Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Este procedimiento comienza con el cultivo de la cepa de cebo en medios que contienen aminoácidos normales en la cepa de control SLAC y lisina y arginina isotópicas pesadas. Cantidades iguales de ambas cepas se mezclan y lisan mediante molienda y lisados de nitrógeno crudo líquido, primero granulados por centrífuga y luego aclarados por unión a perlas de esferos. A continuación, el lisado celular se une a las perlas de IgG.

Las proteínas unidas a las perlas de IgG son aludidas por proteasa, escisión y precipitadas. La muestra ya está lista para su análisis por espectrometría de masas. Hola, soy Jesse Chao, del Laboratorio Solitario del Departamento de Biología Ambiental Celular del Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Columbia Británica.

Hoy os enseñamos un procedimiento para el análisis proteómico cuantitativo llamado silak. Combinado con la purificación por afinidad. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar complejos proteicos.

Así que comencemos En este procedimiento, la cepa de cebo contiene aminoácidos normales, mientras que la cepa de control SLAC contiene isotópicos pesados, lisina y arginina. Para comenzar, primero, cultive un litro, cada una de las cepas de cebo y la cepa de control por separado al valor que se muestra en su pantalla. A continuación, vierta el cultivo en tubos de centrífuga Nalgene de 500 mililitros.

Equilibre la carga en las celdas de pellets a 2, 580 RCF, decante el medio y vuelva a suspender el pellet. Con 50 mililitros de D H2O frío mientras transfiere las celdas a 50 mililitros, tubos de centrífuga, centrifuga los tubos para pellet las celdas a 3000 RCF. En este punto, puede congelar el pellet a menos 80 grados centígrados.

Es importante recordar que debe hacer coincidir el cultivo de la cepa de control con el cultivo de la cepa de cebo uno a uno por peso de pellet seco. Vuelva a suspender cada gránulo celular en 10 mililitros de tampón NP 40 con un cóctel de inhibidores de proteasa de uno a 2000. Mezclar los dos cultivos celulares decantando directamente un tubo con el otro.

Para comenzar a moler las celdas primero, vierta nitrógeno líquido en el mortero preenfriado y deje que se evapore por completo. A continuación, añade dos mililitros de células al mortero. Vierte un poco de nitrógeno líquido para congelar las células.

Muele las células hasta que se vuelvan finas. Polvo. Repita el proceso hasta que todas las celdas estén molidas. Asegúrese de no permitir que las células se descongelen.

Agregue nitrógeno líquido cuando sea necesario. A continuación, transfiera el polvo a un vaso de precipitados helado y descongele a temperatura ambiente. Cuando los bordes comiencen a descongelarse, agregue 20 mililitros de tampón NP 40 con un PIC de uno a 200 después de que se haya descongelado.

Transfiera el lisado crudo a tubos Nalgene de 40 mililitros y haga girar a 16.000 rpm en un rotor Sovos SA 600 durante 30 minutos. Mientras espera, tome 300 microlitros de las dos perlas B de SRO y lave las perlas en 300 microlitros de tampón NP 40 tres veces. A continuación, vuelva a suspender las perlas en tampones de 300 microlitros para que estén en una suspensión uno a uno.

El siguiente paso es aclarar previamente el lisado celular. Para hacer esto, primero, transfiera la super natina a un nuevo tubo y agregue las dos cuentas B de Spheros. Incubar en una plataforma giratoria en una cámara frigorífica durante 30 minutos.

Durante la incubación, tome 300 microlitros de IgG SROs seis perlas y lave las perlas en 300 microlitros de tampón NP 40 tres veces. A continuación, vuelva a suspender las perlas en tampones de 300 microlitros para que queden en una suspensión uno a uno. Después de la incubación, granule los SRO.

Dos de ellos son cuentas. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Recuerde guardar una alícuota del lisado celular para el Western blot más adelante.

A continuación, añade las perlas de IgG. Separe el contenido en dos tubos para una unión más eficiente, incube en una plataforma giratoria en una cámara fría durante dos horas. Después de la incubación, recoja las perlas en una columna de cromatografía a cuatro grados centígrados.

