Name: A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Aprende a realizar imágenes de larga duración en células de mamíferos utilizando microscopía de campo amplio invertida a 37°C. Este método permite estudiar la progresión mitótica en tiempo real con control de temperatura y CO2.

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Los autores no tienen nada que revelar.

a largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos wide-field microscopía

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

En realidad, lo que voy a hacer es montarlo aquí primero y luego cambiarte a ti. Ahora voy a aspirar, intentando ser lo más cuidadoso posible. Bien. Unos segundos sosteniendo. De acuerdo. Muy bien.Entonces, las características importantes de nuestra rejilla de imagenología vital son las siguientes: se trata de un microscopio invertido, lo que significa que el objetivo, las muestras aquí en el objetivo están debajo. Por lo tanto, el objetivo apunta hacia arriba y todo el microscopio, o prácticamente todo, incluyendo los objetivos y la muestra, se encuentra a 37 grados. Así, todo dentro de esta caja de plástico está a 37 grados.Y justo encima del escenario tenemos una mezcla de aire y CO₂. Eso es 5 % CO₂. Así que la idea es que la muestra está realmente en una célula, es como un incubador de células.Y así tenemos, este es nuestro mezclador para el aire y el CO₂, que luego se humidifica y calienta, y después se canaliza hacia la muestra en la platina. Bien. Hoy simplemente realizaremos fluorescencia en un solo canal, la fluorescencia GFP. Esta es la manguera por donde entra el CO₂ y el 5 % de CO₂, y simplemente se ajusta al soporte de la platina.Eso es importante. Luego podemos cerrar estos, retirarlos y pasar a nuestra primera posición. Lo que voy a hacer es ir al primer campo, que es mi muestra de control, y elegiré posiciones según lo que vea en la pantalla.Entonces, solo me aseguro de mirar realmente por el microscopio en cada pocillo nuevo, porque el plano focal para cada uno de los pocillos es diferente; el plato no es perfectamente plano en la base. Por lo tanto, será necesario realizar ajustes finos al pasar de un pocillo a otro. En este momento estoy en el primer pocillo; lo que haré es enfocar, así que acabo de encender la luz, la luz transmitida para el microscopio.Y he asegurado que toda la luz vaya hacia los oculares. Entonces simplemente miro dentro, verifico que obtenga un campo limpio y uniforme. Luego, apagaré esa luz, encenderé la luz de fluorescencia y verificaré que las células que estoy observando tengan un aspecto saludable y no estén en apoptosis.Y, y lo apago. Y lo que hago a continuación es enviar, así que ahora voy a empezar a seleccionar posiciones, lo que significa que tengo que enviar la trayectoria de la luz a la cámara. Esta es la cámara aquí mismo.Entonces le indico al microscopio que envíe toda la imagen a la cámara, ya que no se ve nada en los oculares. Lo que haré es seleccionar, en el software que controla el microscopio, el juego de filtros adecuado, que para nuestros fines es psy. Luego, estableceré un tiempo de exposición.Y conozco muy bien estas células y sé que requieren un tiempo de exposición de 0,2 segundos. Por lo tanto, le indico eso al software. Y lo que haré a continuación es hacer clic en enfoque.Esto está vivo, básicamente. Una luz se encenderá y usted puede, oh, no sé si puede ver las células, pero la razón por la que este es un buen campo es porque todas las células son uniformes, incluso en cuanto a su fluorescencia. No hay células apoptóticas. Las células apoptóticas suelen ser muy brillantes y no hay suciedad ni residuos en el campo.Y puede observarse que, en realidad, esta es una célula en metafase y esa es una célula en metafase, esa es una célula que probablemente acaba de salir de la mitosis. Y puedo deducirlo porque parece que esos dos juegos de cromatina están muy bien orientados uno respecto al otro. Como si acabaran de salir de una anafase.Entonces ese es un buen campo. Ahora que sé que el tiempo de exposición y el conjunto de filtros son correctos, y esto dependerá del software específico, procederé a tomar posiciones y el software habrá memorizado la posición X, Y, Z de ese campo. Luego, cuando seleccione otro campo, haré