Name: Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprende a infectar células HeLa con el virus vaccinia y extraer ARN en diferentes puntos temporales post-infección. Este método permite analizar la expresión génica viral y del hospedador mediante microarreglos.

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Los becarios del Instituto Whitehead Fondos

Parte 1: Configuración de la infección <ol><li> Se cultivan las células HeLa en frascos y esperar hasta que las células son aproximadamente el 80% confluente. </li><li> Prepare suficiente medio de cultivo viral para el experimento: regular DMEM con FBS al 2% y no hay antibióticos añadidos. </li><li> La infección se puede realizar ya sea con una reserva de crudo del virus de la vacuna con un título conocido, o sacarosa purificada de virus con un título sabe si usted está preocupado acerca de la expresión génica de acogida. </li><li> Si está utilizando virus sacarosa purificada, vaya directamente a la parte 2. </li><li> Si usted está usando un archivo crudo virus vaccinia, justo antes de la infección, sonicar una alícuota del virus en una taza de baño de ultrasonidos con un baño de hielo y sobre todo un poco de agua. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Sonicado en torno a 30W durante 20 segundos. </li><li> Vórtice del tubo y repetir el tratamiento con ultrasonidos 3 veces, agregando más hielo si es necesario para mantener el vaso lleno de hielo y frío. </li><li> Vortex en cada paso sonicación. </li><li> Proceder a la parte 2. </li></ul></li><li> Por otra parte, si usted no posee un sonicador taza, mezcle un volumen igual de la acción del virus del crudo y la tripsina 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agitar vigorosamente. </li><li> Incubar el virus de archivo / tripsina mezcla en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Vortex a intervalos de 5-10 minutos. </li><li> Proceder a la parte 2. </li></ul></li></ol> Parte 2: Infección de las células <ol><li> Calcular la cantidad de partículas virales necesarias para infectar a la monocapa en la multiplicidad deseado de infección (MOI). Por lo general, un alto MOI (entre 5 y 10) se utiliza para timecourses infección. </li><li> Agregar la cantidad deseada de virus sacarosa purificada o el virus de crudo trypsinized a 37 ° C los medios de cultivo viral y mezclar bien. Que deben utilizar los medios suficientes para cubrir sólo el fondo del frasco. Por ejemplo, 10 ml de los medios de comunicación de un frasco T-175. </li><li> Retire el medio de las células y enjuague con la temperatura ambiente PBS. </li><li> Añadir el virus / los medios de comunicación viral de crecimiento a cada frasco. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agitar suavemente, placas de inclinación y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% durante 1 hora. </li><li> Placas de inclinación y agitar cada 15 minutos a la propagación del virus de manera uniforme y mantener las células húmedas. </li><li> Por un momento el punto 0hr/Mock, añadir el medio de cultivo viral solamente, sin virus añadido. </li></ul></li><li> Después de la incubación de 1 hora, retire el material que contiene el virus, y enjuáguese la boca tres veces con PBS temperatura ambiente. </li><li> Añadir la cantidad máxima de medio de cultivo viral a cada frasco. Por ejemplo, 30 ml de los medios de comunicación de un frasco T-175. Empezar a contar esto como su punto 0 tiempo hr. </li></ol> Parte 3: las células de cosecha <ol><li> Comprobar que las células bajo un microscopio y observar cualquier efecto citopático (CPE). </li><li> Eliminar los medios de comunicación y aclarar las células con 30 ml de PBS temperatura ambiente. </li><li> Agregar 15 ml de tripsina a las células y se incuba durante 2-5min a 37 ° C. </li><li> Compruebe bajo el microscopio para el desprendimiento de células y pulse frasco suavemente para separar las células. </li><li> La transferencia de células con una pipeta serológica estéril en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Lavar el matraz con un volumen igual de medio de