Focal Ca ^{2 +} Detección de transitorios en el músculo liso

Primero, se prepara una solución de carga de calcio, que se calienta y se burbujea. La vejiga urinaria se disecciona, se abre, se extiende plana y se sujeta con alfileres, y se toma una tira de detrusor. La tira de detrusor se añade a la solución de carga, se incuba y se enjuaga, luego se extiende plana y se sujeta con alfileres.

El calcio en el nivel cuatro del tejido es excitado por luz láser y se capta la luz emitida resultante. Las películas compuestas por cuadros individuales se analizan comparando cuadros sucesivos. Se sustrae el fondo.

El umbral del borde celular determina dónde pueden encontrarse los eventos y se toma una relación entre cerebros sucesivos. Si los eventos restantes coinciden con criterios predefinidos, se resaltan y etiquetan. Hola, mi nombre es John Young de los laboratorios de Keith Brain y Tom Kinane en el Departamento de Farmacología, Universidad de Oxford.

Soy Rob Amos, también de los laboratorios Brain y Canne, y mi nombre es Keith Brain. Hoy, John y Rob les mostrarán una técnica de imagen de calcio en músculo liso. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar la liberación de neurotransmisores desde nervios autónomos y su efecto sobre el músculo liso.

Así que comencemos. El indicador de calcio Organ Green, 488 BAFTA 1:00 AM, viene en viales de 500 microlitros que contienen 50 microgramos de polvo. Para preparar el indicador de calcio, añada 40 microlitros de solución Onic F1 27 al polvo y agite suavemente durante 30 segundos; después, añada 460 microlitros de solución salina fisiológica (PSS) y agite suavemente durante otros 30 segundos.

La solución final, 10 micromoles de organ verde. 4 88 BAFTA 1:00 AM proporciona cuatro alícuotas de 125 microlitros cada una. Evite la exposición a la luz y almacene la solución a menos 20 grados Celsius antes de disecar el tejido de interés.

Saques el indicador de calcio del congelador y déjelo descongelar a temperatura ambiente mientras el indicador de calcio está en estado líquido. Coloque un mililitro de PSS en un tubo de ensayo y coloque el tubo en un baño de agua a 33 grados Celsius. Fije un difusor de burbujas en el tubo de ensayo con un tapón, o también podría usar perfil, y luego burbujee con una mezcla de 95% de oxígeno a 5% de dióxido de carbono a un ritmo de aproximadamente una burbuja por segundo.

Disecar el órgano de músculo liso del animal. En este caso, es la vejiga urinaria de un ratón. Colocar el órgano en aproximadamente 50 milímetros de PSS para lavarlo; después de que el tejido haya sido lavado cuidadosamente, eliminar el tejido adiposo cieroso y el tejido conectivo.

Disecar abriendo según el tipo de músculo liso laureano para la vejiga urinaria. Abrir longitudinalmente desde el cuello de la vejiga, desde el extremo coddle hasta la parte superior de la cúpula. En el extremo craneal, preparar cuatro tiras de seis a ocho milímetros de largo y de uno a dos milímetros de ancho a lo largo de la superficie dorsal del resser, cortando en la dirección de los haces musculares predominantes.

Coloque el tejido diseccionado y el PSS precalentado y burbujeado para cargar el indicador de calcio con 125 microlitros de organ green 10 micromolar, 4 88 B a las 1:00 AM en el tejido dentro del tubo de ensayo y agítelo ligeramente a mano para mezclar. Devuelva el tubo al baño de agua. Reanude el burbujeo y cubra el baño de agua con una hoja de papel de aluminio.

El tiempo que tarda el tejido en absorber suficiente indicador de calcio varía según el tamaño del tejido y el grosor de la capa de músculo liso. Por ejemplo, para el detrusor de ratón y los oxs de rata, es de 70 minutos. En cambio, para el detrusor de rata y las VAs deens de ratón, incubamos durante 120 minutos.

Una vez que el tejido se haya cargado con el indicador de calcio, se puede preparar para la microscopía. Primero, enjuague el tejido con PSS burbujeado durante 10 minutos. A continuación, monte el tejido en un recipiente de preparación revestido con S guard.

