Name: Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Aprende a purificar y expandir células T CD4+ específicas de antígeno desde sangre periférica y visualizarlas con tetrámeros de MHC clase II mediante citometría de flujo.

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Agradecemos a Dick Foley y Kimball Leigh por su papel clave en la filmación y producción de vídeo.

1. Sangre periférica de células mononucleares (PBMC) de aislamiento <ol><li> Obtener una muestra de sangre - la sangre deben ser recogidas en jeringas o tubos de sangre y anticoagulada con heparina (1:50 ratio) para prevenir la coagulación. Esperar un rendimiento de alrededor de 1 × 10 6 PBMC por ml de sangre - aproximadamente el 40% de los cuales se CD4 positivos (CD4 +) las células T. </li><li> Alícuota de la sangre en tubos de 50 ml cónico de 25 ml por tubo. Si la sangre se ha separado, mezcle suavemente antes de alícuotas para la distribución del plasma </li><li> Añadir PBS, con lo que el volumen total de 40 ml y subyace en la elaboración de 11 ml de Ficoll, la inserción en el tubo de sangre y, con cuidado de retirar la ayuda de una pipeta la pipeta. El Ficoll lentamente de drenaje en el fondo del tubo. Una vez que el nivel se ha igualado, retire lentamente la pipeta del tubo de sangre y desechar. </li><li> Tape los tubos de sangre y pasar a los botes Aerosolve. Cierre bien los recipientes y se centrifuga a 900 × g durante 20 minutos - sin freno. Es muy importante que no freno se aplica al final de este giro en la fuerza de frenado se perturbe la capa de células. </li><li> Después de la vuelta, el PBMCs debe formar una capa distinta en blanco entre el plasma amarillo (arriba) y Ficoll transparente (abajo). Suavemente quítele la capa de glóbulos blancos con una pipeta de transferencia y traslado al nuevo tubo. Algunos de plasma y Ficoll puede ser elaborado con la PBMCs, pero no llamar a ninguno de la capa de células rojas. Suele ser de dos tubos de sangre se pueden combinar en un tubo de células en este paso para aumentar el tamaño de las pastillas. </li><li> Añadir PBS, con lo que el volumen total de 50 ml y centrifugar a 500 xg durante 15 minutos - de frenos baja en botes aerosolve. </li><li> Aspirar el contenido con una pipeta Pasteur, con cuidado de no perturbar el sedimento </li><li> Tratar con tampón hemolítica mediante la adición de 6.5 ml a cada tubo y mezclar suavemente para eliminar grumos. Incubar durante no más de 5 minutos. </li><li> Añadir PBS, con lo que el volumen total de 50 ml y centrifugar a 230 × g durante 10 minutos - de frenos baja. Botes Aerosolve ya no son necesarios para estos giros más lentos. </li><li> Lavar dos veces: líquido aspirado con una pipeta Pasteur, llenar el tubo con PBS y centrifugar a 230 g durante 10 minutos. </li><li> Antes de la etapa de lavado final, retirar una alícuota de volver a suspender las células, diluir con azul de tripano, y contar con un hemocitómetro. Este recuento de células determinará el volumen de reactivo utilizado en la etapa de separación de células T. </li></ol> 2. De células CD4 + T * separación <ol><li> Aspirar el contenido y añadir tampón de que el volumen total de hasta 40 uL por 10 millones de células. Por lo general, esto requiere de 30 uL de buffer, más el volumen residual de pellets. </li><li> La transferencia de este volumen a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir un cóctel de anticuerpos de los kit de aislamiento de células CD4 - 10 uL por 10 millones de células, el tubo de la tapa y colocar en hielo durante 10 minutos </li><li> Retire el tubo de hielo, retire la tapa y agregar 30 uL de funcionamiento de amortiguación por 10 millones de células </li><li> Añadir partículas magnéticas en el kit de aislamiento de células CD4 - 20 uL por 10 millones de células, el tubo de la tapa y colocar en hielo durante 15 minutos </li><li> Añadir diez volúmenes de funcionamiento de amortiguación para lavar y centrifugar a 230 g durante 10 minutos. </li><li> Durante el giro, coloque el imán y el tubo de 5 ml de polipropileno en su espacio de trabajo </li><li> Aspirar el contenido de sedimento de células, añadir 2 ml de tampón de funcionamiento y eliminar grupos utilizando una pipeta de transferencia </li><li> Usando la pipeta de transferencia misma, la transferencia de células en el tubo de 5 ml y se incuba en el imán durante 15 minutos </li><li> Decantar cuidadosamente el recuento de CD4 + fracción de células en un tubo de 15 ml marcada por la inversión del imán y el vaciado de todos, pero la última gota </li><li> Añadir otros 2 ml de funcionamiento de amortiguación en el tubo de 5 ml y retirar del imán </li><li> Enjuague suavemente las células CD4-células