lo siguiente: al elegir nuevos campos, pero en el mismo espécimen, usaré el sistema, moveré el dispositivo, cerraré y abriré el obturador para observar lo que aparece en la pantalla, y seleccionaré los campos en función de esa imagen en lugar de mirar directamente por el microscopio.Así que no veo ninguno de mis tónicos allí. Pero nuevamente, incluso cuando están bien centradas, estas células pasarán a través de mi PS, continúo; aquí hay un buen ejemplo. Aquí hay un buen ejemplo de lo que yo evitaría, ¿ve cómo de brillante es eso?Esto es muy brillante. Probablemente sean restos de una célula apoptótica. La razón por la que evitaría esto es que, al ser tan brillante, cuando el software enfoque automáticamente, hará el enfoque automático únicamente en ese punto y no estará en el mismo plano que todas las demás células.Y así no obtendré ninguna información de ese campo. Eso se ve bien. Hay una, esta es una profase metafásica justo aquí, eso es una metafase.Entonces, voy a tomar tres posiciones por pocillo. Eso fue tres posiciones y ahora voy a pasar a mi siguiente pocillo, de modo que pueden, entonces lo que probablemente haré será tomar imágenes cada 10 minutos. Es un compromiso.La imagenología en condiciones de vida es siempre un compromiso, ¿verdad? Es necesario obtener imágenes, pero también mantener las células sanas, especialmente si se está interesado en la mitosis. Por lo tanto, hay que minimizar su exposición a la luz fluorescente.Y, pero usted quiere obtener información. Por lo tanto, tiene que tomar imágenes, tiene que, así que tiene que llegar a un compromiso, tiene que tomar una decisión sobre qué desea capturar, qué tipo de información desea obtener. Para nuestros fines, la mitosis suele durar aproximadamente una hora.Entonces, si estamos tomando intervalos de 10 minutos, eso es bastante bueno. Observamos profase, observamos metafase, observamos anafase, y podemos ver cuándo hay tratamientos, fármacos o siARN que afectan a esas etapas específicas del ciclo celular. Por lo tanto, para nuestros propósitos, eso es suficiente, pero siempre queremos más.Siempre queremos más posiciones o un intervalo de tiempo más fino o algo por el estilo. Por lo tanto, es un compromiso. Entonces, haré clic en iniciar.Y así, nuestro software realiza un pase de enfoque automático en el primer paso. Entonces, una vez que pulse inicio, debería comenzar automáticamente el enfoque automático y verá que el obturador se abre, se abre y cierra durante el enfoque automático. Así que voy a pulsar inicio.Entonces, eso es la apertura y cierre del obturador. El motor Z se está activando y en realidad está intentando encontrar el plano con mayor contraste, que será el más enfocado. En realidad, se puede ver en la pantalla cómo entra y sale al buscar el mejor plano de enfoque, lo cual podría resultar preocupante.Lo que hace es mover el motor Z para encontrar el plano de enfoque óptimo, es decir, el plano con la imagen más nítida. Luego, adquiere una imagen en ese punto y aprende esa posición Z. A continuación, utilizaremos esa posición Z para los siguientes 12 pasos.Luego realizaremos nuevamente el enfoque automático. ¿Qué tipo de experimentos realizan? Bien, nuestro laboratorio tiene principalmente interés en comprender qué regula la progresión mitótica, o al menos yo estoy más interesado en entender eso.Entonces, con la imagenología de células vivas y especialmente con nuestro microscopio de imagenología multiposición y a largo plazo, se pueden observar y grabar células durante dos o tres días mientras entran y finalizan la mitosis, y se pueden obtener imágenes de múltiples ciclos mitóticos para poder comprenderlos. Luego, se pueden añadir fármacos, ARN o cualquier tipo de perturbación a las células que se desee estudiar. De este modo, se puede comprender cómo esos fármacos o genes son importantes en la regulación de la progresión mitótica.Dado que no se trata de trabajo con células fijadas sino con células vivas, se puede comprender qué perturbación es necesaria para afectar la mitosis o en qué etapa de la mitosis se produce el efecto. Por lo tanto, es realmente potente en ese aspecto. ¿Cuáles son los elementos técnicos principales de estos experimentos?