipeta de extracción.

Comience por construir la cámara. Corte una lámina de plexiglás de un dieciseisavo de pulgada de grosor para que coincida con la platina del microscopio. Utilizada para realizar las grabaciones en el centro del plexiglás.

Perfore un orificio circular lo suficientemente grande como para alojar un cubreobjetos circular de 22 milímetros de diámetro. Fije un cubreobjetos de 48 por 60 milímetros al lado inferior de la cámara, debajo del orificio, utilizando un pequeño trozo de cera para inclusión de tejidos de punto de fusión bajo en cada esquina del cubreobjetos. La cera se derrite rápidamente en una placa calefactora, dejando una capa delgada de cera entre el plexiglás y el cubreobjetos tras enfriarse; recorte cualquier exceso de cera con una hoja.

El cubreobjetos que encaja en la cámara es un cubreobjetos recubierto de 22 milímetros tipo S guard. Para que el sard funcione, debe prepararse fresco siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez preparado, se coloca una pequeña gota de sard sobre cada cubreobjetos y se extiende con una cuchilla para obtener una superficie uniforme.

Las laminillas recubiertas se colocan luego en recipientes tapados y se introducen en un horno a 65 grados Celsius durante la noche para su curado. Mañana estarán listas para la disección a lo largo del protocolo. Se requieren pipetas de vidrio de silicato con un diámetro externo de un milímetro, estiradas hasta una punta que tenga una resistencia de aproximadamente cuatro megaohmios, por lo que es recomendable mantener un frasco disponible.

Consulte el vídeo de publicación de JoVE sobre la elaboración de parches, pipetas y electrodos afilados con un micropipeteador programable por Miriam Goodman. Para los detalles técnicos del registro de electrofisiología, el nematodo debe ser pegado en su lugar. Y para ello, se requiere un aplicador de pegamento.

El aplicador de pegamento es simplemente un tubo de plástico de dos milímetros con un diámetro interno de un milímetro. Un extremo del tubo se sostendrá con la boca. Puede estar equipado con una boquilla, y el otro extremo del tubo sujetará una pipeta de un milímetro que estará llena de pegamento.

También se utiliza una pipeta de extracción especializada durante la disección. Esta está hecha de un tubo y una pipeta, al igual que el aplicador de pegamento, excepto que la punta de la pipeta está ligeramente quebrada hacia atrás para acomodar los huevos y la víscera. Comience trazando una línea de cera a lo largo del perímetro de la cámara.

Ahora presione y coloque un cubreobjetos recubierto con S guard syl guard hacia arriba. La línea de cera inmoviliza el cubreobjetos y evita que la solución de registro se filtre por debajo y desplace el cubreobjetos durante la disección y la grabación. Luego, la cámara se llena con solución extracelular de registro. Lea el texto adjunto para la formulación con la cámara preparada.

Utilice un pincel para nematodos para colocar varios nematodos en la solución. Con práctica, los nematodos nadadores pueden ser pegados sin procedimientos adicionales para prevenir el movimiento. Cargue un recipiente para pegamento, fabricado a partir de una tapa de PCR sostenida en cera o arcilla modelable, con un stock de trabajo del pegamento acrílico Sano para trabajar con el pegamento.

Termine de construir el aplicador de adhesivo sujetando su pipeta de registro al extremo del aplicador. Luego, bajo el microscopio de disección, llene el aplicador de adhesivo mediante succión bucal. Adherir el adhesivo a un nematodo es complicado y requiere práctica, ya que el adhesivo se polimeriza al contacto con la solución extracelular de registro.

Para remediar esto, mantenga un flujo constante hacia afuera del pegamento, ya que de lo contrario se endurecerá y obstruirá la pipeta. Si la pipeta se obstruye, a veces puede desobstruirse golpeando suavemente la punta sobre el cubreobjetos. Practique el manejo del pegamento.