de los lados del tubo y la transferencia a un tubo de 15 ml marca </li><li> Añadir 2 ml de medio de las células T a cada tubo, retire alícuotas para el recuento de células y se centrifuga a 230 × g durante 10 minutos. </li><li> Diluir alícuotas de células con azul tripán y contar con un hemocitómetro. Estos recuentos de células determinará el número de pozos utilizados para el paso de la cultura de expansión. </li></ol> * Por otra parte, las columnas de MACS y los granos (Miltenyi Biotec), el separador celular AutoMACS (Miltenyi Biotec), o un separador de células Robosep (Tecnologías de células madre) se puede utilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante en lugar de los pasos 2,2 hasta 2,11. 3. En la cultura de expansión in vitro <ol><li> Aspirar el contenido de las células CD4 + y CD4-células pellets y, en base a los recuentos de células, añadir los medios de cultivo (por lo general 3 millones de células CD4 + por ml y 10 millones de células CD4-células por ml funciona bien para la creación de la cultura). La cultura de expansión requiere 3-5 million CD4-células por pocillo y 2-3 million CD4 + células por pocillo en un volumen total de 1 ml de medio cultivo en una placa de cultivo de 48 también. Normalmente, las células CD4 + son la población límite </li><li> Si lo desea, irradian las células CD4-células (5000 Rad s). Alícuota de células CD4 en la cantidad adecuada de los pozos de una placa de 48 y mediante la adición de 300 a 500 l de cada uno. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora. El adherente células CD4-servirá como células presentadoras de antígeno en la cultura de expansión. </li><li> Retirar la placa de la incubadora. </li><li> Lavar los pocillos añadiendo 500 l de medio fresco y suavemente pipeteando arriba y abajo 12-20 veces usando una pipeta de transferencia y la eliminación de todo el líquido. Este lavado se dejan atrás una capa de células adherentes presentar antígeno. </li><li> Cuando la limpieza se completa, agregar los medios de comunicación sólo lo suficiente para mojar la parte inferior de cada bien (alrededor de 100 uL) - de lo contrario las células adherentes se seca </li><li> Añadir 2-3 million células CD4 + a cada pocillo. Si es necesario, añadir medios adicionales para llevar el volumen total en cada pozo de hasta 1 ml. </li><li> Añadir el péptido deseado a cada pocillo. La concentración típica de estimulación es de 10 ug / ml final. </li><li> Coloque la placa en una incubadora a 37 ° C durante 7 días. </li><li> Después de 7 días, se añaden 50 uL de Hemogen IL-2 (o su equivalente, como la IL-2, 10 UI / mL) a cada pocillo. </li><li> En cada día subsiguiente, controlar el crecimiento de células utilizando un microscopio. Alimentar a los pozos que todavía no están confluentes mediante la eliminación de la mitad de los medios de comunicación, añadiendo medio fresco y 50 uL de IL-2. Dividir pozos confluentes por resuspensión de las células, pasando la mitad de las células de un pozo vacío, la adición de medio fresco y 50 uL de IL-2. Volver a las células de la incubadora. </li><li> Las células de expansión estará listo para el tetrámero después de 13-15 días de cultivo. </li></ol> 4. Visualizar las células T mediante la tinción tetrámero <ol><li> Compra o montar tetrámeros para que coincida con las combinaciones de péptido / MHC que coinciden con los CD4 + células T estimuladas (ver la discusión de las fuentes de reactivos tetrámero). Tetrámeros debe ser ~ 0,5 mg / ml de solución. </li><li> Retire la placa de la incubadora </li><li> Con cuidado, extraiga la mitad de los medios de comunicación de cada pozo </li><li> Pasar una alícuota de las células de cada pocillo - típicamente 75 l, o sobre las células 50.000 - en un 5 ml de poliestireno FACS tubo </li><li> Añadir tetrámero - típicamente uno por cada 50 l de volumen total de l - y en 37 ° C incubadora durante 1-2 horas. También es recomendable para teñir una segunda alícuota de las células de cada pocillo con un tetrámero coincidentes como control negativo. </li><li> Las células de la etiqueta con anti-CD3, anti-CD4 y anticuerpos anti-CD25 mediante la adición de 3.10 L de cada uno de anticuerpos. Marcadores de anticuerpos adicionales o alternativos pueden ser utilizados. Sin embargo, no use los anticuerpos etiquetados PE ya que este canal debe ser reservado para los tetrámeros. En este momento, también sola etiqueta controles de color o isotipo con células extra. </li><li> Se incuban las células anticuerpo marcado durante 15-30 minutos en hielo oa 4 º C. </li><li> Lave cada tubo con 0,5 a 2 ml funcionamiento de amortiguación y se centrifuga a 230 × g durante 10 minutos. </li><li> Cuidado de los