¿Cuáles son los posibles problemas? Bueno, el problema más grande, además de configurar el equipo, es que configurar el equipo no es sencillo. Muchas personas tienen el equipo, pero simplemente deben asegurarse de que funcione bien para su aplicación.El aspecto financiero no es, ya sabe, no es insignificante. Entonces está la instalación del equipo y luego, una vez que se recopilan los datos, surge un verdadero problema de análisis de datos. Toma estas grabaciones; es decir, si está recopilando 40 grabaciones, cada una con 30 células, por lo que tiene 40 campos en 40 campos que acaba de filmar y cada uno de esos campos tiene 30 células, entonces debe sentarse frente a cada una de esas grabaciones y observar cada una de esas células en dicha grabación.Por lo tanto, se tarda mucho tiempo en realizar el análisis de datos. Y eso significa que se tarda una semana en analizar datos que le tomaron dos días recolectar. Por lo tanto, esto representa un obstáculo muy grande en cuanto a la recopilación de grandes cantidades de datos.Por lo tanto, aunque se trata de una recolección de datos de alto rendimiento, no es un análisis de alto rendimiento. Entonces, ¿qué haría para convertir este experimento en uno verdaderamente de alto rendimiento? Nuestro laboratorio se encuentra en proceso de desarrollar un programa que realice el análisis de datos de forma automática.Y es un programa bastante decente. No es perfecto. El ojo humano siempre es mejor, pero está avanzando en esa dirección.Entonces, ¿cuáles son las aplicaciones interesantes de este experimento? ¿Quizás otros campos que podrían mencionarse? ¿Además de la división celular?¿Se refiere a, oh, a la imagenología de células vivas? Sí. Bueno, puede realizar ensayos de motilidad celular. Puede, dependiendo de la microscopía que se utilice, observar cómo se comportan las células, o incluso estudiar el desarrollo tumoral si realmente lo desea.Pero allí, usted, ustedes, si siempre que tengan el sistema de imagen adecuado, pueden, prácticamente no están limitados en ningún aspecto. Nuestro microscopio resulta ser solo de campo amplio y utilizamos un objetivo de 20 por 20 aumentos. Así que es un sistema de resolución bastante baja, pero eso es suficiente para lo que necesitamos observar.Entonces, los hay, pero definitivamente no hay limitaciones; cualquier experimento que implique algún tipo de dinámica, como en biología, se beneficiaría realmente de la imagenología en tiempo real. Así, la imagenología de calcio, aunque no podría realizarse en nuestro aparato, es una técnica para células vivas.Definitivamente necesitas imágenes de células vivas para eso. Como dije, los ensayos con pacientes, los ensayos de motilidad y ese tipo de cosas se beneficiarían mucho de la obtención de imágenes de células vivas. ¿Le gustaría comentar brevemente su experiencia previa?¿Durante cuánto tiempo trabaja en estas técnicas? ¿En qué ha trabajado antes? Vaya. Durante mi doctorado no trabajé.Realicé mucha microscopía confocal, pero ninguna imagenología de estilo de vida. Durante mi posdoctorado, ayudé al Dr. King a obtener este aparato que utilizamos para configurar estos fragmentos y ponerlo en funcionamiento. Así que durante mi posdoctorado, adquirí mucha experiencia tanto en microscopía de campo amplio con imágenes de lapso de tiempo en nuestro microscopio, que es de campo amplio, como también en imágenes de lapso de tiempo mediante microscopía confocal.Y diría que es realmente potente. Se obtiene mucha información, pero no es fácil hacerlo funcionar a la perfección. Por lo tanto, realmente requiere mucha atención y un gran cuidado en los detalles en cada pequeña etapa del proceso.Y, y luego aún tienes problemas. Así que es una aplicación difícil, pero realmente puedes obtener, si, si es lo que necesitas para estudiar tu problema, tu problema científico, entonces, es invaluable en ese aspecto, pero es complicada. Así que busca a alguien que sepa lo que está haciendo y recurre a esa persona.Ese es mi consejo. Tan bueno.

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Aprende a realizar imágenes de larga duración en células de mamíferos utilizando microscopía de campo amplio invertida a 37°C. Este método permite estudiar la progresión mitótica en tiempo real con control de temperatura y CO2.

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