Name: Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Aprende a detectar transitorios de calcio en músculo liso mediante microscopía confocal de alta resolución. Este protocolo permite analizar la liberación de neurotransmisores y su efecto sobre la contracción celular.

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El Wellcome Trust proporcionó apoyo financiero (Premio VIP para JSY y 074.128 becas de investigación a KLB). Consejo de Investigación Médica Beca de RJA Leica_SP2_Stacker, un algoritmo que se utiliza para importar archivos TIFF para la &quot;reconstrucción&quot; en una serie, se basa en Leica_tiff_sequence, un plugin para leer archivos TIFF Leica SP2 en ImageJ, desarrollado por Tony Collins y utilizado con su permiso. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg y TurboReg, los algoritmos utilizados para corregir el movimiento de los tejidos, se basan en Th venaz y sus colegas (1998) 9. Excel_writer.jar fue escrita por Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, el algoritmo de detección de partículas, se basa en un algoritmo escrito por KL cerebro y detallado anteriormente 5.

Parte 1: Preparación de la Ca 2 + indicador (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1 AM se presenta en frascos de 500 l como una pequeña cantidad (50 g) de polvo. Añadir 40 l Pluronic F-127 solución para el polvo, agitando suavemente durante 30 s, a continuación, añadir 460 l PSS, y agite suavemente durante 30 s. La solución final, 10 M Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, dispone de 4 x 125 alícuotas. Evite la exposición a la luz y almacenar a -20 º C. </li></ol> Parte 2: Ca 2 + carga <ol><li> Quitar el indicador de Ca 2 + (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) del congelador (-20 ° C) y dejar descongelar a temperatura ambiente. </li><li> Tomar 1 ml de PSS en un tubo de ensayo y coloque en baño de María. Burbuja con 95% O 2 / 5% CO 2 a una velocidad de alrededor de una burbuja que aparece por segundo. El burbujeador debe ser asegurado en el tubo de ensayo, por ejemplo, con un tapón o con Parafilm. </li><li> Disecar el tejido del animal y, en una placa de Petri Sylgard forrados, retire con cuidado el tejido conectivo. Independientemente del tipo de músculo liso de órganos, PSS debe ser reemplazado cada 10 minutos y los tejidos deben ser bien lavadas (por ejemplo, mediante la sustitución de la PSS tres veces) la disección siguiente. Para los conductos deferentes: considere cortar el órgano de longitud maneras de producir una capa de tejido. De la vejiga urinaria, se abre longitudinalmente desde el cuello de la vejiga (posterior) de la parte superior de la cúpula (anterior). Prepare cuatro tiras, 6 - 8 mm de largo y 1 a 2 mm de ancho, a lo largo de la superficie dorsal del detrusor, el corte en la dirección de los haces musculares dominantes. </li><li> Lugar en la disección de tejidos pre-calentado y burbujas &#39;PSS. </li><li> Añadir 125 l de 10 mM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM para el tubo de ensayo y darle una pequeña sacudida, a mano, mezclar. </li><li> Reanudar burbujas y se van, cubierto con papel aluminio. El tiempo que tarda para el tejido suficiente para asumir el Ca 2 + indicador varía según el tamaño del tejido y el espesor de la capa de músculo liso. Por ejemplo: 70 minutos (ratón detrusor, anococcygeus rata) a 120 minutos (detrusor rata, conducto deferente de ratón). </li></ol> Parte 3: Preparación de la &#39;Ca 2 + cargado&#39; de tejidos para microscopia Cuidado de fijación del tejido es necesario con el fin de minimizar el movimiento espontáneo de los tejidos (propiedad de las imágenes de las células del músculo liso del tejido relativamente intacto) y para facilitar la localización de un lugar adecuado para la imagen (como un pedazo de tejido puede ser encuestados en dos dimensiones, en lugar de tres). <ol><li> Enjuague el tejido en el PSS burbujas durante al menos 5 minutos. </li><li> Montar en un