Y cuando pueda escribir su nombre con pegamento sobre la superficie de sil, probablemente esté listo para pegar la cutícula del nematodo y fijar un nematodo. Primero, elija uno cerca del centro de la cámara donde haya espacio para operar. Segundo, coloque una pequeña cantidad de pegamento en la cabeza o en la cola del nematodo y deslícelo rápidamente sobre la superficie de la sil guard.

Luego, aplique un hilo de pegamento a lo largo del borde dorsal del cutículo de los nematodos. Esto fuerza al nematodo a adoptar una posición en C con la vulva orientada hacia adentro. Cualquier espacio en esta línea de pegamento debe rellenarse para lograr una adhesión máxima entre el nematodo y el syl guard.

Este es un proceso complicado y puede ser útil practicar con mutantes hipomóviles. Como en el 31, hay un bulbo justo allí, a la derecha. Ahora voy a mover esta preparación y luego introduciré la aguja de vidrio y comenzaré a hacer la incisión. Para realizar la incisión en la cutícula, cambie a una pipeta de disección manual.

Esta pipeta debe ser más afilada que las pipetas utilizadas para grabar el pegamento y debe tener un vástago corto y resistente, utilizando el aumento más alto. En el microscopio estereoscópico, alinee la pipeta paralela al eje longitudinal del nematodo e inserte la punta cerca de la vulva, en la interfaz entre el cutícula y el pegamento. Esta incisión libera la presión hidrostática del nematodo, haciendo que los huevos y los intestinos salgan a través del punto de incisión.

Continúe cortando la cutícula hacia la cabeza del nematodo con un movimiento de corte similar al de abrir una carta hasta llegar a la faringe. Ahora cambie a la pipeta de extracción para aspirar los órganos internos del nematodo. Después de limpiar la incisión, la cutícula abierta conservará su forma cilíndrica.

A continuación, tome una pipeta nueva para pegar. Úsela para soldar puntualmente la cutícula en el borde de la incisión sobre la superficie del protector de syl. Es importante utilizar cantidades mínimas de pegamento en esta etapa para evitar dañar u oscurecer los njs.

El cordón nervioso ventral y los músculos de la pared corporal ya están expuestos, pero aún debe eliminarse la membrana basal que recubre la JM. Para ello, aspire la solución de registro extracelular de la cámara y aplique una solución de registro extracelular con 0,4 miligramos por mililitro de colagenasa. Después de 10 a 20 segundos, retire la colagenasa y lave el preparado varias veces con solución de registro fresca.

El nematodo ya está listo para las grabaciones electrofisiológicas. En la posición de la junta neuromuscular, coloque la cámara de registro sobre la platina de un microscopio invertido utilizando un objetivo de 10 aumentos para centrar el nematodo; luego cambie a un objetivo de inmersión en agua de 40 aumentos con óptica DIC y verifique que los músculos de la pared corporal y la cuerda nerviosa estén intactos. Posicione al nematodo horizontalmente para que los electrodos puedan introducirse desde ambos lados, izquierdo y derecho.

Normalmente, realizamos el parche en el cuerpo medial ventral junto con los músculos internos a la vulva, aunque los músculos tanto en el lado dorsal como en el ventral del gusano pueden parchearse fácilmente junto con un par de neuronas que parecen semicírculos apoyados contra el músculo. A continuación, realice el parche del músculo utilizando técnicas estándar de parche en modo sellado para obtener un sello en el rango de gigohmios. En nuestra experiencia, los electrodos de registro con una resistencia de aproximadamente cuatro megohmios funcionan bien en el modo de registro de bloqueo de voltaje en celda completa.

Aplique más succión y active el impulso eléctrico en la membrana hasta que se rompa el sello gigaseal. Entonces hablamos de tener una resistencia de cuatro megaohmios. Así que si observa allí, sí, indica 4,9 megas.

Es más grande, normal. Está dentro del rango que utilizamos. Vale. Sí. Ahora vamos a intentar hacerlo grande, entonces, ¿qué?

¿Qué? Queremos que baje completamente. Sí. Entendido. ¡Sí!