cultivo celular, y añadir los medios de comunicación a las células con tripsina en el tubo cónico. </li><li> Centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire la tripsina / medios de comunicación de la célula de pellets. </li><li> Resuspender el botón celular en cualquier reactivo TRIzol o el tampón de lisis de su kit de aislamiento de ARN deseado. </li><li> Si usted está usando TRIzol, dividir la muestra en alícuotas de 1 ml en 1,5 ml etiquetados tubos Eppendorf y se congela a -80 ° C. </li><li> Repita este procedimiento para todos los tiempos, la cosecha de un frasco por cada punto del tiempo. </li></ol> Parte 4: extracción de RNA de muestras en TRIzol <ol><li> En este punto, las muestras deben ser resuspendidas en el reactivo Trizol y listo para ser procesado. </li><li> Añadir 200μL del reactivo de separación de fase BCP por cada 1 ml de TRIzol en cada tubo. Puede que tenga que transferir la muestra a un tubo más grande si usted está comenzando con una gran cantidad de TRIzol. </li><li> Vortex o agite vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo. La fase acuosa es la capa transparente en la parte superior. Usted debe ser la recuperación de aproximadamente 600μL por cada 1 ml de TRIzol que empezó. </li><li> Hacer una segunda extracción con fenol / cloroformo, esta vez con 500μL de cloroformo por 1 ml de Trizol, en lugar de BCP. </li><li> Vortex o agite vigorosamente y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 15 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo. La fase acuosa es la capa transparente en la parte superior. </li><li> Añadir a 20 microgramos de acrilamida lineal para cada muestra. La acrilamida lineal actúa como soporte y ayuda a precipitar el ARN. </li><li> Añadir 500 y micro, L de isopropanol por 1 ml de TRIzol que comenzó con a cada muestra y mezclar bien. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 10-15 minutos. </li><li> El ARN precipitado será visible en la parte inferior del tubo. Con mucho cuidado, separar el sobrenadante del tubo, ya sea con una aspiradora, o manualmente por pipeta. No moleste a la bolita. </li><li> Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 70%. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Añadir 1 ml de etanol al 70% de la pastilla. </li><li> Centrifugar a 14.000 g velocidad máxima durante 5-7 minutos. </li><li> Con mucho cuidado, separar el etanol del tubo, ya sea con una aspiradora, o manualmente por pipeta. Compruebe que la pastilla es visible en la parte inferior del tubo. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li></ul></li><li> Repita el paso de lavado. Después se desecha el sobrenadante, marcar el lugar donde se pellet en el tubo. </li><li> Aire seco en pelets por no más de 5 minutos. No seque en demasía, o el ARN será difícil reconstruir! </li><li> Si desea seguir el tratamiento opcional DNasa para eliminar cualquier resto de ADN de la muestra, resuspender el precipitado en 17μL de agua libre de nucleasa. De lo contrario, resuspender el precipitado en 20μL de agua libre de nucleasa y continúe con el paso 22. </li><li> (Opcional tratamiento DNasa) Utilizando el Qiagen RNasa libre de DNasa set, añadir 2μL Buffer RDD y 1μL reconstituido RNasa libre de DNasa I para el ARN se resuspendió. Mezclar suavemente. </li><li> (Opcional tratamiento DNasa) Se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> (Opcional tratamiento DNasa) Añadir 2μL de 2,5 mM EDTA y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos para inactivar la DNasa. No exceda el tiempo de inactivación o temperatura ya veces / altas temperaturas pueden causar la degradación del ARN. </li><li> Comprobar la concentración de ARN por espectrofotometría. </li><li> Almacenar las muestras de ARN a -80 ° C. </li><li> (CC Opcional) Compruebe la calidad del ARN mediante un Bioanalyzer Agilent, o mediante la ejecución de la muestra en un gel desnaturalizante y comprobar las lecturas de OD. (260 nm y la relación 260/280) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
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</ol>