plato de preparación Sylgard forrado, que se extiende el tejido (un poco) para formar una lámina plana. Evite el uso de largo plazo &quot;pasadores&quot; que puedan rayar el objetivo, el uso de longitudes cortas en vez de 25 a 50 micras de plata de alambre de diámetro como &#39;pasadores&#39; e insertar en un ángulo. </li><li> Coloque el plato de preparación en la platina del microscopio, con cuidado para asegurarse de que la PSS no se escapa de la zona Sylgard revestidos de la antena (ya que esto puede conducir a una gran superficie que se cubre en el PSS, cuando el superfusión comienza). </li><li> Encienda la bomba con el fin de superfuse la preparación con PSS. A razón de 100 ml por hora se emplea a menudo. </li><li> Encender el aparato calefactor. </li><li> Coloque los tubos de entrada y salida y la sonda de temperatura en el plato preparado (colocación de cada uno para la banda de metal por el imán en su base). La altura de la punta del tubo de salida se determinará la profundidad de la PSS. Tenga cuidado para asegurarse de que la salida es en realidad la eliminación de PSS (ya que a veces no al principio). </li><li> Ajuste la temperatura en la unidad de calefacción para alcanzar la temperatura deseada, por ejemplo, 33 a 35 C. </li><li> Permitir que el tejido en reposo durante al menos 10 minutos. </li></ol> Parte 4: Selección del sitio de la imagen La exposición a la luz de excitación se photobleach el indicador, por lo que evitar el uso de más de unos pocos segundos a la vez. <ol><li> Con un objetivo de baja potencia (10x o 20x) el uso de epifluorescencia emocionante, con una luz azul, para ver el músculo liso e identificar una región adecuada para controlar. Trate de elegir un sitio basado en: el movimiento (que debe ser mínimo) y el número de células del músculo liso en el campo. &quot;Estructuras&quot; brillantes pueden causar un alto número de &quot;falsos positivos&quot; en el algoritmo de detección de imágenes, así que evite lugares con un gran número de (por ejemplo) intercalados células epiteliales o los fibroblastos. </li><li> Cambiar a un objetivo de mayor potencia (40x). </li><li> Gire el escenario o el eje óptico por lo que la célula del músculo liso (s) se encuentra horizontal (es decir, paralelo al eje de exploración rápida). </li></ol> Parte 5: La microscopía confocal Los detalles de cómo el microscopio confocal es &#39;crear&#39; son específicos para cada tipo de microscopio, perolas consideraciones más importantes son: velocidad (mínimo de 5 Hz se requiere para la mayoría de los transitorios de Ca 2 +), la resolución y el tamaño de campo (dos de los cuales son objeto de comercio-off con la velocidad). Algunos de los siguiente protocolo es específico de un microscopio confocal Leica SP2 en posición vertical. Un protocolo típico es: 100 series cuadro, adquirido a 5 Hz (256 x 256 píxeles, aproximadamente 100 x 100 micras.) O 13,5 Hz (256 x 64 píxeles, unos 100 x 25 m.). La cabeza de lectura conjunto para mover de forma bidireccional (para maximizar la velocidad de adquisición) y adquirir a 1000 Hz en cada línea. <ol><li> Cerrar el agujero de un &quot;disco de Airy. </li><li> Ajuste el láser (488 nm) de energía entre un 25 y un 35% en el AOTF, este valor es un trade-off entre el brillo y photobleaching. (Este último es un problema particular durante grabaciones de larga duración). </li><li> Adquisición de seis series por cada sitio, y desde cuatro hasta seis sitios por &quot;tratamiento&quot;. Es común la intención de observar los mismos seis sitios pre-droga (&quot;control&quot; es decir) y después de las drogas, a pesar de photobleaching significativas puede provocar que el experimentador se apartan de esto. </li><li> Es esencial con Ca 2 + de imágenes que &quot;los controles de tiempo&quot; se llevan a cabo. </li></ol> Parte 6: Preparación para el análisis <ol><li> Descargue e instale el J Imagen de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Descargue la versión específica