tubos de líquido se decanta FACS. Guarde todos los tubos en un recipiente con tapa (de preferencia en el hielo) para el análisis de FACS posteriores. </li></ol> 5. Flujo de Adquisición y Análisis de citómetro <ol><li> Calibrar el citómetro de flujo utilizando cuentas de referencia. </li><li> Compruebe la configuración del instrumento: <ol><li> El uso de células teñidas de control o los controles de isotipo, ajustar la ubicación de la puerta de linfocitos viables (FSC frente a SSC). Quitar autofluorescencia de todos los canales, centrando la población (al cambiar los ajustes de ganancia) por debajo de la primera década en cada eje. </li><li> Usando solo los tubos de control de color, centro de eventos dentro de los cuadrantes correcta para cada color (cambiando la configuración de compensación). </li><li> Hacer un ajuste fino de la configuración del instrumento mediante un tubo de teñido con un tetrámero irrelevante. En situaciones particulares para el canal de PE puede necesitar un ajuste, porque a menudo tetrámeros mancha brillante que el control del anticuerpo. El tetrámero irrelevante que la mancha &lt;0,5% de las células CD4 +. </li></ol></li><li> Adquisición de datos para cada tubo <ol><li> Recoger los sucesos de cada tubo de muestra y el tubo de control negativo </li><li> Adquirir y ahorrar por lo menos 20.000 eventos de Analysys </li></ol></li><li> Analizar los datos <ol><li> Archivos de datos de importación en el software de análisis FACS (por ejemplo, software CellQuest, WinMDI o FlowJo). Iniciar su análisis con un tubo manchado con un tetrámero irrelevante. </li><li> Parcela FSC frente a SSC y dibujar una puerta alrededor de los linfocitos en directo (Figura 1, panel superior izquierdo). </li><li> CD4 complot contra CD3 (linfocitos cerrada para mostrar en vivo solamente) y sacar las puertas de todo el + CD3 y CD4 + poblaciones (Figura 1 panel superior derecho). </li><li> CD4 complot vs tetrámero (cerrada para mostrar linfocitos CD3 + solamente) y establecer los límites del cuadrante para que los CD4 + + Tetramer población es menor de 0,5% (Figura 1 panel inferior izquierdo). </li><li> Parcela CD25 vs tetrámero (cerrada para mostrar sólo los linfocitos CD4 +) y establecer los límites del cuadrante para que el CD25 + + Tetramer población es inferior al 0,5% (Figura 1 panel inferior derecho). </li><li> Analizar todos los tubos de muestra sin necesidad de cambiar las puertas. </li></ol></li></ol>20FIGURE 1167/JOVE%% 201.png "alt =" Figura 1 "width =" 600 "height =" 342 "/&gt; Figura 1. Representante de control negativo resultados de la tinción tetramer. El panel superior izquierdo muestra hacia adelante dispersión dispersión lateral versos y la puerta de tamaño de los linfocitos (R1). El panel superior derecho está cerrada para la R1 y la muestra de hormigas-CD4 en comparación con anti-CD3 y CD3 + (R2) y CD4 + (R3) puertas. El panel inferior izquierdo está cerrado por R2 y programas de anti-CD4 en comparación con tetrámero. El panel inferior derecho está cerrada para la R3 y programas de anti-CD25 en comparación con tetrámero. Los cuadrantes de ambas parcelas tetrámero se establecieron en 0,5%. 6. Resultados representante <ol><li> Las células tetrámero positivo debe ser una población distinta entre los CD4 + células ampliado (Figura 2). </li><li> Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia. </li><li> En algunos casos, una combinación de MHC / péptido puede dar a la tinción de fondo (a menudo causada por un péptido con una mala solubilidad). Tinción de fondo, se puede diferenciar de un verdadero positivo, porque los "falsos positivos", las células no son distintas de una misma población ya sea en el frente Tetramer CD4 o la CD25 vs parcelas tetrámero (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> Figura 2. Representante positivos resultados de la tinción tetramer. El diseño del panel y la estrategia de gating son idénticas a la figura 1. Las células tetrámero positivos aparecen como una población CD4 alto nivel de aceptación en el anti-CD4 en comparación con el panel tetrámero y un claro de la población CD25 + en el anti-CD25 en comparación con el panel tetrámero. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figura 3" width="600" height="336"> Figura 3. Representante de "falsos positivos" resultados de la tinción tetramer. El diseño del panel y la estrategia de gating son idénticas a la figura 1. El anti-CD4 en comparación con el panel se muestra un tetrámero indistinta "montículos" manchas. El anti-CD25 en comparación con tetrámero también muestra un "montículo", manchas, sin una tendencia clara hacia el ser CD25 +.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