Los pasos críticos Part 1 &amp; 2 Hay varios pasos fundamentales para la creación de una infección sincrónica vaccinia, el primer baño de ultrasonidos con cuidado (o trypzinizing) del virus, con el fin de desagregar las partículas de virus. Vaccinia es muy propensa a la agregación, y la alteración de las partículas del virus es importante para asegurar incluso la infección de las células. A fin de lograr una infección sincrónica, un alto MOI (superior a 2) se debe uti...

<table><tbody><tr><td>Reactivo TRIzol</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Reactivos similares, como TriPure de Roche, también funcionarán.</td></tr><tr><td>Reactivo BCP para separación de fases</td><td>Reactivo</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNasa libre de RNasa</td><td>Reactivo</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>El tratamiento con DNasa es un paso opcional.</td></tr></tbody></table>

infección por el virus vaccinia y análisis temporal de la expresión génica del virus: parte 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

La familia<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em&gt; Orthopox</em&gt; Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

La familia Poxviridae consiste en virus grandes que contienen ADN de doble cadena y que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de...

Las infecciones de curso temporal en células HeLa utilizando el virus de la viruela comienzan por el establecimiento de las infecciones virales, la infección de las células y luego la recolección del ARN de las células infectadas en varios puntos temporales posteriores a la infección. Este ARN puede amplificarse posteriormente para hibridación con microarreglos, con el fin de analizar la expresión génica. Hola, soy Judy Ann del laboratorio de Kate Irvins en el Instituto Whitehead para la Investigación Biomédica.Hoy les mostraremos un procedimiento para una infección en curso temporal con el virus de la vaccinia en células de mamífero y la subsiguiente extracción de ARN de las células infectadas en diferentes puntos de tiempo posteriores a la infección. Esta técnica es un paso inicial dentro de un protocolo más amplio destinado a extraer y amplificar ARN con el fin de evaluar la expresión génica del virus durante la infección, lo cual se completará en dos videos adicionales de JoVE. Comencemos: para preparar la infección, cultive células HeLa en matraces y espere hasta que las células alcancen aproximadamente un 80 % de confluencia.A continuación, asegúrese de preparar suficiente medio de crecimiento viral para el experimento. Utilizando DMEM regular con 2 %FBS y sin antibióticos añadidos, la infección puede realizarse con stock de virus vaccinia reclutado con una titulación conocida o con virus purificado en sacarosa con una titulación conocida. Si existe preocupación por la expresión génica del huésped, y si está utilizando virus purificado en sacarosa, pase a la siguiente sesión.Si está utilizando un virus vaccinia crudo, sonicar y alíquotar el virus justo antes de la infección, utilizando un sonicador con copa en un baño con hielo mayoritariamente y un poco de agua, alrededor de 30 W durante 20 segundos. Agitar la muestra en vórtex y repetir la sonicación tres veces, añadiendo más hielo si es necesario para mantener la copa llena de hielo y fría; asegúrese de agitar en vórtex entre cada paso de sonicación. Si no dispone de un sonicador con copa, mezcle un volumen igual del stock de virus crudo con 25 miligramos por mililitro.Agite vigorosamente con tripsina en vórtex, incube el stock de virus y mezcle en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Agite en vórtex a intervalos de cinco a 10 minutos para infectar las células. Primero, calcule la cantidad de partículas virales necesarias para infectar la monocapa a la multiplicidad de infección deseada.O MOI. Típicamente, se utiliza un MOI alto entre cinco y 10 para los cursos temporales de infección. A continuación, agregue la cantidad deseada de virus purificado con sacarosa o virus crudo de tryp al medio de crecimiento viral a 37 grados Celsius y mezcle bien.Debe usar suficiente medio para que apenas cubra el fondo del frasco. 10 mililitros de medio serían suficientes para un frasco T175. Retire el medio de las células y enjuague con PBS a temperatura ambiente.Añada el virus o el medio de crecimiento viral a cada matraz para un punto de tiempo simulado de hora cero. Añada solo el medio de crecimiento viral sin virus, agite suavemente y incline las placas, e incube a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de CO2 durante una hora. Asegúrese de inclinar y agitar las placas cada 15 minutos para distribuir el virus uniformemente y mantener las células húmedas.Después de la incubación, retire el medio que contiene el virus y enjuague tres veces con PBS a temperatura ambiente. Añada la cantidad máxima de medio de crecimiento viral a cada matraz.Por ejemplo, 30 mililitros de medio para un frasco T 175. Puede comenzar a contar este momento como su punto de tiempo cero en el momento deseado posterior a la infección. Revise las células bajo un microscopio y anote cualquier efecto citopático o CPE.Retire el medio y enjuague las células con 30 mililitros de PBS a temperatura ambiente. A continuación, agregue 15 mililitros de tripsina a las células e incube durante dos a cinco minutos. A 37 grados Celsius, revise bajo un microscopio la disociación celular y golpee suavemente el matraz para desprender las células.Transfiera las células con una pipeta serológica estéril a un tubo cónico de 50 mililitros. Lave el matraz con un volumen igual de medio de crecimiento celular y añada el medio a las células tratadas con tripsina en el tubo cónico. Centrifugue las células a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, retire el medio de triina del precipitado celular, resuspenda el precipitado celular y agregue ya sea el reactivo triol o el tampón de lisis del kit de aislamiento de ARN que desee. Si está utilizando triol, divida la muestra en alícuotas de un mililitro en tubos eppendorf de 1,5 mililitros etiquetados y congele a menos 80 grados Celsius. Repita para todos los puntos de tiempo.Recolección de un matraz por punto de tiempo. En este momento, su muestra debe estar resuspendida y lista con el reactivo triol para ser procesada. Añada 200 microlitros del reactivo de separación de fases BCP.Por cada mililitro de triol en cada tubo, se utiliza BCP o un bromo tres cloro propano en lugar de fenol. Para reducir la contaminación por ADN genómico, es posible que necesite transferir la muestra a un tubo más grande. Si comienza con una gran cantidad de triol, vortexee o agite vigorosamente y luego incube a temperatura ambiente durante dos a tres minutos; tras la incubación, centrifugue la muestra a 12.000 ×g durante 15 minutos.Una fase acuosa debe ser visible como una capa clara en la parte superior. