Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Bueno, lo que realmente es único del ensayo Teer es que te permite visualizar directamente las células T específicas de antígenos. El te, el teer es el aspecto único principal de nuestro ensayo. Eso va acompañado de un paso de amplificación que hacemos.

Aislamos las células T y luego las cultivamos en un entorno que enriquece la muestra para las células T que nos interesan. Luego podemos etiquetar específicamente solo esas células y visualizarlas en un citómetro de flujo. Así que con ensayos anteriores, como el CSFE o los ensayos de proliferación que llevan décadas en circulación, lo que obtienes es una especie de medición global de lo que ocurre con toda la población de células T.

Pero tienes millones de células T en el cuerpo y ven un conjunto completamente diverso de patrones. Si tienes suerte, quizá una de cada dos a 300.000 células de las células de la muestra será la que estés mirando. Y por eso este ensayo realiza esos pasos de enriquecimiento.

Y luego, con un número de prueba, y como estás teñiendo directamente, puedes visualizar fuera del fondo una población que representa menos del 1% del total de células. Así que puedes ver diferencias muy, muy pequeñas y puedes obtener un recuento bastante preciso del número de células T que hay en esa muestra de sangre, ya sabes, que están en ese individuo y que reconocen tu patrón de interés. Pero no termina ahí, porque los teters también permiten no solo etiquetar esas células T, sino aislarlas para un análisis posterior.

Y los teers que usas en realidad se fabrican aquí en BRI, ¿es correcto? Sí. Somos uno de los pocos laboratorios en el país que han conseguido alcanzar los teers de clase dos. Nuestra intención es distribuir estos reactivos a costa a cualquier laboratorio interesado en importar esta tecnología.

¿Cuáles diría que son los aspectos más difíciles o desafiantes de este ensayo a la hora de replicarlo en otros laboratorios? Bueno, pensándolo bien, en realidad hay dos, el crecimiento de las células T. Es algo que realmente es un poco un arte.

Casi a diario tienes decisiones sobre si las células necesitan nutrientes adicionales o espacio adicional para crecer. Y luego la segunda parte, que creo que probablemente es la más difícil para un inexperto de operar, es en realidad el análisis de datos. Es como averiguar qué parte de la señal es realmente una respuesta positiva y cuál es simplemente inherente a, ya sabes, la física y la atracción.

Y el hecho de que todo tenga cierto grado de pegajosidad es algo que, de nuevo, requiere mucha experiencia, especialmente en contextos donde la respuesta general va a ser un poco débil. ¿Cómo puede beneficiar a los pacientes la información que generarás con este ensayo en este momento? Una de las primeras características que aparece en cualquier paciente autoinmune es una especie de constelación de anticuerpos específicos para esa enfermedad.

Sabemos, por los fundamentos fundamentales de la inmunología, que donde hay una respuesta de anticuerpos, siempre hay primero una respuesta de células T. Así que si pudiéramos observar en individuos en riesgo y ver ese aumento en la actividad de las células T que precedería a la formación de anticuerpos, eso nos ayudaría a definir realmente un nuevo nivel de riesgo o que los individuos se dirijan hacia tener autoanticuerpos, lo que, con suerte, abriría una ventana para terapias interventivas. Este procedimiento purificará y expandirá las células T CD 4 positivas específicas de antígenos y las visualizará utilizando reactivos teters y equipos de bioseguridad de flujo laminar clase dos.

Este será el espacio de trabajo principal para el procedimiento. Tubo primario cónico de 50 mililitros para aislamiento PBMC, un XPBS. Este debe ser un paquete de fol libre de calcio y magnesio y envuelto en papel de aluminio para protegerlo de los bidones de aerosol CoStar de 10 mil con insertos de 50 mil, usados para evitar la contaminación sanguínea de la centrifugadora.

Pipetas de transferencia de centrifugadoras GS seis R, pipetas Pasteur con tampón hemolítico que contiene 8,3 gramos por litro. Cloruro de amonio 1,0 gramos por litro. Bicarbonato de sodio 0,04 gramos por litro DI EDTA sódico, trian blue solución 0,2% en PBS HEMOCITÓMETRO 15 mililitros tubo cónico que contiene PBS suplementado con dos milimolares EDTA más cinco gramos por litro.

Kit de aislamiento BSA max CD cuatro dos comprado en Milin biotech EP magnet block adquirido a stem cell technologies. Otras plataformas de enriquecimiento de células magnéticas podrían usarse con la misma eficacia. Tubo de polipropileno de cinco mililitros RPMI 1640 suplementado con 25 milimolares hippies usados para fabricar suero humano agrupado de medio T para suplementar la tira de pluma del medio T-cellular usada para complementar el medio T-cellular 500 mililitros filtro de botella de 0,22 micras estéril de 48 pozos para cultivo de expansión in vitro, incubadora de CO2 paso 37 grados, solución de 20 miligramos por mililitro de péptido sintético que contiene el epítopo de interés.