Asegúrate de guardar una alícuota de la facción no desatada. Lava las cuentas con 10 mililitros. Tampón NP 40.

A continuación, lava las cuentas con tres mililitros. Búfer TEVC. De nuevo, recuerda guardar una alícuota de las cuentas.

Esto reflejará la eficiencia de la unión para eluir las cuentas. Primero, agregue cinco microlitros de A-C-T-E-V a un mililitro de tampón TEVC. Agregue tampón TEVC a las cuentas y mezcle.

Transfiera el contenido a dos tubos EINOR de 1,5 mililitros desde una mezcla más eficiente e incube en una plataforma giratoria en una cámara frigorífica durante la noche. A continuación, gire las perlas y transfiera el eluido a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Lave las perlas con 0,5 mililitros adicionales de tampón TEVC después del lavado.

Combina los ocho en un tubo. Deberías tener 1,5 mililitros de ELU ocho en total. Guarde una alícuota del TEV Elu ocho para precipitar.

Ajuste las alícuotas al 25% de TCA con un cien por ciento de TCA. Para ello, separe el LU ocho de 1,5 mililitros en dos tubos de 750 microlitros cada uno. Agregue 250 microlitros de TCA al 100% al tubo.

La solución debe volverse lechosa. A continuación, colócalo en hielo durante 30 minutos. Vorticing periódico de la mezcla después de la incubación.

Centrifugar a máxima velocidad en la centrífuga de sobremesa en una cámara frigorífica durante 30 minutos. Lavar una vez con 500 microlitros de acetona helada que contenga 0,05 de ácido clorhídrico normal. A continuación, girar durante cinco minutos a velocidad máxima a cuatro grados centígrados.

A continuación, lavar una vez con 500 microlitros de hielo frío, acetona y centrifugar durante cinco minutos a velocidad máxima a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar, retire con cuidado la acetona y el pellet seco para las manchas de plata. Vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de una vez el tampón de muestra SDS.

Si planea utilizar la proteína precipitada para el análisis basado en espectrometría de masas, se recomienda precipitar con etanol. Para hacer esto, primero agregue 20 microgramos de glucógeno, luego diluya las muestras cinco veces con etanol al cien por ciento y ajuste a bicarbonato de sodio de 50 milimolares con un caldo de 2.5 molares a pH 5.0. Mezcle la solución invirtiendo el tubo.

Déjalo reposar durante dos horas a temperatura ambiente. Por último, divide el contenido en dos tubos de einor. Granular la proteína precipitada por centrifugación durante 10 minutos a 12.000 GS a temperatura ambiente.

La alícuota guardada durante el procedimiento de purificación debe incluir el lisado celular previamente aclarado, la fracción unida, la fracción no unida y la fracción eluida. Recomendamos analizar el contenido de proteínas de las alícuotas anteriores mediante Western blot utilizando el anticuerpo Antit TAP o tinción con plata para reflejar la eficiencia de unión y elución del experimento. En este gel de tinte de plata purificado SCS dos toques en su interacción, se visualizaron los socios y se compararon con un control sin etiquetar en este Western blot.

Varias facciones tomadas durante la purificación de SCS dos tap se analizaron mediante Western blot utilizando el anticuerpo Antit tap. Obsérvese que las dos derivaciones de SCS migraron a un peso molecular más bajo después de la escisión de la proteasa elucian por TEV, y no quedaron dos derivaciones de S SCS en las perlas de IgG después de la elución. Esto confirmó que la purificación era altamente eficiente.

Acabamos de mostrarte cómo purificar complejos proteicos mediante purificación por afinidad con perlas de IgG. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de hacer coincidir la deformación base y la deformación de control por peso de pella seca antes de comenzar el procedimiento de purificación. Dado que LAC nos proporciona mediciones de imparcialidad y qued de los socios de unión a proteínas, solo llevamos a cabo la primera etapa de la purificación del grifo para minimizar la pérdida de muestra.

Si experimenta cantidades significativas de enlace no específico, es posible que desee llevar a cabo todo el protocolo, que se puede encontrar en el manual del puerto de resorte frío. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

Oye, vamos, Marcos. Ah, vete.