de la plataforma, y ​​luego actualizar a la última versión descargando el último archivo de imageJ.jar de http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, sustituyendo el viejo archivo. Los usuarios de Apple Mac: si se ejecuta lentamente, asegúrese de estar usando la última versión de la máquina virtual de Java (JVM), disponible en Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Descargar Excel_writer.jar de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e instalar plugins en el [directorio] directorio jar&gt;. </li><li> Copie los siguientes archivos en el directorio Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Instalar cada una de estas secuencias de comandos con los plugins [Menú]&gt; Macros&gt; Instalar ... en función de ImageJ. </li><li> Nosotros usamos un microscopio confocal Leica SP2, el software (Leica LCS) para los que genera cada serie como un único visible &quot;película&quot; en el software, pero guarda como cuadros individuales. Para reconstruir los marcos en la serie: (i) Asegúrese de que todos los &quot;marcos&quot; para ser reconstruido en una sola carpeta (por ejemplo, &quot;DataFolder&gt; Tiffs &#39;). (Ii) Seleccionar Plugins [Menú]&gt; Macros&gt; Leica_SP2_Stacker. Seleccione el directorio raíz (por ejemplo, &quot;DataFolder &#39;). Seleccione la carpeta que desee en la lista desplegable (&quot;Tiffs / &#39;por ejemplo). Seleccione un directorio de salida o generar una nueva (&quot;DataFolder&gt; Pilas&quot;, por ejemplo). La secuencia de comandos a reconstruir la serie de imágenes individuales. </li></ol> Parte 7: Corrección para el movimiento Aunque el movimiento de las imágenes del sitio pueden minimizarse con una buena fijación y el tejido uniformemente extendido, algunos órganos del músculo liso presentan contracciones espontáneas que no puede ser abolida por cuidado depositadas en paz. A continuación se describe el uso de un algoritmo de libre disposición que se alinea o partidos marcos dentro de una serie. <ol><li> Download &#39;StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) y&#39; TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Instalar cada uno en el directorio de plugins usando los plug-ins&gt; Macros&gt; Instalar ... </li><li> Cargue una pila para ser procesado (Archivo&gt; Abrir ...) y luego pasar a un marco que muestra claramente el campo de interés. Otros marcos se alinearán con este marco de referencia. </li><li> Plugins&gt; Pilas&gt; StackReg. Intente cada uno de los diferentes &quot;transformaciones&quot; (es decir, traducción, cuerpo rígido, rotación escalado, afines) para determinar lo que es más eficaz. (Más detalles: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Parte 8: algoritmo de detección de partículas Para cada &quot;sitio&quot; imágenes, los factores variarán que afectan a la detección de Ca 2 + transitorios. Mediante la medición de ciertas propiedades de cada sitio (los &quot;parámetros de partículas&quot; - se detalla a continuación), el proceso de detección es más sencilla. Así, por cada sitio, se calcula &quot;umbral de restar&quot;, &quot;el umbral para la relación&quot; y &quot;umbral borde de la celda. <ol><li> Plugins [Menú]&gt; Macros&gt; Instalar ... y seleccione &#39;JNCT0.08Release.ijm. </li><li> Plugins [Menú]&gt; Macros&gt; pila de carga (acceso directo: l). Seleccionar una serie y calcular los parámetros de las partículas: <ol style="list-style:none;"><li> a. Umbral para la resta (fondo =) </li></ol></li><li> Seleccione un ROI rectangular sobre lo que usted cree que es &quot;de fondo&quot;. </li><li> Medida (acceso directo: m). Tome nota de media. <ol style="list-style:none;"><li> b. Calcular el umbral para la relación </li></ol></li><li> Seleccione un rectangularRetorno de la inversión en torno a un área ópticamente plana de la célula (s). </li><li> Medida (acceso directo: m). Nota DESVIACIÓN por media y estándar. </li><li> Repita dos veces más O se puede dibujar tres cajas a la vez pulsando la