Name: Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende a sintetizar cDNA a partir de ARN aislado de células HeLa infectadas con virus vaccinia. Este protocolo detalla la transcripción inversa y amplificación para análisis de microarrays de expresión génica viral y del hospedador.

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Los becarios del Instituto Whitehead Fondos

Parte 1: síntesis de cDNA a partir de ARN <ol><li> Antes de utilizar el Ambion Amino alil MessageAmp II kit, añadir el volumen recomendado de etanol al 100% a los tampones de lavado. </li><li> En el tubo de reacción de PCR, añadir entre 100 ng de ARN total de 5μg y 1μl de T7 oligo (dT) primer. Llevar el volumen hasta 12μl con agua libre de nucleasa. </li><li> Incubar las muestras a 70 ° C durante 10 minutos en un termociclador. </li><li> Extraer muestras de ARN de 70 ° C y centrifugar brevemente. Coloque sobre hielo. </li><li> Preparar la 1 ª Strand Síntesis mezcla maestra y mantener a temperatura ambiente (con un 10% por exceso de pipeteo error). (Tabla 1) </li><li> Mezclar con cuidado la pipeta Maestro o película para mezclar y centrifugar brevemente. </li><li> Transferencia 8μl de la Master Mix para cada muestra de ARN. Mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Se incuba a 42 ° C durante 2 horas en el termociclador. </li><li> Muestras de centrifugar brevemente y el lugar en el hielo. Proceder de inmediato a la siguiente etapa de la síntesis de ADN de doble cadena. </li><li> Preparar el 2 º Strand Síntesis mezcla maestra sobre el hielo (con un 10% por exceso de pipeteo error). (Tabla 2) </li><li> Mezclar con cuidado la pipeta Maestro o película para mezclar y centrifugar brevemente. </li><li> Transferencia de 80μl de cada muestra y mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Se incuba a 16 ° C durante 2 horas en el termociclador. </li><li> Después de la incubación de 2 horas, proceder a la limpieza de cDNA paso o congelar inmediatamente a -20 ° C. </li></ol> Parte 2: doble cadena de ADNc de limpieza <ol><li> Retire el cDNA puro de la nevera y deje que se equilibre a la temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Agite la botella para volver a suspender totalmente las cuentas de unión magnética cDNA antes de su uso. </li><li> Alícuota de agua libre de nucleasa en un tubo de 1,5 ml y se incuba a 50-60 ° C durante al menos 10 minutos durante la incubación 2h anterior. </li><li> Agregar 180μl de cDNA puro a cada muestra, y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. Transferencia de las muestras a un 96 y placa de fondo redondo. </li><li> Continúe mezclando las muestras agitando suavemente la placa en un agitador orbital durante por lo menos 2 minutos. </li><li> Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. Deje la placa en el stand de aproximadamente 6 minutos o hasta que la mezcla se vuelve transparente y las cuentas de enlace tienen gránulos. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. </li><li> Retire la placa del soporte magnético. </li><li> Añadir 150μl del buffer Lave cDNA a cada pocillo y agitar la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a una velocidad moderada. Granos no se dispersan en este paso, debido a la baja tensión superficial de la solución de lavado. </li><li> Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. </li><li> Retire la placa del soporte magnético. </li><li> Repetir el lavado una vez con tampón 2 de 150μl Lave cDNA. </li><li> Después del lavado 2 º, seca los granos al sacudir la placa durante 2 minutos en el agitador orbital a la velocidad máxima. No seque en demasía! </li><li> Eluir el cDNA de las cuentas mediante la adición de 18μl de la precalentado agua libre de nucleasa a cada muestra. </li><li> Agitar enérgicamente el plato durante 3 minutos en el agitador orbital, a continuación, comprobar para asegurarse de que los granos magnéticos son totalmente dispersos. Si no, continuar agitando. </li><li> Una vez que las partículas magnéticas se han dispersado totalmente, mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. </li><li> Transferir cuidadosamente la cDNA eluido (~ 16μl) a una nueva placa de PCR (o los tubos de PCR). </li><li> Pasar directamente al siguiente paso, o congelar el cDNA a -20 ° C. </li></ol> Parte 3: la transcripción in vitro (FIV) <ol><li> Prepare la mezcla maestra IVT a temperatura ambiente. (Tabla 3) </li><li> Pipeta suavemente la mezcla maestra o película para mezclar y centrifugar brevemente. </li><li> Añadir 24μl de cada muestra y mezclar cuidadosamente con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 14 horas en un termociclador, a continuación, mantenga a 4 ° C hasta que esté listo para el siguiente paso. </li></ol> Parte 4: ARNA limpieza después de IVT <ol><li> Vortex las cuentas de unión a ARN brevemente para obtener una mezcla homogénea antes