Name: Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprende a visualizar el cerebro en desarrollo de embriones de pez cebra mediante microscopía confocal de alta resolución. Esta técnica permite el análisis de morfogénesis cerebral a nivel de célula individual en tiempo real.

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Muchas gracias a la Dra. Jennifer Gutzman que desarrolló por primera vez esta técnica en el laboratorio SIVE. Gracias también a JB Verde en el Dana-Farber Cancer Institute de Boston, MA, quien amablemente proporcionó el plásmido que codifica CAAX-GFP ARNm. La imagen confocal se llevó a cabo en las instalaciones de la Fundación WM Keck de imágenes biológicas en el Whitehead. SA, con el apoyo de NIHMH70926. EG es apoyada por un NSF beca pre-doctoral.

1. Preparación de los ARNm para inyección <ol><li> El ARNm utilizados en este procedimiento se transcribe a partir de un plásmido que codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. En primer lugar linealizar el plásmido de acuerdo con Gutzman et al, 2008. </li><li> A continuación transcribimos ARNm memGFP con el mMessage mMachine kit. </li><li> Diluir el ARNm resultante de 1μg/μl, alícuota y almacenar a -80 ° C. </li><li> Preparar un molde de inyección de agarosa al 1% con los carriles de la anchura de los embriones en la etapa de la célula. </li><li> El día antes de la inyección, creado jaulas de apareamiento que separa el macho de las hembras. </li><li> En el día de la inyección, tire agujas capilar mediante un extractor de micropipeta para preparar la inyección. </li></ol> 2. La inyección del ARNm <ol><li> En el día de la inyección, descongelar una alícuota de ARNm memGFP 1μg/μl en el hielo. </li><li> Diluir el ARNm de 1:5 en agua a una concentración final de 200ng/μl, y mantener en hielo. </li><li> La carga de la aguja capilar con 1μl de ARNm memGFP preparados en 200ng/μl. </li><li> Lugar cargado de aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector gas. </li><li> Ajustar el volumen de inyección de 1NL. </li><li> Tire de los separadores de la pesca de tipo salvaje establecido en las jaulas de apareamiento del día anterior. </li><li> Recoger los embriones tan pronto como se ponen. Orientarlos en el molde de inyección de agarosa cubierta por medio de embriones (Westerfield, 1995) con la única célula en el lado opuesto de la micromanipulador. </li><li> Inyectar a través del corion y la yema de tal manera que el ARNm es depositado directamente en la célula. Inyectar aproximadamente 50 embriones por experimento. No se inyecte, si la célula se ha dividido. </li><li> Embriones se incuban a 28 ° C durante la noche en medio de embriones </li></ol> 3. Montaje de imágenes y embriones <ol><li> Para montar la imagen y los embriones, retire el corion con las pinzas de los embriones en un estereomicroscopio una hora antes del punto en el tiempo de interés. </li><li> Prepare una diapositiva para montar hasta cuatro embriones. <ul><li> Utilice grasa de silicona para sellar al vacío un cubreobjetos en la parte inferior de una diapositiva de plástico especialmente diseñada 2mm de espesor con un agujero de aproximadamente 1 cm de diámetro. </li><li> Llenar el agujero en la diapositiva con el 0,7% de agarosa, y se deja reposar unos 20 minutos o hasta que se endurece </li><li> Una vez que la agarosa se ha solidificado, retirar un pequeño tapón con 200μl puntas de las pipetas para formar un agujero cilíndrico en el que se montará cada embrión. </li></ul></li><li> Colocar los embriones en la diapositiva llena de agarosa con un microscopio de disección. Añadir 50μl de tricaína (Westerfield, 1995) para anestesiar a los embriones. </li><li> El uso de fórceps para colocar los embriones en los agujeros cilíndricos en la agarosa con el cerebro o la región de interés sobre el cubreobjetos subyacente. </li><li> Cubrir los embriones en la agarosa con otro portaobjetos asegurado con grasa de vacío de silicona. </li><li> Imagen del embrión utilizando un invertido, fluorescentes, de escaneo láser o girando microscopio confocal de disco. Imagen de 63x o superior para obtener imágenes de alta resolución de las células individuales dentro de la neuroepithelium. </li><li> Las imágenes se exportan como archivos TIFF del software LSM y se analizaron usando Photoshop. </li></ol> 4. Resultados representante / Resultados Muestra en la Figura 1 es una imagen representativa confocal de un pez cebra neuroepitelio 24 HPF entre el cerebro medio y los ventrículos del cerebro posterior. Cada célula está marcada con GFP unido a la membrana. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> Figura 1. Imagen confocal en vivo de una inyección de 24 memGFP embrión de pez cebra HPF. (A) neuroepitelio de un embrión de 24 HPF con cada celda se indica por las buenas prácticas agrarias. Zona visualizada separa los ventrículos del cerebro medio y cerebro posterior (M, H, respectivamente), que forma el límite posterior del cerebro cerebro medio.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