tecla &#39;shift&#39;. </li><li> Calcular y anotar el umbral para la relación = (1 + SD / media) x 32, con un promedio de los valores de las tres repeticiones / sitios. <ol style="list-style:none"><li> c. Celular umbral límite </li></ol></li><li> Imagen&gt; Pilas&gt; Z proyecto ... Elige el tipo de proyección: &quot;intensidad media&quot; </li><li> Imagen&gt; Ajustes&gt; Umbral. </li><li> Seleccione en blanco y negro. </li><li> Define &#39;bajo&#39; (deslizador superior) límite y anotar el valor correspondiente (a la derecha de la barra). Sólo los eventos que ocurren en las regiones negro será contado. </li><li> Haga clic en &#39;reset&#39;. </li><li> Analizar las pilas (acceso directo: 2) </li><li> Seleccionar sólo una serie en esta etapa, es decir, el archivo &#39;primero&#39; y &#39;el último archivo &quot;debe ser el mismo. </li><li> Introduzca los valores de &quot;umbral de restar&quot;, &quot;umbral de proporción&quot; y &quot;umbral borde de la celda. Deje las otras opciones en sus valores predeterminados. </li><li> El algoritmo se produce una ventana de doble panel en el que se muestra la serie de tratados sobre la izquierda y el original a la derecha. Lea cuidadosamente a través de este para evaluar el número de falsos positivos y las ocasiones en que los acontecimientos, visible a simple vista, no se han detectado. Para conseguir una detección más precisa de los transitorios de Ca 2 +, puede ser necesario ajustar ligeramente algunos de los &quot;parámetros de partículas&quot;. Si bien el proceso puede parecer un poco &quot;al azar&quot; en el primer intento, rápidamente consigue una sensación en cuanto a cuáles son los parámetros clave. </li><li> Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características de los eventos detectados (tales como la amplitud, extensión y posición). &#39;Falsos positivos&#39; - identificado mediante la revisión de los archivos de imagen que el algoritmo de salidas (por ejemplo, paso 8.17) - se puede quitar, a mano, a partir de este archivo de Excel. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
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<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Se hicieron esfuerzos para reducir al mínimo el número de animales utilizados y su sufrimiento, todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Reino Unido Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo 86/09/EEC.

Elección de los fluorescentes Ca 2 + indicador Oregon Green 488 BAPTA-1 AM fue elegido como el Ca 2 + indicador debido a que (i) es brillante en comparación con otros indicadores (por ejemplo, Fluo-4 y el verde de calcio) 1, (ii) es sensible a los cambios fisiológicos en la concentración de Ca2 + con una K d de una magnitud similar a la intracelular de Ca 2 + la concentración de [Ca 2 +] i (por ejemplo, de los conductos deferentes 2), (iii) las cargas de muchas células de músculo liso, permitiendo a las células musculares lisas de acoplamiento a ser monitoreados. Sin embargo, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM es una organización no ratioable Ca 2 + indicador, y como tal no puede ser fácilmente utilizada para determinar la absoluta [Ca 2 +] i. Además, también pueden proteger a Ca 2 + si está presente en altas concentraciones y se satura con los cambios de gran amplitud en la [Ca2 +] i. La inhibición de la contractilidad espontánea La contractilidad espontánea de los órganos del músculo liso se puede reducir farmacológicamente, por ejemplo, bloquear el movimiento de Ca 2 + a través de tipo L de Ca 2 + canales (por ejemplo: la nifedipina 3; diltiazem 4). Tenga en cuenta que estas drogas en gran medida reducir la amplitud de su conjunto de células Ca 2 + flashes / transitorios. La contracción de los vasos deferentes resultado de una combinación de la neurotransmisión principalmente purinérgicos y noradrenérgicos. Focal de Ca 2 + transitorios en este tejido, sin embargo, insensible a bloqueo de los receptores