Tubo de fax de cinco mililitros cargado con tubo de fax de clase dos teer utilizado para visualizar células T específicas de antígenos, anticuerpos antiCD tres, anti CD cuatro y antiCD 25 usados para recubrir células T específicas de antígenos. Fax citómetro de flujo de calibre o equivalente antes de comenzar el procedimiento. Reúne todos los materiales y equipos en tu espacio de trabajo.

La siguiente demostración cubrirá los siguientes pasos. Aislamiento de PBMC, separación positiva de células T de CD cuatro en cultivo de expansión in vitro visualizando células T mediante teem o tinción. Paso uno aislamiento de PBMC.

Toma una muestra de sangre. La sangre debe recogerse en jeringuillas o tubos y anticoagularse con heparina en una proporción de uno a 50 para evitar la coagulación; se espera un rendimiento de aproximadamente 1 millón de PBMC por mililitro de sangre. Aproximadamente el 40% de ellos serán células T CD cuatro positivas.

Alicuelta la sangre en tubos cónicos de 50 mililitros. 25 mililitros de sangre por tubo. Mezcla suavemente la sangre antes de la coagulación de la ALI para distribuir el plasma.

Añade PBS elevando el volumen total a 40 mililitros y aplica la capa secando 11 mililitros de fial insertándolos en el tubo de sangre y retirando cuidadosamente la ayuda de la pipeta. El fial drenará lentamente hacia la parte inferior del tubo. Una vez que el nivel se ha igualado, retira lentamente la pipeta del tubo de sangre y desecha la tapa de los tubos de sangre y pasa al aerosol de los botes.

Cierra firmemente los botes y centrifuga a 900 veces G durante 20 minutos sin pausa. Es fundamental que no se aplique ninguna ruptura al final de este giro, ya que la fuerza de ruptura alterará la capa de celdas tras el giro. El PBMC debe formar una capa blanca distinta entre el plasma amarillo superior y el fial transparente inferior.

Retira suavemente la capa de glóbulos blancos usando una pipeta de transferencia y transfiere a un tubo nuevo. Parte del plasma y del fial pueden ser extraídos con el PBMC, pero evita extraer la capa de glóbulos rojos. Normalmente, en este paso se pueden combinar dos tubos sanguíneos en un solo tubo celular.

Para aumentar el tamaño de la bola, añade PBS que eleva el volumen total a 15 mililitros y centrifuga a 500 veces G durante 15 minutos en rotura baja y aspira el líquido en aerosol de los botes usando una pipeta de pasta, cuidando de no molestar la bola. Trata con un buffer hemolítico añadiendo de cinco a seis mililitros a cada tubo y mezclando suavemente para eliminar grumos. Incubar no más de cinco minutos.

Añade PBS que lleva el volumen total a 50 mililitros y centrifuga a 230 veces G durante 10 minutos. En los botes de aerosol de bajo roto ya no son necesarios para estos giros lentos. Lava dos veces el líquido aspirado usando un tubo lleno de pipeta de pasto con PBS y centrifuga a 230 veces G durante 10 minutos antes del paso final de lavado, retira una cuota de células resuspendidas, diluye con azul trian y cuenta usando un hemorcitometro.

Este recuento de celdas determinará los volúmenes de reactivos utilizados en la separación de las células T. Paso dos, CD cuatro separación positiva de células T, aspirar líquido y añadir un tampón en funcionamiento para elevar el volumen total a 40 microlitros por cada 10 millones de celdas. Normalmente esto requiere 30 microlitros de tampón más el volumen residual de pellets.

Transfiere este volumen a un tubo cónico de 15 mililitros. Añade cóctel de anticuerpos de los cuatro kits de aislamiento del CD, 10 microlitros por tubo de 10 millones de células y ponlo en hielo durante 10 minutos. Quita el tubo del hielo, quita la tapa y añade 30 microlitros de buffer en funcionamiento por cada 10 millones de celdas.

Añade cuentas magnéticas del kit de aislamiento CD cuatro. 20 microlitros por cada 10 millones de celdas tapa el tubo y ponlo en hielo durante 15 minutos. Añade 10 volúmenes de buffer en funcionamiento para lavar y centrifugar a 230 veces G durante 10 minutos.

Durante el centrifugado, coloca el imán y el tubo de polipropileno de cinco mililitros en tu espacio de trabajo. Aspira líquido de pellets celulares. Añade dos mililitros de buffer y elimina grumos usando una pipeta de transferencia.