de su uso. </li><li> Prepare la mezcla ARNA unión a temperatura ambiente (Tabla 4) Esto se puede hacer antes de tiempo -. Preparada la mezcla de unión se pueden almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de una semana. </li><li> Mezclar bien por agitación. </li><li> Alícuota del ARNA Tampón de Elución en un tubo de 1,5 ml y se incuba a 50-60 ° C durante al menos 10 minutos. </li><li> Añadir 70μl de la mezcla de ARNA vinculantea cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Transferencia de las muestras de la placa de PCR a una de 96 pozos de fondo redondo de la placa. </li><li> Añadir 50μl de 100% de isopropanol a cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Agitar suavemente la placa en un agitador orbital durante por lo menos 2 minutos para mezclar bien las muestras. </li><li> Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. Dejar la placa en el soporte hasta que la mezcla se vuelve transparente y las cuentas de enlace tienen gránulos. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. </li><li> Retire la placa del soporte magnético. </li><li> Agregar 100μl solución de lavado ARNA a cada pocillo y agitar la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a una velocidad moderada. Cuentas puede no dispersarse en este paso. </li><li> Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. </li><li> Retire la placa del soporte magnético. </li><li> Repita el lavado de un tiempo de 2 ª con la solución de lavado 100μl ARNA. </li><li> Después del lavado 2 º, seca los granos al sacudir la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a la velocidad máxima. No resecar las muestras! </li><li> Eluir el ARNA de las cuentas mediante la adición de 40μl Buffer precalentado elución ARNA a cada muestra. </li><li> Agite la placa para la placa en un agitador orbital durante 3 minutos, a continuación, comprobar para asegurarse de que los granos magnéticos son totalmente dispersos. Si no, continuar agitando. </li><li> Una vez que las partículas magnéticas se han dispersado totalmente, mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. El sobrenadante contiene el limpiada amino-alil ARNA incorporado. </li><li> Transferir cuidadosamente la ARNA eluye a una nueva placa de PCR (o los tubos de PCR). </li><li> (Paso opcional) Comprobar la concentración de ARN de las muestras mediante la medición en un espectrofotómetro 1.5μl NanoDrop. </li><li> Inmediatamente continuar con el siguiente paso, o almacenar el ARNA a -80 ° C. </li></ol> Tabla 1: 1 Strand cDNA síntesis st Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Importe para una reacción </td></tr><tr><td> Buffer 10X primer capítulo </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> Inhibidor de ribonucleasa </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Matriz de secuencias de comandos </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2: 2 Strand cDNA síntesis º Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Importe para una reacción </td></tr><tr><td> Nucleasa agua libre </td><td> 63 l </td></tr><tr><td> Buffer 10X segunda línea </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> ADN polimerasa </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNasa H </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table> Tabla 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Importe para una reacción </td></tr><tr><td> aaUTP solución (75 mM) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mix (25 mM) </td><td> 12 l </td></tr><tr><td> T7 solución UTP (75 mM) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> T7 tampón de reacción 10X </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 l </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Mezclar ARNA Encuadernación <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Importe para una reacción </td></tr><tr><td> * Cuentas de unión a ARN </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> Resuspensión de bolas * Solución </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> 100% de isopropanol ** </td><td> 6 l </td></tr><tr><td> ARNA Concentrado tampón de unión </td><td> 50 l </td></tr></tbody></table> * Mezclar los granos de unión a ARN con la solución de resuspensión primer cordón. ** Agregue el isopropanol y mezclar bien antes de añadir el concentrado de tampón de unión ARNA.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos Una segunda ronda de amplificación no se recomienda como sesgos en la matriz de datos se han observado. Mezclando con cuidado en cada paso enzimático (1 º y 2 º capítulo de síntesis de cDNA, IVT) es fundamental para obtener buenos rendimientos de amplificación, ya que es la incubación de cada paso enzimático a la temperatura adecuada. Un termociclador de PCR con tapa térmica ajustable se prefiere - incluso desviaciones tan pequeñas como 2-3 grados duran...