noradrenérgicos (por ejemplo, α 1 adrenérgicos, por prazosina 5) lo que el movimiento puede reducirse sin afectar focal Ca 2 + transitorios. Por otra parte, la contracción se puede prevenir &quot;aguas abajo&quot; a través de la inhibición de la quinasa por ejemplo, la cadena ligera de la miosina por wortmanina 6. Conclusiones Monitoreo Ca 2 + de fluorescencia en submicron resolución es una poderosa técnica para estudiar los efectos post-unión de la liberación de neurotransmisores 5,7 y la liberación de Ca 2 + de los almacenes internos (por ejemplo, &#39;chispas&#39; 8). El análisis de los transitorios de Ca 2 + utilizando la metodología descrita aquí es rentable en comparación con los paquetes disponibles en el mercado de análisis de imagen y permite a la medida a través de un análisis personalizado por escrito plugins de Java para ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Solución de Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>solución al 20 % en DMSO</td></tr><tr><td>Microscopio confocal vertical Leica SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aire (&amp;#8216;estación de trabajo aislada de vibraciones&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>elastómero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

focal ca 2 + detección de transitorios en el músculo liso

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + imágenes del músculo liso proporciona información sobre los mecanismos celulares que no pueden dar lugar a cambios del potencial de membrana, tales como la liberación de Ca 2 + de los almacenes internos, y permite a las células múltiples a controlar al mismo tiempo para evaluar, por ejemplo, el acoplamiento en tejido sincitial. Subcelular Ca 2 + transitorios son comunes en el músculo liso, sin embargo, son difíciles de medir con precisión la causa de los problemas causados ​​por su aparición estocástica, sobre un campo amplio de visión con frecuencia, en un órgano que lo hace propenso a contrato. Para superar este problema, hemos desarrollado una serie de protocolos y rutinas de análisis de imágenes para adquirir y analizar, de forma automatizada, la frecuencia, ubicación y amplitud de tales eventos. Si bien este método puede ser aplicado en otros contextos, nuestro trabajo consiste en detectar los locales de Ca 2 + purinérgicos transitorios para la localización de la liberación del transmisor, con resolución sub-micrométricas. ATP se libera como cotransmitter de los nervios autonómicos, donde se une a los receptores P2X1 en el músculo liso del detrusor y los vasos deferentes. Ca 2 + entra en el músculo liso, resultando en purinérgicos neuroefectoras Ca 2 + transitorios (NCTS). El centro de Ca 2 + transitorios permite la monitorización óptica de la liberación de neurotransmisores de una manera que tiene muchas ventajas sobre la electrofisiología. Aparte de la resolución espacial mejorado en gran medida, de grabación óptica tiene la ventaja adicional de permitir la grabación de la liberación del transmisor de muchos sitios de distinguir de forma simultánea. Además, el plano óptico de enfoque es más fácil de mantener o corregir durante la grabación de series de tiempo es el reposicionamiento de un microelectrodo intracelular aguda. En resumen, un método para obtener imágenes de Ca 2 + de fluorescencia se describe que los detalles de la preparación del tejido, y la adquisición y análisis de datos. Planteamos el uso de varios guiones para el análisis de tales Ca 2 + transitorios.

Detalles de los métodos de alta resolución de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Imágenes del músculo liso en órganos aislados, incluyendo: la preparación de la adquisición de imágenes de tejido y análisis de datos.

Focal Ca 2 + Detección de transitorios en el músculo liso

La obtención de imágenes de Ca2+ en el músculo liso permite comprender los mecanismos celulares que pueden no provocar cambios en el potencial de membrana, como la liberación de Ca2+...