Estirándolo ligeramente para formar una lámina plana. Fije el tejido utilizando trozos cortos, por ejemplo, dos milímetros de alambre de plata de 25 a 50 micrómetros de diámetro, e inserte las puntillas en un ángulo.

Evite usar alfileres que tengan una longitud mayor a unos pocos milímetros, ya que podrían rayar el objetivo. Es importante fijar cuidadosamente el tejido para minimizar su movimiento espontáneo y facilitar la localización de un sitio adecuado para la obtención de imágenes. Una vez que el tejido haya sido fijado, coloque el recipiente de preparación sobre la platina del microscopio.

Tenga cuidado de que el PSS no escape del área del plato revestida con sil. Esto podría provocar que una gran área quede cubierta con PSS. Cuando comience la superfusión con fines demostrativos, los siguientes pasos se realizarán a la luz.

Tenga en cuenta que estos experimentos normalmente se realizan en oscuridad. Encienda la bomba para superfusionar el preparado. Con PSS, suele utilizarse una velocidad de 100 mililitros por hora.

Encienda la unidad de calentamiento, coloque los tubos de entrada y salida y la sonda de temperatura en el recipiente de preparación, fijándolos a la tira metálica mediante el imán en su base. La altura de la punta del tubo de salida determinará la profundidad de la PSS. Tenga cuidado de asegurarse de que el flujo de salida esté eliminando efectivamente la PSS, ya que a veces no lo hace.

Establezca inicialmente la temperatura en la unidad calefactora para alcanzar la temperatura deseada entre 33 y 35 grados Celsius. Deje que el tejido se equilibre durante al menos 10 minutos con un objetivo de baja potencia. 10 o 20 veces.

Utilice fluorescencia epi o excite con luz azul para observar el músculo liso e identificar una región adecuada para monitorear. Dado que la exposición a la iluminación de excitación provocará fotoblanqueo del indicador, evite su uso por más de unos pocos segundos a la vez.

Evite áreas con estructuras brillantes porque podrían provocar un alto número de falsos positivos en el algoritmo de detección de imágenes. Intente seleccionar un sitio con movimiento mínimo y un gran número de células musculares lisas en el campo. Una vez que haya seleccionado el sitio para la imagen, cambie a un objetivo de mayor potencia, como el de 40 x.

Gire la platina o el eje óptico de modo que la célula o células de músculo liso queden en posición horizontal, es decir, paralelas al eje de escaneo rápido. Las células de músculo liso ya están listas para ser observadas mediante microscopía confocal.

En este protocolo, utilizamos un microscopio confocal vertical Leica SP dos. Cierre el diafragma hasta alcanzar un disco de Airy. Ajuste la potencia del láser entre 25 y 35 % en el filtro óptico personalizado sintonizable.

Este valor representa un equilibrio entre brillo y fotoblanqueo. Para prepararse para el análisis de datos, descargue e instale ImageJ. Descargue la versión específica para su plataforma y luego actualícela a la versión más reciente descargando el archivo jar más reciente de ImageJ para reemplazar el archivo antiguo. A continuación, descargue el archivo jar de Excel Writer e instálelo en el directorio de plugins jar.

Copie estos archivos en el directorio de complementos. Instale cada uno de estos scripts utilizando las macros de complementos. Instale la función de Image J. El software para el microscopio confocal Leica SP dos que utilizamos se llama Leica.

LCS guarda los fotogramas individuales de cada serie como archivos separados. Para reconstruir la serie, asegúrese de que todos los fotogramas que se van a reconstruir estén en una sola carpeta.

Por ejemplo, la carpeta de datos tiffs. A continuación, seleccione la macro Leica SP two stacker del menú complementos macros. Seleccione el directorio raíz, en este caso la carpeta de datos.

Seleccione la carpeta deseada de la lista desplegable. En este caso, tiffs seleccione un directorio de salida o genere uno nuevo. Por ejemplo, carpetas de datos stacks.

Luego, el script reconstruirá la serie a partir de los fotogramas individuales para corregir el movimiento. Utilizamos un algoritmo de acceso libre que alinea o empareja los fotogramas dentro de una pila de descargas, rig y turbo reg. Copie los archivos correspondientes a cada uno en la carpeta de pilas.

