Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Este procedimiento comienza con la inyección de un embrión de pez cebra unicelular situado en un molde de inyección de modo que la célula esté orientada hacia el lado opuesto al aparato de inyección. A continuación, los embriones se inyectan con ARN, con la aguja que atraviesa la yema y entra en la célula. Al día siguiente.

Una corredera de montaje de plástico está rellena de aros. Un embrión anestesiado se coloca entonces invertido en un orificio del aros en la imagen, mediante microscopía confocal. Hola, soy Grabham del laboratorio de la Dra. Hazel Sieve en el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica y del departamento de biología del MIT.

Hoy te mostraremos un procedimiento para inyectar embriones de pez cebra en la etapa unicelular y la posterior imagen en vivo del cerebro mediante microscopía confocal. En nuestro laboratorio, utilizamos este procedimiento para estudiar la morfogénesis cerebral de vertebrados a resolución de una sola célula. Así que empecemos.

El ARNm utilizado en este procedimiento se transcribe de un plásmido que codifica C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A unido a membrana GFP. Primero linealiza el plásmido mediante digestión no con uno, luego transcribe el ARNm de membrana GFP del plásmido linealizado usando el mensaje M y el kit de máquina tras transcribir el ARNm, cuantificando el ARNm y el agua resultantes a un microgramo por microlitro, Eloqua y guarda a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. El día antes de la inyección, monta jaulas de apareamiento, separando a los machos de las hembras el día de la inyección. Utiliza un instrumento de ajuste micropipeta polar para extraer agujas capilares y para la inyección.

Prepara un molde de inyección de 1% AGA con filas del ancho de embriones en la etapa unicelular el día de la inyección, descongela una alícuota de membrana de ARNm GFP a una concentración de un microgramo por microlitro sobre hielo. Diluye el ARNm de uno a cinco en agua hasta una concentración final de 200 nanogramos por microlitro y mantenlo en hielo. Carga la aguja capilar con un microlitro de membrana preparada, ARNm GFP a 200 nanogramos por microlitro.

Aquí añadimos rojo de fenol al ARNm al 0,05% para que sea visible en las inyecciones. Coloca la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un microinyector accionado por gas. Ajusta el volumen de inyección a un nanolitro.

A continuación, quita los separadores de los peces salvajes instalados en jaulas de apareamiento desde el día anterior. Recoge los embriones tan pronto como estén puestos. Llena el molde de inyección de rosa AGA con medio embrionario y orienta los embriones dentro del molde con una sola célula en el lateral, opuesto al micromanipulador.

Inyecta a través del corión y las yemas de modo que el ARNm se deposite directamente en la célula individual. Inyectar aproximadamente 50 embriones por experimento. Sin embargo, si la célula se ha dividido, no inyectar después de que los embriones hayan sido inyectados, incubarlos a 28 grados Celsius durante la noche en el medio embrionario.

Tras la incubación nocturna, los embriones inyectados están listos para montarse y hacer imágenes. Para comenzar este procedimiento, extrae el corión de los embriones con pinzas bajo un microscopio estereoscópico una hora antes del momento de interés y prepara una lámina para montar hasta cuatro embriones. Luego rellena el portaobjetos con 0,7% de aros justo hasta la parte superior y espera unos 20 minutos o hasta que el aros se solidifique.

Una vez que el aros se ha solidificado, haz un pequeño agujero en los aeros usando una punta de pipeta de 200 microlitros para formar orificios cilíndricos en los que montar cada embrión. Quita los tapones aros con pinzas antes de montarlos. Coloca los embriones sobre el portaobjetos lleno de aeros bajo un microscopio de disección.

Añade 50 microlitros de trica para anestesiar. Los embriones. Utiliza pinzas para orientar los embriones invertidos en los orificios cilíndricos del aros con el cerebro o la región de interés contra la cubierta subyacente.

Los embriones en AGA subieron con otro deslizante de cubierta y se aseguraron con grasa de silicona al vacío. Los embriones ya están listos para la imagen. Fotografía del embrión usando un microscopio confocal fluorescente de barrido láser invertido como se muestra aquí, o una imagen de microscopio confocal de disco giratorio a 63 x o más para recoger imágenes de alta resolución de células individuales dentro del neuroepitelio.

Las imágenes se exportan como archivos TIF desde el software LSM y se analizan usando Photoshop. Esta es una imagen confocal representativa de un embrión de pez cebra de 24 horas, epitelio neuro entre el mesencéfalo y los ventrículos del cerebro posterior. M indica el mesencéfalo, ventrículo y H indica el ventrículo del cerebro posterior.

Cada célula está marcada con GFPE unida a membranas. Acabamos de demostrar una técnica que permite analizar el cerebro en desarrollo del pez cebra como resolución de célula única. Esta técnica nos ha permitido estudiar un nuevo tipo de cambio de forma celular llamado constricción basal de BA.

También podría utilizarse para analizar otros tipos de fenómenos y para ampliar significativamente nuestra comprensión de la organogénesis de las vértebras, así como de su biología celular subyacente. Así que eso es todo. Gracias por vernos y mucha suerte con tus experimentos.