Primero, se prepara una solución de carga de calcio, que se calienta y se burbujea. Se disecciona la vejiga urinaria, se abre, se extiende plana y se toma una tira de detrusor. La tira de detrusor se añade a la solución de carga, se incuba y se enjuaga, luego se extiende plana.El indicador de calcio dentro del tejido se excita con luz láser y se capta la luz emitida como resultado. Las películas compuestas por cuadros individuales se analizan comparando cuadros sucesivos. Se sustrae el fondo.El umbral del borde celular determina dónde pueden encontrarse los eventos y se toma una razón entre cerebros sucesivos. Si los eventos restantes coinciden con criterios predefinidos, se resaltan y etiquetan. Hola, mi nombre es John Young de los laboratorios de Keith Brain y Tom Kinane en el Departamento de Farmacología, Universidad de Oxford.Soy Rob Amos, también de los laboratorios Brain y Canne, y mi nombre es Keith Brain. Hoy, John y Rob les mostrarán una técnica de imagen de calcio en músculo liso. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar la liberación de neurotransmisores desde nervios autónomos y su efecto sobre el músculo liso.Así que comencemos. El indicador de calcio organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM, viene en viales de 500 microlitros que contienen 50 microgramos de polvo. Para preparar el indicador de calcio, añada 40 microlitros de solución Onic F1 27 al polvo y agite suavemente durante 30 segundos; después, añada 460 microlitros de solución salina fisiológica (PSS) y agite suavemente durante otros 30 segundos.La solución final, 10 micromoles de verde de órgano. 4 88 BAFTA 1:00 AM proporciona cuatro alícuotas de 125 microlitros cada una. Evite la exposición a la luz y almacene la solución a menos 20 grados Celsius antes de disecar el tejido de interés.Saquee el indicador de calcio del congelador y déjelo descongelar a temperatura ambiente mientras el indicador de calcio está en su estado óptimo. Coloque un mililitro de PSS en un tubo de ensayo y coloque el tubo en un baño de agua a 33 grados Celsius. Fije un difusor de burbujas en el tubo de ensayo con un tapón, o también podría usar perfil, y luego burbujee con una mezcla de 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono a un ritmo de aproximadamente una burbuja por segundo.Disecar el órgano de músculo liso del animal. En este caso, es la vejiga urinaria de un ratón. Colocar el órgano en aproximadamente 50 milímetros de PSS para lavarlo; después de que el tejido haya sido lavado cuidadosamente, eliminar el tejido adiposo y el tejido conectivo.Disecar abriendo según el tipo de músculo liso laureano para la vejiga urinaria. Abrir longitudinalmente desde el cuello de la vejiga, desde el extremo coddle hasta la parte superior de la cúpula. En el extremo craneal, preparar cuatro tiras de seis a ocho milímetros de largo y de uno a dos milímetros de ancho a lo largo de la superficie dorsal del resser, cortando en la dirección de los haces musculares dominantes.Coloque el tejido diseccionado y el PSS precalentado y burbujeado para cargar el indicador de calcio con 125 microlitros de organ green 10 micromolar, 4 88 B a las 1:00 AM en el tejido dentro del tubo de ensayo y agítelo ligeramente a mano para mezclar. Devuelva el tubo al baño de agua. Reanude el burbujeo y cubra el baño de agua con una hoja de papel de aluminio.El tiempo que tarda el tejido en absorber suficiente indicador de calcio varía según el tamaño del tejido y el grosor de la capa de músculo liso. Por ejemplo, para el detrusor de ratón y los oxs de rata, es de 70 minutos. En cambio, para el detrusor de rata y las VAs deens de ratón, incubamos durante 120 minutos.Una vez que el tejido se haya cargado con el indicador de calcio, puede prepararse para la microscopía. Primero, enjuague el tejido con PSS burbujeado durante 10 minutos. A continuación, monte el tejido en un recipiente de preparación revestido con malla S.Estirándolo ligeramente para formar una lámina plana. Fije el tejido utilizando trozos cortos, por ejemplo, dos milímetros de alambre de plata de 25 a 50 micrómetros de diámetro, e inserte las puntillas en un ángulo. Evite usar alfileres que tengan una longitud mayor a unos pocos milímetros, ya que podrían rayar el objetivo. Es importante fijar