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo. Debería recuperar aproximadamente 600 microlitros por cada mililitro de triazol con el que haya comenzado.Realice una segunda extracción con fenol-cloroformo. Esta vez utilice 500 microlitros de cloroformo por cada mililitro de triazol en lugar de BCP. La segunda extracción con cloroformo se utiliza para eliminar cualquier rastro de disolvente orgánico de la extracción, ya que incluso cantidades traza pueden inhibir los pasos subsiguientes de amplificación.Vortexee o agite vigorosamente, luego incube a temperatura ambiente durante dos o tres minutos. Centrifugue la muestra a 12,000 ×g durante 15 minutos tras la centrifugación. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo.Recuerde, la fase acuosa es la capa clara superior. A continuación, agregue 20 microgramos de acrilamida lineal a cada muestra. La acrilamida lineal actúa como un vehículo y ayuda a precipitar el ARN.Añada 500 microlitros de isopropanol por cada mililitro de triol con el que comenzó a cada muestra y mezcle. Incube bien las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos; tras la incubación, centrifugue en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 10 a 15 minutos. El pellet de ARN será visible en el fondo del tubo tras la centrifugación.Retire con mucho cuidado el sobrenadante del tubo, ya sea con un aspirador al vacío o manualmente mediante pipeta. No perturbe el precipitado. Lave el precipitado con un mililitro de etanol al 70 % y centrifugue a velocidad máxima durante cinco a siete minutos.Con mucha precaución. Retire el etanol del tubo ya sea con un aspirador al vacío o manualmente mediante pipeta. Deseche el sobrenadante.Verifique que el pellet sea visible en el fondo del tubo. Repita este paso de lavado después de desechar el sobrenadante. Marque la posición del pellet en el tubo.Deje secar el pellet al aire durante no más de cinco minutos. No lo seque en exceso, ya que el ARN será difícil de reconstituir. A continuación, si se planea la reconstitución del ADN, suspenda el pellet en 17 microlitros de agua libre de nucleasas.Si no se planea el tratamiento con D'S, resuspender en 20 microlitros. Para el tratamiento con D'S, utilizar el conjunto KaiGen de ADN libre de ARN. Añadir dos microlitros de tampón RDD y un microlitro de ARN libre reconstituido.Incube el ADN durante 30 minutos a 37 grados Celsius con la mezcla de ARN recién resuspendida, mezclando suavemente. A continuación, agregue dos microlitros de EDTA 2,5 milimolar e incube a 65 grados Celsius durante cinco minutos. Para inactivar el ADN, no supere el tiempo ni la temperatura de inactivación, ya que tiempos más largos y temperaturas más altas pueden causar degradación del ARN.Ahora ha completado el tratamiento del ADN. Verifique la concentración de ARN mediante espectrofotómetro. Se pueden detectar trazas de fenol o BCP como un pico a 270 nanómetros más allá del pico estándar a 260 nanómetros.Al medir la absorbancia del ARN total tras la extracción, si aparece dicha contaminación, retire el ARN utilizando un método de extracción de ARN con filtro o columna antes de continuar con la amplificación. Puede almacenar la muestra de ARN a menos 80 grados Celsius. Si lo desea, puede comprobar la calidad del ARN utilizando un bioanalizador Agilent o corriendo la muestra en un gel desnaturalizante y verificando las lecturas de DO en el bioanalizador.Una buena calidad del ARN se indica mediante el número de integridad del ARN o RIN. El RIN se basa en un sistema numérico que va de uno a 10, donde uno representa el perfil más degradado y 10 el más intacto. Acabamos de mostrarle cómo realizar una infección con curso temporal con el virus de la vaccinia y cómo extraer el ARN de células infectadas en diversos puntos temporales posteriores a la infección.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que existen varios pasos críticos para establecer una infección sincrónica de vaccinia. Primero, la sonicación cuidadosa o la tripsinización del virus. Es fundamental desagregar las partículas virales, ya que el vaccinia tiene una gran tendencia a formar agregados, lo cual impediría una infección uniforme de las células.En segundo lugar, para lograr una infección asincrónica, se debe utilizar una MOI alta, mayor de dos, para asegurar que cada célula sea infectada. Una mezcla de células infectadas y no infectadas provocará múltiples rondas de infección, mezclas heterogéneas de puntos temporales y respuestas transcripcionales virales y del hospedador asincrónicas. En tercer lugar, la infección debe realizarse con cantidades mínimas de medio para permitir la absorción máxima del virus en las células.Además, agitar regularmente el matraz o las placas de cultivo cada 10 minutos permite la distribución del virus a lo largo del matraz y asegura que las células no se sequen. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.Asegúrese de ver los otros videos de esta serie en los que mostramos el procedimiento para la amplificación lineal de muestras de ARN y la preparación y purificación de ARN marcado con fluorescencia.

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Investigación

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Biología

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Aprende a infectar células HeLa con el virus vaccinia y extraer ARN en diferentes puntos temporales post-infección. Este método permite analizar la expresión génica viral y del hospedador mediante microarreglos.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 1

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