Comprender el papel de las células CD4 + T en la inmunidad es de fundamental importancia. Sin embargo, CD4 + antígeno específico de células T puede ser difícil de detectar y aislar de manera artesanal. Por el contrario, tetrámeros de MHC de clase II permite la visualización directa de las células CD4 + T con el antígeno específico deseado. Este vídeo demuestra el aislamiento, purificación y amplificación in vitro de células T CD4 + y su posterior visualización utilizando tetrámeros. Tetrámeros Clase II son proteínas flu...

<table><tbody><tr><td>Campana de flujo laminar de Clase 2</td><td>equipo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>equipo</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>PBS 1X (sin Ca/Mg)</td><td>reactivo</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>equipo</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta de 10 mL</td><td>equipo</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Cartuchos Aerosolve</td><td>equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>con insertos de 50 mL</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>equipo</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>equipo</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Tampón hemolítico</td><td>reactivo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L EDTA disódico</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,2% en PBS</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>equipo</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 mL</td><td>equipo</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Tampón de trabajo</td><td>reactivo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células T CD4+ MACS II</td><td>reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Imán EasySep&amp;#174;</td><td>equipo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 5 mL</td><td>equipo</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>con 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Suero humano en pool</td><td>reactivo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>obtenido de donantes sanos, inactivado por calor y filtrado</td></tr><tr><td>Pen Estrep</td><td>reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Filtro de botella de 500 mL con poro de 0,22 micrones</td><td>equipo</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Placa de 48 pocillos</td><td>equipo</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Incubadora a 37&amp;#x00B0;C con CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>equipo</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Péptido sintético de 20 mg/mL</td><td>reactivo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Síntesis personalizada de cualquier proveedor de péptidos</td></tr><tr><td>Tubo FACS de 5 mL</td><td>equipo</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>de poliestireno</td></tr><tr><td>Tetramero de clase II cargado con péptido (como se describe)</td><td>reactivo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparado por el núcleo de tetrameros del BRI</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>reactivo</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>reactivo</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo Facs Calibur</td><td>equipo</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>O equivalente</td></tr></tbody></table>

visualización de antígeno específico de células t cd4 + con mhc de clase ii tetrámeros