En este vídeo, se demuestra un método para la inyección de ARNm en una sola célula de embriones de pez cebra. En este sentido, el uso de ARNm que codifica una membrana GFP dirigida a la etiqueta de cada célula. A continuación se muestra cómo montar y la imagen del cerebro en desarrollo con una resolución única célula. Esta técnica nos ha permitido estudiar un nuevo tipo de cambio en las células forma, constricción basal, necesario para la formación de la frontera del cerebro medio-hindbrain (Gutzman et al, 2008). Un aná...

<table><tbody><tr><td>Agarosa SeaKem GTG</td><td> Reactivo</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>Éster etílico del ácido 3-aminobenzoico (Tricaina)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Herramienta</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/fibra 100 mm</td></tr><tr><td>Grasa de vacío de silicona</td><td>Reactivo</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont n.º 5 Bio Inox</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1-200 &amp;mu;l</td><td>Herramienta</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Estos son del tamaño correcto para embriones de 24 hpf.</td></tr><tr><td>Kit de transcripción mMessage mMachine</td><td>Reactivo</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Polimerasa SP6 ARN</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido Zeiss LSM 510</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Herramienta</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Herramienta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Herramienta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

En este vídeo, se demuestra el método de nuestro laboratorio ha desarrollado para analizar los cambios en la forma celular y los reordenamientos requeridos para doblar y doblar el cerebro del pez cebra en desarrollo (Gutzman et al, 2008). Este tipo de análisis permite una nueva comprensión de la biología de las células subyacentes necesarios para el desarrollo de la estructura 3D del cerebro de los vertebrados, y aumenta de forma significativa nuestra capacidad de estudiar la morfogénesis del tubo neural. El cerebro tiene la forma de pez cebra embrionarias a partir de las 18 horas posteriores a la fecundación (HPF) en los ventrículos en el neuroepitelio inflar. Un 24 por HPF, los pasos iniciales de la morfogénesis del tubo neural se completa. Utilizando el método descrito aquí, los embriones en la etapa de una célula son inyectados con mRNA de membrana específicos de proteína verde fluorescente (memGFP). Después de la inyección y ahora de incubación, el embrión, entre 18 y 24 HPF, se monta, en posición invertida, en gel de agarosa y la imagen por microscopía confocal. En particular, el embrión de pez cebra es transparente por lo que es un sistema ideal para la proyección de imagen fluorescente. Si bien nuestro análisis se han centrado en el límite del cerebro medio-hindbrain y la parte posterior del cerebro, este método puede ser extendido para el análisis de cualquier región en el pez cebra a una profundidad de 80 a 100 micras.

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

En este video, demostramos el método que nuestro laboratorio ha desarrollado para analizar los cambios en la forma celular y los reajustes necesarios para curvar y plegar el ...

Este procedimiento comienza con la inyección de un embrión de pez cebra de una sola célula colocado en un molde de inyección de manera que la célula quede orientada en dirección opuesta al aparato de inyección. A continuación, los embriones se inyectan con ARNm mediante una aguja que atraviesa la yema y penetra en la célula. Al día siguiente.Se llena una portaobjetos plástico con aros. Luego, se coloca un embrión anestesiado invertido en un orificio en los aros y se imagina mediante microscopía confocal. Hola, soy Grabham del laboratorio de la Dra. Hazel Sieve en el Whitehead Institute for Biomedical Research y del departamento de biología del MIT.Hoy les mostraremos un procedimiento para inyectar embriones de pez cebra en la etapa de célula única y la posterior obtención de imágenes en vivo del cerebro mediante microscopía confocal. En nuestro laboratorio, utilizamos este procedimiento para estudiar la morfogénesis del cerebro de vertebrados a resolución de célula individual. Así que comencemos.El ARNm utilizado en este procedimiento se transcribe a partir de un plásmido que codifica para la proteína GFP unida a la membrana C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A. Primero, linealice el plásmido med

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

Aprende a visualizar el cerebro en desarrollo de embriones de pez cebra mediante microscopía confocal de alta resolución. Esta técnica permite el análisis de morfogénesis cerebral a nivel de célula individual en tiempo real.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

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