<table><tbody><tr><td>Kit de amplificación de ARN mensajero con aminoalilo MessageAmp II</td><td>Reactivo</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Para 20 reacciones</td></tr><tr><td>Kit de amplificación de ARN mensajero con aminoalilo MessageAmp II</td><td>Reactivo</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Para 100 reacciones, en formato de placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-VIS NanoDrop ND-1000</td><td>Otro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>O espectrofotómetro equivalente</td></tr></tbody></table>

infección por el virus vaccinia y análisis temporal de la expresión génica del virus: parte 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

La familia<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em&gt; Orthopox</em&gt; Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

La familia Poxviridae consiste en virus grandes con ADN de doble cadena que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de...

Hola, soy Judy Yen del laboratorio de Kate Rubins en el Instituto Whitehead para la Investigación Biomédica. Después de infectar células HeLa con el virus de la viruela y aislar el ARN total, como se mostró en un protocolo previo en video de JoVE, el ARN viral puede aislarse y amplificarse mediante transcripción inversa y transcripción in vitro; el ARN amplificado se utilizará posteriormente en análisis de microarreglos para estudiar la expresión génica viral y del huésped. Así que comencemos.Para comenzar esta síntesis de ADNc a partir de ARN, agregue el volumen recomendado de etanol al 100 % a los tampones de lavado antes de usar el kit de mensajero de aminoácidos ambiente AMP dos en un tubo de reacción de PCR. Añada entre 100 nanogramos y cinco microgramos de ARN total y un microlitro de cebador oligo T siete. Ajuste el volumen hasta 12 microlitros con agua libre de nucleasas. Incube las muestras a 70 grados Celsius durante 10 minutos en un termociclador.A continuación, retire las muestras de ARN del centrifugador a 70 grados Celsius. Breve centrifugación, coloque las muestras en hielo. Prepare la mezcla maestra para la síntesis del primer filamento con un exceso de volumen del 10% para compensar errores de pipeteo.Déjelo a temperatura ambiente, pipetee suavemente la mezcla maestra o agite para mezclar, y luego centrifugue brevemente. Después de la centrifugación, transfiera ocho microlitros de la mezcla maestra a cada muestra de ARN mezclando mediante pipeteo arriba y abajo de tres a cuatro veces, e incube a 42 grados Celsius durante dos horas en un termociclador. Tras la incubación, centrifugue brevemente las muestras y colóquelas inmediatamente en hielo. Proceda inmediatamente al siguiente paso de la síntesis de DS dsd A.Prepare la mezcla maestra para la síntesis de la segunda cadena en hielo, con un exceso de volumen del 10 % para compensar errores de pipeteo; pipetee suavemente la mezcla maestra o agite brevemente el tubo y luego centrifugue brevemente. Transfiera 80 microlitros a cada muestra y mezcle suavemente pipeteando de arriba abajo tres o cuatro veces. Incube a 16 grados Celsius durante dos horas en el termociclador.Después de la incubación de dos horas, continúe con el paso de purificación de ADNc o congele inmediatamente a menos veinte grados Celsius. Para comenzar la purificación de ADNc de doble cadena, primero retire el ADNc puro del refrigerador y déjelo equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlo; agite el frasco para resuspender completamente las perlas magnéticas de unión a ADNc antes de usarlas. Aliquote agua libre de nucleasas en un tubo de 1,5 mililitros e incube a entre 50 y 60 grados Celsius durante al menos 10 minutos.Durante la incubación previa de dos horas, agregue 180 microlitros de CD NA puro a cada muestra y mezcle completamente mediante pipeteo arriba y abajo. Transfiera las muestras a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Después de transferir las muestras a la placa, continúe mezclándolas agitando suavemente la placa en un agitador orbital durante al menos dos minutos.Coloque la placa en un soporte magnético para capturar las perlas magnéticas. Deje la placa en el soporte durante aproximadamente seis minutos o hasta que la mezcla se vuelva transparente y las perlas de unión se sedimenten. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador al vacío sin perturbar las perlas magnéticas.Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante. Una vez que el sobrenadante haya sido descartado, retire la placa del imán. A continuación, agregue 150 microlitros de tampón de lavado de ADNc a cada pocillo y agite la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad moderada.Las perlas no se dispersarán en este paso debido a la baja tensión superficial del tampón de lavado. Después de agitar, coloque nuevamente la placa en un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas, aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador al vacío sin perturbar las perlas magnéticas.O retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante. Retire la placa del soporte magnético. Repita la lavada una segunda vez con 150 microlitros de tampón de lavado de ADNc.Después del segundo lavado, seque las perlas agitando la placa durante dos minutos en el agitador orbital a velocidad máxima. Es importante no dejar que las perlas se sequen en exceso. A continuación, eluya el ADNc de las perlas añadiendo vigorosamente 18 microlitros de agua libre de nucleasas precalentada a cada muestra.Agite la placa durante tres minutos en el agitador orbital. Luego, verifique que las perlas magnéticas estén completamente dispersas. Si no es así, continúe agitando.Una vez que las perlas magnéticas estén completamente dispersas, coloque la placa en un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas, transfiera cuidadosamente el ADN eluido a una nueva placa PCR o a tubos PCR. Debería