En una grabación adecuada, los músculos de la pared corporal de nematodos adultos de tipo silvestre suelen tener una capacitancia de membrana celular de aproximadamente 70 picofaradios y pueden registrarse de forma estable durante al menos 10 minutos a un potencial de reposo de -60 milivoltios con corrientes de mantenimiento mínimas, aproximadamente 50 picoamperios. Una vez que se ha realizado el parche en una célula muscular, la estimulación mediante un segundo electrodo, la activación por luz de un canal Rodin o la adición de una solución hiperosmótica generarán todas respuestas medibles. Para provocar una respuesta evocada eléctricamente, normalmente colocamos un electrodo estimulante que contiene solución extracelular sobre el cordón nervioso ventral, en la parte interna respecto a la célula muscular parcheada.

Esta configuración de parche suelto requiere pulsos de corriente de uno a dos milisegundos entre 10 y 40 voltios. Desafortunadamente, tras unas pocas respuestas evocadas, el cordón nervioso queda irreversiblemente dañado y, por razones desconocidas, solo pueden obtenerse respuestas evocadas colinérgicas utilizando esta configuración. Alternativamente, se pueden utilizar nematodos que expresan un canal activado por la luz, donde el transgén dosin en diferentes poblaciones neuronales puede emplearse para provocar la liberación.

Como preparación para este método, tenga en cuenta que los nematodos utilizados para esta aplicación deben cultivarse en bacterias enriquecidas con retinol. En esta preparación, se utiliza un LED de 470 nanómetros de alta potencia filtrado a través de un filtro de excitación GFP de 450 a 490 nanómetros para activar repetidamente la opsina del canal, provocando la liberación inducida de diferentes neurotransmisores dependiendo de los tipos celulares que expresen el canal. La última técnica a revisar puede emplearse para medir el tamaño del grupo de vesículas sinápticas fácilmente liberables procedentes de varias neuronas hacia el músculo registrado.

Esto se logra aplicando pulsos de presión de una solución extracelular hiperosmótica sobre el músculo en parche durante uno a tres segundos. El resultado será una ráfaga de eventos postsinápticos asincrónicos. Se muestran grabaciones del músculo de la pared corporal en configuración de voltaje en todo el célula, correspondientes a cada uno de los tres protocolos de estimulación descritos anteriormente: respuestas evocadas eléctricamente, evocadas por luz y por hiperosmolaridad.

En todos los casos, el músculo de la pared corporal media ventral se mantiene fijado a menos 60 milivoltios. Las células musculares de tipo silvestre suelen presentar altas tasas de corrientes sinápticas miniatura endógenas entrantes. En nuestras soluciones estándar de registro, una despolarización de dos milisegundos del cordón nervioso ventral anterior provoca una liberación sincrónica de varias sinapsis, lo que resulta en una respuesta evocada grande de alrededor de dos a 2,5 nanoamperios.

En gusanos de tipo salvaje, los trazos representativos a la derecha de los trazos de tipo salvaje en A y B muestran la liberación sináptica en un mutante gravemente descoordinado; en el panel C de 18 se muestra una respuesta evocada por luz en la unión neuromuscular de un gusano de tipo salvaje que expresa canal rojo dosin. En neuronas colinérgicas, un pulso de luz de dos milisegundos típicamente produce una respuesta de 1,5 a 1,8 nanoamperios. La eyección por presión de salino hiperosmótico de 850 mOsm durante un segundo sobre el músculo produce una ráfaga asincrónica de corrientes sinápticas miniatura que representa el grupo de vesículas fácilmente liberable.

Acabo de mostrarle la técnica de disección que utilizamos para exponer las uniones neuromusculares de la *Aplysia californica* y realizar grabaciones electrofisiológicas. Es importante recordar que esta técnica es difícil y probablemente le tome meses perfeccionarla. Sin embargo, una vez adquirida, es como montar en bicicleta.

Las técnicas permanecerán contigo, y cuanto más las practiques, la preparación será más rápida y confiable. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.