Utilizando la misma pipeta de transferencia, las pilas de transferencia se instalan en el tubo de cinco mililitros e incuban en el imán durante 15 minutos. Decanta cuidadosamente la fracción de células T de cuatro CDs positivo en un tubo marcado de 15 mil, invirtiendo el imán y vaciando todo excepto la última gota. Añade otros dos mililitros de buffer de funcionamiento al tubo de cinco mililitros y sácala del imán.

Enjuaga suavemente las cuatro células negativas de CD de los lados del tubo y transfírelas a un tubo marcado de 15 mil. Añade dos mililitros de medio de células T a cada tubo. Quita las alicuotas para contar células y centrifuga a 230 veces G durante 10 minutos.

Diluye las alicotas celulares con azul de trian y cuenta usando un hemocitómetro. Estos conteos celulares determinarán el número de pozos utilizados para el cultivo de expansión. Paso tres.

En cultivo de expansión in vitro aspira líquido de los pellets celulares CD cuatro positivos y CD cuatro negativos según el recuento celular. Añade medios a las cuatro celdas positivas de CD para ajustar el volumen a 3 millones de celdas por mil. Añade medios a las cuatro celdas negativas de CD para ajustar el volumen a 10 millones de celdas por mil.

El cultivo de expansión requiere 3 millones de celdas CD cuatro negativas por pozo y de dos a 3 millones de celdas CD cuatro positivas por pozo. Normalmente, las células CD4 positivas son la población limitante. Alícuota CD cuatro celdas negativas en el número adecuado de pozos en una placa de 48 pozos.

Añadiendo 300 microlitros a cada uno, coloca la placa en una incubadora a 37 grados durante una hora. Retira la placa, la incubadora, lava los pozos añadiendo 500 microlitros de medio fresco y pipetea suavemente de 12 a 20 veces con una pipeta de transferencia y retira todo el líquido. Este lavado dejará una capa de células adherentes presentadoras de antígenos.

Cuando termine de lavar, añade solo el medio suficiente para humedecer el fondo de cada uno, bueno, unos 100 microlitros. De lo contrario, las células adherentes a A se secarán. Si es necesario, añade de dos a tres millones de células de CD y cuatro células positivas a cada pozo.

Añade medios adicionales para elevar el volumen total en cada pozo hasta un mililitro. Añade el péptido deseado a cada uno. Pozo. La concentración típica para la estimulación es de 10 microgramos por mililitro.

Placar el puesto final en una incubadora a 37 grados durante siete días. Después de siete días. Añade 50 microlitros de hemo-IL, dos en cada pozo cada día siguiente.

Monitorizar el crecimiento celular usando un microscopio de pozos de alimentación que aún no están en confluencia eliminando la mitad del medio, añadiendo medios frescos y 50 microlitros de IL, dos pozos confluentes divididos suspendiendo de nuevo las células y moviendo la mitad de las células a un pozo vacío. Añadiendo medios frescos y 50 microlitros de células de retorno IL dos a la incubadora. Las células en expansión estarán listas para la tinción con teer tras 13 a 15 días de cultivo.

Paso cuatro, visualizar las células T mediante la tinción del teer, comprar o montar teters para que coincidan con el péptido. Combinaciones de MHC utilizadas para estimular las células T CD cuatro positivas. Quita la placa de la incubadora.

Extrae cuidadosamente la mitad del material de cada uno. Un pozo transfiere una alitería de células de cada pozo, normalmente 75 microlitros o unos 50.000 celdas, a un tubo de poliestireno de cinco mililitros, añade un microlitro típicamente un microlitro por cada 50 microlitros de volumen total y lo coloca en una incubadora de 37 grados durante una hora. También es recomendable teñir una segunda alicota de cada pozo con un teer desajustado como células de control negativas con anticuerpos antiCD tres, anti CD cuatro y antiCD 25.

Se pueden utilizar marcadores de anticuerpos adicionales u alternativos. Sin embargo, no utilice anticuerpos marcados con PE, ya que este canal debe reservarse para los teems en este momento. Además, etiqueta cualquier color o control de isotipo con celdas adicionales.

Incubar las células marcadas por anticuerpos durante 15 a 30 minutos a cuatro grados. Lava cada tubo con 0,5 a un mililitro de tampón de funcionamiento y centrifuga a 230 veces G durante 10 minutos. Decantar cuidadosamente líquido de los tubos de fax, calibrar el citómetro de flujo usando perlas de referencia, tubos de control de color único, controles de isotipo, etcétera.

Analiza cada tubo usando el citómetro de flujo. Las células tetrapositivos deberían ser una población distinta entre las células T CD cuatro ampliadas. Las células tetrapositivas suelen ser CD25 positivas y a menudo CD 4 alto.