Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

Para comenzar el trasplante de lentes en pez cebra, primero se incuban durante 30 minutos donantes transgénicos que expresan GFP y huéspedes receptores silvestres en placas de Petri separadas que contienen solución de Ringer para pez cebra sin calcio. Las larvas de pez se incrustan luego en dos líneas paralelas en agarosa de punto de fusión bajo. Una línea A es para los donantes y la otra B para los huéspedes. Se elimina todo el ojo del donante, mientras que solo se extrae la lente del huésped.

Los tejidos que rodean la lente donante se eliminan antes de colocar la lente en el ojo del receptor. Después del trasplante, los peces se almacenan en placas etiquetadas de 24 pocillos. La lente trasplantada debe mostrar fluorescencia GFP en el receptor.

Por supuesto, el ojo contralateral del huésped no ha sido intervenido y no expresa GFP. Hola, soy Yj. Y yo soy Kaya McCullough, y pertenecemos al laboratorio de la Dra. Yma Maki en el Departamento de Oftalmología de la Escuela de Medicina de Harvard. Hoy les mostraremos un procedimiento de trasplante de lente en pez cebra tipo silvestre Daniel Rio.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para trasplantar lentes de animales de tipo silvestre a animales mutantes y viceversa. Esto nos permite determinar si los genes mutantes funcionan de manera autónoma o no autónoma en el cristalino. Así que comencemos.

Las cepas de pez cebra se mantienen en condiciones estándar de instalación acuícola a 28,5 grados C en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. La tarde anterior al experimento planeado, se colocan machos y hembras en un tanque con un divisor para separarlos entre sí. El genotipo de estos peces debe producir descendencia con expresión de GFP y cualquier mutación de interés. En paralelo, utilice el mismo procedimiento para establecer cruces entre animales silvestres no transgénicos dentro de una hora.

Después de que se encienda la luz por la mañana, retire los separadores para permitir que los peces se reproduzcan. Después de 15 a 30 minutos, vierta el agua del tanque en un colador para recolectar los embriones y luego lávelos con un chorro de agua para huevos proveniente de una botella de lavado en una placa de Petri de 100 por 15 milímetros. A continuación, limpie los huevos pipeteando el detrito de los embriones fertilizados y cualquier residuo.

Sustituya el agua vieja de huevo por agua nueva de huevo. Los embriones pueden almacenarse en un incubador a 28,5 grados C antes del trasplante de la lente. Cuando esté listo para continuar con el trasplante, prepare los embriones eliminando manualmente el corion.

Con una sonda metálica y un par de pinzas, los embriones decapitados deben incubarse ahora en EDTA al 0,2 % en ZFR sin calcio durante 30 minutos. Durante la incubación, pueden prepararse las agujas necesarias para la disección. El procedimiento de trasplante requiere una aguja afilada para cortar los tejidos que rodean el cristalino y embriones Woolies de agros.

También requiere una aguja roma para mover la lente donadora e insertarla en el huésped, haciendo que primero la aguja corte la punta de una pipeta Pasteur usando un cuchillo de diamante. Luego, inserte una capilar de vidrio en la punta de la pipeta Pasteur de modo que aproximadamente la mitad de su longitud quede dentro. Inserte cuidadosamente un alambre delgado de tungsteno en el extremo abierto del capilar utilizando una llama.

Derrita el vidrio sobre el alambre con pinzas, sujetando firmemente el extremo del vidrio con un alambre metálico mientras gira el otro extremo de la aguja. El vidrio ablandado debe enrollarse alrededor del metal, sujetándolo en su lugar. Esto crea una aguja roma para fabricar una aguja afilada.

Sostenga el alambre de tungsteno sobre una llama durante uno a 1,5 minutos para quemar el metal, de modo que se forme una punta muy fina. Verifique la calidad de la punta mediante microscopía.

Una punta adecuada no debe doblarse ni curvarse y debe afinarse de forma uniforme hasta un punto fino, con un diámetro no mayor de 50 micrómetros. Esterilice ambas agujas en la llama durante unos segundos y déjelas enfriar antes de comenzar el procedimiento. En un tubo cónico de plástico, prepare agarosa al 1,2 % de punto de fusión bajo y ZFR sin calcio precalentado a 40 grados C en un baño de agua a la etapa deseada. Aspire los embriones donantes con una pipeta de Pasteur y expúlselos lentamente al tubo cónico que contiene la agarosa. Incube los huevos en la agarosa durante aproximadamente cinco segundos.

Retire los embriones con la pipeta y colóquelos en fila sobre una placa de Petri de cien milímetros de poliestireno pipeteando lentamente y con cuidado; la mayoría de los embriones quedarán de costado con el ojo hacia arriba. Repita ahora este proceso con los huevos receptores y colóquelos en una fila paralela a los huevos donadores antes de que el agros se solidifique. Utilice la aguja roma para girar cualquier embrión mal orientado de modo que el ojo quede hacia arriba cuando el aros se haya solidificado.

Cubra con una solución de agarosa de punto de fusión baja al 0,2 %. Utilizando una aguja afilada, retire cualquier agarosa alrededor de los ojos y corte con mucho cuidado todo el ojo donante, que flotará a continuación. Libere el cristalino del ojo.

Esto se realiza arrastrando la aguja a través del tejido ocular desde la parte inferior hasta la superior. Solo para el huésped. El cristalino se corta utilizando movimientos pequeños con una aguja afilada, cortando lo más cerca posible del cristalino sin romperlo.

Evite retirar demasiado tejido del resto del ojo del huésped. Una vez liberadas, las lentes flotarán en el medio. Con la aguja roma, empuje cuidadosamente la lente donante justo por encima de la ubicación de la lente del huésped y luego insértela en su posición con la aguja roma.

La lente del hospedador puede descartarse. Deje los embriones donantes y del hospedador en Aros al 1,2 % durante 30 a 60 minutos. El medio para embriones ayudará a la cicatrización de la herida.

Luego, libérelos del agros utilizando la aguja metálica afilada. Transfiera los embriones a una placa de 24 pocillos con medio para embriones. Cada embrión debe ocupar un pocillo separado.

Asegúrese de etiquetar correctamente los pocillos para que quede claro qué hospedador corresponde a qué donante una vez finalizada la transferencia del cristalino. Deje que los embriones se desarrollen a 28.5 grados C hasta el momento deseado. Para la observación fenotípica, generalmente examinamos la diferenciación del cristalino dentro de uno o dos días.

La lente derivada del donante debe mantener la expresión de GFP después del trasplante en el ojo del huésped. Si un fenotipo mutante no se rescata en un entorno de tipo salvaje, esto indica que el fenotipo es autónomo. Sin embargo, si se rescata, entonces el fenotipo se considera no autónomo.

Y esto tiene implicaciones importantes en la función del gen subyacente. Acabamos de mostrarle cómo realizar el trasplante del cristalino en el embrión de pez cebra. Al realizar este procedimiento, es fundamental tener mucho cuidado al moldear las agujas y al diseccionar el cristalino mismo.

Además, los embriones deben organizarse rápidamente antes de que ocurra la rotación del huevo una vez finalizado el trasplante. No olvide añadir el medio embrionario hasta ocho en la cicatrización de madera. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.