recuperar aproximadamente 16 microlitros del eluido por muestra.A continuación, pase directamente al siguiente paso o congele el cdNA a menos veinte grados Celsius. Prepare la mezcla maestra de IVT a temperatura ambiente. Pipetee suavemente la mezcla maestra o agite ligeramente para mezclar y centrifugue brevemente.Después de la centrifugación, agregue 24 microlitros a cada muestra y mezcle suavemente pipeteando de arriba abajo tres a cuatro veces, incube a 37 grados Celsius durante 14 horas en un termociclador. Luego mantenga a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para el siguiente paso; vortexee brevemente las perlas de unión al ARN para obtener una mezcla homogénea antes de su uso. Prepare la mezcla de unión al ARN A a temperatura ambiente.Esto puede hacerse con antelación. La mezcla de unión preparada se puede almacenar a temperatura ambiente durante hasta una semana. Mezcle bien mediante vortex y alícuota el tampón de elución de ARN A en un tubo de 1,5 mililitros, luego incube a 50-60 grados Celsius durante al menos 10 minutos.Ahora, agregue 70 microlitros de la mezcla de unión de ARN A a cada muestra y mezcle bien pipeteando de arriba abajo tres o cuatro veces. Transfiera las muestras desde la placa de PCR a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. A continuación, agregue 50 microlitros de isopropanol al cien por ciento a cada muestra y mezcle bien pipeteando de arriba abajo tres o cuatro veces.Agite suavemente la placa en un agitador orbital durante al menos dos minutos. Para mezclar completamente las muestras, coloque la placa en un soporte magnético con el fin de capturar las perlas magnéticas.Deje la placa en el soporte hasta que la mezcla se vuelva transparente y las perlas de unión se sedimenten. Una vez que las perlas se hayan sedimentado, aspire cuidadosamente el sobrenadante con el aspirador al vacío sin perturbar las perlas magnéticas. Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante.Retire la placa del soporte magnético. A continuación, agregue 100 microlitros de una solución de lavado de ARN a cada pocillo y agite la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad moderada; en este paso, las perlas no necesitan dispersarse completamente. Tras esto, coloque la placa en un soporte magnético.Para capturar las perlas magnéticas. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador al vacío sin perturbar las perlas magnéticas. Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante.Una vez que se haya eliminado el sobrenadante, retire la placa del soporte magnético. Repita el lavado una segunda vez con 100 microlitros de una solución de lavado de ARN. Después del segundo lavado, seque las perlas agitando la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad máxima.Recuerde no secar en exceso las muestras; eluya el ARN A de las perlas añadiendo 40 microlitros del tampón de elución de ARN A precalentado a cada muestra. Agite vigorosamente la placa en el agitador orbital durante tres minutos. A continuación, compruebe que las perlas magnéticas estén completamente dispersas.Si no es así, continúe agitando. Una vez que las perlas magnéticas se hayan dispersado completamente, mueva la placa a un soporte magnético para capturar las perlas magnéticas. El sobrenadante contiene el alelo amino purificado, incorporado en un ARN.Transfiera cuidadosamente el ARN eluido a una nueva placa PCR o a tubos PCR. En este momento, puede verificar la concentración de ARN de las muestras midiendo 1.5 microlitros en un espectrofotómetro NanoDrop. Continúe inmediatamente con el siguiente paso o almacene el ARN a -80 grados Celsius.Acabamos de mostrarle cómo etiquetar con fluorescencia muestras de ARN con alelo inmuno amplificado incorporado para hibridación en micromatriz. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que no se recomienda realizar una segunda ronda de amplificación. Como se han observado sesgos y datos de la matriz, también es fundamental recordar mezclar cuidadosamente en cada paso enzimático, tanto para la primera como para la segunda cadena.La síntesis de ADNc, o el paso de transcripción in vitro (IVT), es fundamental para obtener buenos rendimientos de amplificación, al igual que la incubación de cada paso enzimático a la temperatura adecuada. Se prefiere un termociclador para PCR con tapa calentada ajustable, ya que incluso desviaciones tan pequeñas como de dos a tres grados durante la transcripción in vitro en un horno de hibridación de aire o en un baño de agua pueden afectar significativamente el rendimiento del producto amplificado.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos. Asegúrese de ver los otros videos de esta serie, en los que mostramos cómo realizar una infección con curso temporal con el virus vaccinia, la extracción de ARN de las muestras y la preparación y purificación de ARN marcado con fluorescencia.

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Biología

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Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3

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Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

ICP0 sufre translocación nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. No se conoce el mecanismo molecular de este evento. Aquí describimos el uso de microscopio confocal como una herramienta para cuantificar el movimiento ICP0 infección por HSV-1, que establece las bases para el análisis cuantitativo de desplazamiento ICP0 en futuros estudios mecanicistas.

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Aprende a sintetizar cDNA a partir de ARN aislado de células HeLa infectadas con virus vaccinia. Este protocolo detalla la transcripción inversa y amplificación para análisis de microarrays de expresión génica viral y del hospedador.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

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