Name: La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende la disección fina y gruesa de epitelios sensoriales del oído interno en Danio rerio adultos. Este protocolo permite estudiar la regeneración de células ciliadas en vertebrados adultos.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health.

Parte 1: Preparación del tejido <ol><li> La eutanasia de los adultos de pez cebra con buffer MS-222 (el 3-aminobenzoato de sal metanosulfonato, 0,03%). </li><li> Decapitar a los peces. Cortar la mandíbula inferior, colocar la cabeza en el cojín de disección con la cara ventral hacia arriba, e inmovilizar el tejido con alfileres de insectos. Eliminar los tejidos blandos en el cráneo ventral y el crack abrir la parte ventral de la cápsula del cráneo con un par de pinzas finas bajo el microscopio de disección. </li><li> Fijar la cabeza de pescado en paraformaldehído (4%) a 4 ° C durante la noche. </li><li> Enjuague la cabeza de pescado fija en PBS (tampón fosfato salino, 1X) por 3 veces, 5 minutos cada vez. </li></ol> Parte 2: la disección macroscópica del oído interno <ol><li> Coloque la cabeza de pescado en la plataforma de la disección con el lado ventral. Inmovilizar con alfileres de insectos. Todos estos pasos se llevan a cabo bajo el microscopio de disección. </li><li> Con un par de pinzas finas, eliminar el hueso del cráneo en el oído interno y a continuación, extraiga los tejidos del oído interno: sáculos, lagenae y utrículos. El sáculo y lagena están estrechamente unirse unas a otras y por lo tanto salir juntos, mientras que el utrículo (anterior a la sáculo y lagena), muy probablemente se va a separar de los órganos otro extremo durante la disección. </li><li> Ponga los tejidos del oído interno en PBS (1X). Si no hay disección fina se necesitan más, enjuague el tejido 2-3 veces con PBS (1X) y que puede ser utilizado para otros experimentos, cryosections por ejemplo. </li></ol> Parte 3: la disección fina de los epitelios sensoriales del oído interno <ol><li> La disección fina se puede realizar en una gota de PBS (1X) en un portaobjetos de vidrio limpio. </li><li> Quitar el otolito utricular del utrículo con dos pares de pinzas finas, y, si lo desea, recorte del tejido epitelial no-sensorial y la inervación de los epitelios de la con un par de pinzas finas y una hoja de aguja. </li><li> Quitar el otolito sacular lagenar antes de la separación y el epitelio lagenar mientras tratan de mantener el sáculo todo lo más intacta posible. Coloque el tejido en la caída de PBS con un máximo de la parte ventral. Use la hoja de aguja para cortar cuidadosamente entre el sáculo y lagena. Se quita el exceso de no-sensorial tejido epitelial y el innvervation con pinzas finas y la hoja de aguja, si lo desea. </li></ol> Parte 4: tinción fluorescente de las células ciliadas del epitelio sensorial <ol><li> Enjuague los epitelios sensoriales con PBT (1XPBS y 1% de Triton X-100) por 3 veces, 5 minutos cada vez. </li><li> Incubar los epitelios con fluophore marcado con phalloidin (por ejemplo, harina de Alexa 488 faloidina, 1:1000 dilución) durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague los epitelios sensoriales con PBT de 3 veces, 10 minutos cada vez. </li><li> Monte de los epitelios en un portaobjetos con medio de montaje y comprobar que el tejido teñido bajo el microscopio de fluorescencia con filtros de longitud de onda adecuada. </li><li> Después de la disección con éxito y las manchas, el epitelio intacto, con manchas paquete fuerte de las células ciliadas se puede ver bajo el microscopio (Fig. 1). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Las células ciliadas del epitelio sensorial sacular se tiñeron con Alexa Harina 488 faloidina (verde). La muestra de tejido se disecó y se tiñeron como se menciona en el documento. Varias fotos fueron tomadas en diferentes posiciones de la muestra y azulejos, junto con Adobe Photoshop 7.0. Barra de escala = 150μm.

En este protocolo, que describe la disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno del pez cebra adulto, que nos permite preparar muestras de tejidos para estudiar las características celulares y subcelulares de los epitelios sensoriales. Con el fin de llevar a cabo una disección de éxito, el primer paso, la fijación, es muy importante. Asegúrese de usar siempre solución de paraformaldehído al recién preparada porque la solución de edad se traducirá en menores de fijaci...