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II tetrámeros permite la visualización directa de las células CD4 + antígeno específico de células T por citometría de flujo. Este método se basa en la interacción altamente específica entre el péptido cargado MHC y el receptor de células T correspondientes. Mientras que la afinidad de un único MHC / péptido molécula es baja, el entrecruzamiento complejos MHC / péptido con estreptavidina aumenta la avidez de la interacción, lo que permite su uso como reactivos de coloración. Debido a las frecuencias relativamente bajo de células CD4 + T (~ 1 en 300.000 para una sola especificidad), este ensayo utiliza un paso de amplificación in vitro para aumentar su umbral de detección. Las células mononucleares se purifican a partir de sangre periférica por subyace Ficoll. Las células CD4 + se separan por selección negativa con un cóctel de anticuerpos con biotina y anti-biotina marcada partículas magnéticas. El uso de células adherentes de la fracción de células CD4 en las células presentadoras de antígeno, células T CD4 + se amplió en los medios de comunicación mediante la adición de un péptido antigénico e IL-2. Las células se expanden son manchadas con la correspondiente clase II tetrámero mediante la incubación a 37 ° C durante una hora y posteriormente teñidos con anticuerpos de superficie, tales como anti-CD4, anti-CD3 y anti-CD25. Después de etiquetado, las células pueden ser directamente analizadas por citometría de flujo. Las células tetrámero positivo generalmente se forman una población distinta entre los CD4 + células ampliado. Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia. Debido a que el nivel de tinción de fondo tetrámero puede variar, los resultados positivos de tinción debe estar siempre en comparación con la tinción de las mismas células con un tetrámero irrelevante. Múltiples variaciones de este ensayo básicos son posibles. Tetrámero células positivas pueden ser clasificados para su posterior análisis fenotípico, la inclusión en ELISPOT o los ensayos de proliferación, u otras pruebas secundarias. Varios grupos han demostrado también co-tinción con tetrámeros y, o bien anti-citoquinas y anticuerpos anti-FoxP3.

Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Los tetrámeros del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II permiten la visualización directa de células T CD4+ antígeno-específicas mediante citometría de flujo. Este método...

Bueno, lo que realmente es único del ensayo Teer es que permite visualizar directamente las células T específicas frente a un antígeno. El te, el teer es el aspecto principal y único de nuestro ensayo. Eso se combina con un paso de amplificación que realizamos.Sabemos que aislamos los linfocitos T y luego los cultivamos en un entorno que enriquece la muestra con los linfocitos T que nos interesan. Luego, podemos etiquetar específicamente solo esas células y visualizarlas en un citómetro de flujo. Por lo tanto, con ensayos anteriores, como los ensayos con CSFE o de proliferación que existen desde hace décadas, lo que se obtiene es solo una medición global general de lo que está ocurriendo en toda la población de linfocitos T.Pero tienes millones de linfocitos T en el cuerpo y estos reconocen un conjunto muy diverso de patrones. Si tienes suerte, quizás una de cada 200 000 a 300 000 células de la muestra sea la que estás buscando. Y por eso este ensayo realiza esos pasos de enriquecimiento.Luego, con un número de prueba, y dado que está teñiendo directamente, en realidad puede visualizar, por encima del fondo, una población que representa menos del 1 % del número total de células. De

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés...

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Este video muestra un método para caracterizar las células T de memoria CD8+ específicas para el virus de inmunodeficiencia de simio (VIS) utilizando tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor de clase I (PMHC-I). Un tetrámero pMHC-I es un complejo de cuatro moléculas MHC-I unidas a péptidos específicos de SIV y conjugadas a un fluoróforo. Estos tetrámeros se unen selectivamente a los receptores de células T (TCR) en las células T CD8+ específicas del VIS, lo que facilita la...

Una técnica de tinción de tetrámero de péptido-MHC-I para analizar células T de memoria CD8+ específicas de SIV

El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Este protocolo describe el uso de la única cadena MHC de clase I complejos para investigar las interacciones moleculares en la activación de células T CD8 + humana: generación de ingeniería antígeno que presenta las células que expresan la cadena sola construye, cultura del clon humano de células T CD8 + y experimentos de activación de la célula de T.

Uso de la única cadena MHC tecnología investigar Co-agonismo humano CD8 + activación de células T

Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

Aprende a purificar y expandir células T CD4+ específicas de antígeno desde sangre periférica y visualizarlas con tetrámeros de MHC clase II mediante citometría de flujo.

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