cuidadosamente el tejido para minimizar su movimiento espontáneo y facilitar la localización de un sitio adecuado para la obtención de imágenes. Una vez que el tejido haya sido fijado, coloque el recipiente de preparación sobre la platina del microscopio.Tenga cuidado de que el PSS no escape del área del plato revestida con sil. Esto podría provocar que una gran área quede cubierta con PSS. Cuando comience la superperfusión con fines demostrativos, los siguientes pasos se realizarán a la luz.Tenga en cuenta que estos experimentos normalmente se realizan en oscuridad. Encienda la bomba para superfusionar el preparado. Con PSS, suele utilizarse una velocidad de 100 mililitros por hora.Encienda la unidad de calentamiento, coloque los tubos de entrada y salida y la sonda de temperatura en el recipiente de preparación, fijando cada uno a la tira metálica mediante el imán en su base. La altura de la punta del tubo de salida determinará la profundidad de la PSS. Tenga cuidado de asegurarse de que el flujo de salida esté eliminando efectivamente la PSS, ya que a veces no lo hace.Establezca inicialmente la temperatura en la unidad calefactora para alcanzar la temperatura deseada entre 33 y 35 grados Celsius. Deje que el tejido se equilibre durante al menos 10 minutos con un objetivo de baja potencia. 10 o 20 veces.Utilice fluorescencia epi o excite con luz azul para observar el músculo liso e identificar una región adecuada para monitorear. Dado que la exposición a la iluminación de excitación provocará fotoblanqueo del indicador, evite su uso por más de unos pocos segundos a la vez.Evite áreas con estructuras brillantes porque podrían provocar un alto número de falsos positivos en el algoritmo de detección de imágenes. Intente seleccionar un sitio con movimiento mínimo y un gran número de células musculares lisas en el campo. Una vez que haya seleccionado el sitio para la imagen, cambie a un objetivo de mayor potencia, como el de 40 x.Gire la platina o el eje óptico de modo que la célula o células de músculo liso queden horizontales, es decir, paralelas al eje de escaneo rápido. Las células de músculo liso ya están listas para ser observadas mediante microscopía confocal.En este protocolo, utilizamos un microscopio confocal vertical Leica SP dos. Cierre el diafragma hasta alcanzar un disco de Airy. Ajuste la potencia del láser entre 25 y 35 % en el filtro óptico personalizado ajustable.Este valor representa un equilibrio entre brillo y fotoblanqueo. Para prepararse para el análisis de datos, descargue e instale ImageJ. Descargue la versión específica para su plataforma y luego actualícela a la versión más reciente descargando el archivo jar más reciente de ImageJ para reemplazar el archivo antiguo. A continuación, descargue el archivo jar de escritor de Excel e instálelo en el directorio de plugins jar.Copie estos archivos en el directorio de complementos. Instale cada uno de estos scripts utilizando las macros de complementos. Instale la función de Image J. El software para el microscopio confocal Leica SP dos que utilizamos se llama Leica.LCS guarda cuadros individuales de cada serie como un archivo separado. Para reconstruir la serie, asegúrese de que todos los cuadros que se van a reconstruir estén en una sola carpeta.Por ejemplo, la carpeta de datos tiffs. Luego seleccione la macro Leica SP two stacker del menú complementos macros. Seleccione el directorio raíz, en este caso la carpeta de datos.Seleccione la carpeta deseada de la lista desplegable. En este caso, tiffs seleccione un directorio de salida o genere uno nuevo. Por ejemplo, carpetas de datos stacks.El script luego reconstruirá la serie a partir de los fotogramas individuales para corregir el movimiento. Utilizamos un algoritmo de acceso libre que alinea o empareja los fotogramas dentro de una pila de descargas, rig y turbo reg. Copie los archivos de cada uno en la carpeta stacks.Cargue una pila que se procesará y luego pase a un cuadro que muestre claramente el campo de interés. Los demás cuadros se alinearán con respecto a este cuadro de referencia. A continuación, vaya a complementos pilas.Apile Reg. Pruebe cada una de las diferentes transformaciones para determinar cuál es la más efectiva para cada sitio. Los factores de imagen que afectan la detección de transitorios