<table><tbody><tr><td>MS222 (sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato, 10X)</td><td>Reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 faloídicina</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje VECTASHIELD Hard Set con DAPI</td><td>Reactivo</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Micróscoipo de disección</td><td>Micróscoipo</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de aguja</td><td>Herramienta</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>Micróscoipo de fluorescencia</td><td>Micróscoipo</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de disección</td><td>Herramienta</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>Pececillo cebra</td><td>Animal</td><td>Varios</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

la disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensorial epitelio del oído interno son las estructuras esenciales para las funciones de audición y el equilibrio. Por lo tanto, es importante entender las características celulares y moleculares de los epitelios, que se componen principalmente de dos tipos de células: las células ciliadas (HC) y células de soporte (SC). Aquí elegimos para el estudio de los epitelios sensoriales del oído interno en el pez cebra adulto, no sólo porque las estructuras epiteliales son altamente conservadas en todos los vertebrados estudiados, sino también porque los adultos de pez cebra es capaz de regenerar los HC, una habilidad que los mamíferos pierden poco después del nacimiento. Nosotros usamos el oído interno de adultos de pez cebra como sistema modelo para estudiar los mecanismos de regeneración del oído interno HC en los vertebrados adultos que podrían ser útiles para el tratamiento clínico de la deficiencia auditiva / equilibrio en humanos como resultado de la pérdida de HC. Aquí se demuestra cómo hacer la disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en el pez cebra adulto. La disección bruto elimina los tejidos que rodean el oído interno y es de gran ayuda para la preparación de las secciones de tejido, lo que nos permite examinar la estructura detallada de los epitelios sensoriales. La disección fina limpia los tejidos no-sensorial-epitelial del epitelio cada individuo y nos permite examinar la heterogeneidad del epitelio toda facilidad en todo el montaje de muestras epiteliales.

El epitelio sensorial del oído interno de los adultos de pez cebra es un buen modelo de sistema para la comprensión de los mecanismos de regeneración de las células ciliadas en los vertebrados adultos. Este protocolo demuestra la disección fina de los epitelios, a través del cual podemos obtener muestras de tejido para el estudio de los eventos de regeneración a nivel celular y subcelular.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Los epitelios neurosensoriales del oído interno son las estructuras cruciales para las funciones de la audición y el equilibrio. Por lo tanto, es importante comprender el...

En el oído interno del pez cebra, existen tres pares de sáculos, órganos terminales similares a sacos: el utrículo, el S y el Lana. El utrículo se sitúa más anteriormente, mientras que el S y el lega están estrechamente unidos entre sí y se localizan posteriormente al utrículo. Tras la disección gruesa, el S y el lega permanecen unidos y la estructura calcárea denominada otolito puede observarse fácilmente en cada órgano terminal durante la siguiente disección fina. El S y el lega se separan entre sí mediante un corte desde el lado ventral.Se extraen los otolitos y se eliminan los tejidos epiteliales no sensoriales para obtener los tejidos epiteliales sensoriales de los tres órganos sensoriales. Hola, soy Jean Leon del Laboratorio de Sean Burgess, en la sección de genómica del desarrollo del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano. Hoy les mostraremos un procedimiento para la disección fina y precisa de los epitelios sensoriales del oído interno de la pez cebra adulto.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la expresión génica en los epitelios sensoriales del oído interno. Comencemos. Para iniciar la disección, eutanasiar el pez cebra adulto

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe un procedimiento para identificar y disecar los órganos de los adultos de pez cebra.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Este artículo describe un método para microdissect retinas del pez cebra con y sin epitelio pigmentario de la retina adjunta, de uno a tres embriones postfertilización días.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Un método claro y estandarizado para la disección y el aislamiento del corazón del pez cebra en varias etapas de desarrollo se describen. Técnicas de anotación y cuantificación también se discuten.

La disección del corazón en las larvas, juveniles y adultos de pez cebra, Danio rerio</em

El propósito de este video es para demostrar los procedimientos para obtener las células sanas, intactas pelo de los órganos del oído interno de pez cebra adultos y luego usarlos para estudios de patch clamp objetivo de caracterizar las propiedades biofísicas de los canales dependientes de voltaje.

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Este video describe el protocolo que se desarrolla para diseccionar lentes de pez cebra adultos y larvales para analizar la morfología cortical del cristalino y la integridad estructural de las suturas del cristalino.

Disección del cristalino del ojo: una técnica para observar la morfología del cristalino del pez cebra

Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

La microscopía electrónica (EM) 2D a gran escala, o nanotomía, es la aplicación en todo el tejido de la EM de resolución a nanoescala. Aquí describimos un método universal de nanotomía aplicado para investigar el cerebro de las larvas de pez cebra en la salud y en caso de lesión cerebral no invasiva.

A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.

Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

Se describe un modelo mecánico de lesión cerebral en el pez cebra adulto para investigar los mecanismos moleculares que regulan su alta capacidad regenerativa. El método explica crear una lesión por arma blanca en el tectum óptico de múltiples especies de peces pequeños para evaluar las respuestas regenerativas utilizando inmunotinción fluorescente.

Modelo de lesión por puñalada del Tectum óptico adulto utilizando pez cebra y medaka para el análisis comparativo de la capacidad regenerativa

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Aprende la disección fina y gruesa de epitelios sensoriales del oído interno en Danio rerio adultos. Este protocolo permite estudiar la regeneración de células ciliadas en vertebrados adultos.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

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