Cargue una pila que se procesará y luego pase a un cuadro que muestre claramente el campo de interés. Otros cuadros se alinearán con respecto a este cuadro de referencia. A continuación, vaya a complementos pilas.

Pruebe cada una de las diferentes transformaciones en el registro de pilas para determinar cuál es la más efectiva para cada sitio. Los factores de imagen que afectan la detección de transitorios de calcio variarán según ciertas propiedades medidas, así como los parámetros de partículas de cada sitio.

Se incrementan la sensibilidad y la especificidad de la detección. Por lo tanto, para cada sitio, calcularemos el umbral restado para la razón y el umbral del borde celular. Para comenzar, vaya a complementos, macros, instale y seleccione jn CTO punto oh ocho versión punto IJM JM. Luego, vaya a complementos macros cargar pila.

Seleccione una serie y calcule los siguientes parámetros de las partículas. Para calcular el umbral para la sustracción, seleccione una región rectangular de interés sobre lo que considere que es la medida del fondo. Anote la media. Para calcular el umbral para la razón, seleccione una región rectangular de interés alrededor de un área ópticamente plana de la célula o células de músculo liso.

Mida la nota hacia abajo la media y la desviación estándar. Repita el proceso otras dos veces, o puede dibujar tres cuadros a la vez presionando mayúsculas. Calcule y anote hacia abajo el umbral para la razón.

Calcule como la desviación estándar dividida por la media más uno, y luego multiplique el resultado por 32. Al promediar los valores de los tres réplicas, el factor de 32 es necesario para tener en cuenta el algoritmo de relación, donde no se produce ningún cambio respecto al cuadro anterior y se asigna un valor entero de 32. Esto proporciona un buen rango dinámico para detectar aumentos y disminuciones en la relación.

Para una imagen de ocho bits, seleccione la opción ajustar umbral de la imagen. Elija blanco y negro. Defina bajo el límite del deslizador superior y anote el valor correspondiente.

Esto está a la derecha del control deslizante. Solo se contarán los eventos que ocurran en las regiones negras. Haga clic en restablecer.

Ahora que se han calculado los umbrales para la sustracción del umbral de razón y el umbral del borde celular, podemos analizar las pilas de imágenes. Determine la ubicación de las pilas que se analizarán. Seleccione solo una serie en esta etapa.

Ese es el primer archivo, y el último archivo debe ser el mismo. A continuación, seleccione una ubicación para la salida de los archivos de datos y las pilas. Por ejemplo, la carpeta de salida de datos.

Introduzca los valores de umbral para restar el umbral de la relación y el umbral del borde celular. Deje las demás configuraciones en sus valores predeterminados. El algoritmo generará una ventana con dos paneles en la que la serie procesada se muestra a la izquierda y la original a la derecha.

Abra este archivo desde la carpeta de salida y revíselo cuidadosamente para evaluar la cantidad de falsos positivos y los casos en los que eventos visibles a simple vista no han sido detectados. Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características de los eventos detectados, como la amplitud, el área y la posición. Los falsos positivos identificados al revisar los archivos de imagen que genera el algoritmo pueden eliminarse manualmente de este archivo de Excel, aunque debe aplicar criterios estrictos al hacerlo.

Este es un vídeo de la transitoriedad del calcio en músculo liso. En este ejemplo, el vídeo consta de 100 cuadros individuales adquiridos a cinco hercios. Adquiriríamos muchos de estos vídeos por experimento al investigar, por ejemplo, el efecto de una droga particular sobre la frecuencia del transitorio de calcio.

Aquí observamos numerosos transitorios espontáneos de calcio en las células del músculo liso. Aquí se muestra el resultado del algoritmo de detección de partículas. Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características del evento detectado, como la amplitud, el área y la posición.

Así, hemos demostrado un método para obtener imágenes de los trazos de calcio en órganos de músculo liso, como la vejiga urinaria, y hemos mostrado una forma de analizar esos trazos de calcio mediante un algoritmo que hemos desarrollado en el laboratorio. Es importante recordar preparar bien el tejido para la obtención de imágenes de calcio. En el caso del tejido que mostramos hoy, esto implica eliminar el tejido conectivo y cualquier grasa que pueda obstruir el campo.

También es importante fijar el tejido en una lámina plana. Bueno, mucha suerte con sus experimentos y gracias por vernos.