de calcio variarán según ciertas propiedades medidas, parámetros de partículas de cada sitio.Se incrementan la sensibilidad y la especificidad de la detección. Por lo tanto, para cada sitio, calcularemos el umbral para la razón restada y el umbral del borde celular. Para comenzar, vaya a complementos, macros, instale y seleccione jn CTO punto oh ocho versión punto IJM JM. Luego, vaya a complementos, macros, cargar pila.Seleccione una serie y calcule los siguientes parámetros de las partículas. Para calcular el umbral para la sustracción, seleccione una región rectangular de interés sobre lo que considere que es la medida del fondo. Anote la media. Para calcular el umbral para la razón, seleccione una región rectangular de interés alrededor de un área ópticamente plana de la célula o células de músculo liso.Mida la nota hacia abajo la media y la desviación estándar. Repita el proceso otras dos veces, o puede dibujar tres cuadros a la vez presionando mayúsculas. Calcule y anote el umbral para la razón.Calcule como la desviación estándar dividida por la media más uno, y luego multiplique el resultado por 32. Al promediar los valores de los tres réplicas, el factor de 32 es necesario para tener en cuenta el algoritmo de relación, donde no se produce ningún cambio respecto al cuadro anterior y se asigna un valor entero de 32. Esto proporciona un buen rango dinámico para detectar aumentos y disminuciones en la relación.Para una imagen de ocho bits, seleccione ajustar umbral de la imagen. Seleccione blanco y negro. Defina por debajo del límite superior de la diapositiva y anote el valor correspondiente.Esto está a la derecha del control deslizante. Solo se contarán los eventos que ocurran en las regiones negras. Haga clic en restablecer.Ahora que se han calculado los umbrales para la sustracción del umbral de razón y el umbral del borde celular, podemos analizar las pilas de imágenes. Determine la ubicación de las pilas que se analizarán. Seleccione solo una serie en esta etapa.Ese es el primer archivo, y el último archivo debe ser el mismo. A continuación, seleccione una ubicación para la salida de los archivos de datos y las pilas. Por ejemplo, la carpeta de salida de datos.Introduzca los valores de umbral para restar el umbral de la relación y el umbral del borde celular. Deje las demás configuraciones en sus valores predeterminados. El algoritmo generará una ventana con dos paneles en la que la serie procesada se muestra a la izquierda y la original a la derecha.Abra este archivo desde la carpeta de salida y revíselo cuidadosamente para evaluar la cantidad de falsos positivos y los casos en los que eventos visibles a simple vista no han sido detectados. Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características del evento detectado, como el área de la amplitud y la posición; los falsos positivos identificados al revisar los archivos de imagen que genera el algoritmo pueden eliminarse manualmente de este archivo de Excel, aunque debe tener criterios estrictos para hacerlo.Este es un vídeo de la transitoriedad del calcio en músculo liso. En este ejemplo, el vídeo consta de 100 fotogramas individuales adquiridos a cinco hercios. Adquiriríamos muchos de estos vídeos por experimento al investigar, por ejemplo, el efecto de una droga particular sobre la frecuencia del transitorio de calcio.Aquí observamos numerosos transitorios espontáneos de calcio en las células del músculo liso. Aquí se muestra el resultado del algoritmo de detección de partículas. Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características del evento detectado, como la amplitud, el área y la posición.Así, hemos demostrado un método para obtener imágenes de los trazos de calcio en órganos de músculo liso, como la vejiga urinaria, y hemos mostrado una forma de analizar esos transitorios de calcio mediante un algoritmo que hemos desarrollado en el laboratorio. Es importante recordar preparar bien el tejido para la obtención de imágenes de calcio. En el caso del tejido que mostramos hoy, esto implica eliminar el tejido conectivo y cualquier grasa que pueda obstruir el campo.También es importante fijar el tejido en una lámina plana. Buenas suerte con sus experimentos y gracias por vernos.

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