Name: La disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a diseccionar cerebros de primates no humanos en espacio estereotáxico para estudiar la organización anatómica cerebral. Este método permite investigar el procesamiento neural relevante para la salud humana.

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Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico continuo. NSERC otorgar a MP.

Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos <ol><li> Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente exsanguinated.This es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro). </li></ol> Parte 2: estereotáxica bloqueo <ol><li> Antes de colocar la cabeza en el marco estereotáxico las coordenadas del plano cero Horsley-Clarke/interaural hay que tener. Este es el punto medio teórico entre las orejas. Para medir este plano, las barras del oído deben ser igualmente instalado en el aparato, coloque una hoja de bisturí en el brazo manipulador estereotáxica y medir el punto medio entre las barras de oído. Esto es importante para determinar dónde para bloquear el tejido sobre la base de las necesidades de investigación. Una vez completado el cráneo tiene que estar preparado para la fijación en el aparato estereotáxico. </li><li> Con el fin de colocar la cabeza en el marco estereotáxico la mandíbula inferior tendrá que ser removido con pinzas para los huesos y un bisturí. Además de la piel, músculo y tejido conjuntivo debe ser removido para exponer el cráneo. Una vez que el tejido conectivo es extraído del cráneo, exponer el cerebro por socavando la bóveda craneal (la parte de tabla del hueso occipital, así como el parietal, huesos anuncio frontal). En la parte experimento de la bóveda craneal tiene todo listo ha eliminado. Tenga cuidado de no eliminar por completo los huesos temporales, porque los canales del oído tendrá que estar intacto para colocar la cabeza en el marco estereotáxico. El resto de la materia dura debe ser removido desde el cerebro al descubierto. El cráneo está listo para ser colocado en el marco estereotáxico. </li><li> De la misma manera en la que se podría realizar una cirugía estereotáxica, ajustar el ojo, el paladar y bares del oído de tal manera que la cabeza esté bien fija en el aparato estereotáxico. Coloque el manipulador estereotáxica en las coordenadas predeterminadas anterior / posterior (A / P) y mover el manipulador de la cara lateral del cerebro. Baje lentamente la hoja en el cerebro, completamente levantar la hoja del cerebro, entonces se mueven en sentido medial e inferior de la hoja de nuevo. Repita estos dos pasos hasta que la hoja se ha llegado a la parte lateral del hemisferio opuesto. Con esto se completa el bloque de la corona en primer lugar. Para su posterior bloques coronal mover el manipulador de 1 cm en el eje A / P y repetir hasta que todo el cerebro ha sido bloqueado. </li></ol> Parte 3: Extracción del cerebro en el cráneo <ol><li> Retire el cabezal del marco estereotáxico y mantener el cerebro expuestos en la palma de su mano. Tratar de asegurar el cerebro ligeramente la colocación de mimos en el cerebro en la palma de su mano y coloque el dedo meñique a través de los lóbulos frontales, este movimiento reduce al mínimo del cerebro en el cráneo. A fin de evitar el secado de la superficie pial del cerebro, coloque un trozo de gasa humedecida PBS a través del cerebro. Mantenga la cabeza firme por el cráneo y socavar el resto de los huesos occipital y temporal, junto con la columna vertebral. Esto expone a los aspectos de base y laterales del cerebro. Por último eliminar cualquier resto de hueso frontal y el hueso nasal, lo que permitirá el acceso a los bulbos olfatorios. Es importante quitar el hueso frontal último porque, como se quita la base del cráneo, el cerebro se mueve un poco y los lóbulos frontales se pueden dañar en los bordes irregulares del hueso fontal. Cortar y retirar la restante materia dura. Levante con cuidado la parte frontal del cerebro, deslice el bisturí en el cerebro y el cerebro sin la del cráneo. </li></ol> Parte 4: Medidas <ol><li> Hay una serie de medidas útiles que se pueden hacer antes de la congelación. Por ejemplo, el eje A / P del cerebro con un calibrador. Además, la densidad específica puede ser medida por el peso del cerebro, la medición del volumen por el desplazamiento de agua en una probeta dividiendo el peso por el desplazamiento de volumen (Tabla 1). </li></ol> Parte 5: Termina bloqueo en el cerebro. <ol><li> Normalmente, cuando la hoja del bisturí se introduce en el cerebro no es lo suficientemente largo para penetrar por completo la totalidad de dorsal-ventral medida del cerebro. Una vez que se remueve el cerebro y las mediciones son brutos obtenidos, tomar un pañuelo de papel, corte la hoja y terminar bloqueando el cerebro a través de la parte ventral del cerebro (Figura 2). </li><li> Antes de la congelación de los bloques, es necesario cryoprotect el tejido de graduado soluciones de sacarosa PBS buffer (10, 20, y 30%) se mantiene a 4 ˚ C hasta que se hunde el cerebro. Normalmente se tarda una noche de incubación en el 10%, 2-3 días en el 20% y más de 3-5 días en el 30% de los bloques que se hunden hasta el fondo del recipiente. A cambio diario de the 30% de solución de sacarosa se recomienda. </li></ol> Parte 6: Resultados de Representante Hay una serie de graves medidas morfológicas que se puede hacer una vez que el cerebro ha sido extraído del cráneo. Estos incluyen una longitud / P, el peso y la densidad específica (Tabla 1). Por lo general, bloquear el cerebro en 6.7 medición de los bloques de 1 cm (Figura 1). Cada pieza se fotografiaron (Figura 2) y pueden ser más diseccionado en función de las necesidades de investigación o preparados para la congelación de soluciones de sacarosa calificado. <table border="1"><tbody><tr><td> Tema </td><td> A Longitud / P (Mm) </td><td> Peso (Gramos) </td><td> Desplazamiento de agua (Ml) </td><td> Densidad específica (G / ml) </td></tr><tr><td> O2303-2-1-1 </td><td> 64.3 </td><td> 28.1 </td><td> 24 </td><td> 1.171 </td></tr><tr><td> O5180-1 </td><td> 71.3 </td><td> 38.7 </td><td> 34 </td><td> 1.138 </td></tr><tr><td> O2708-3-1 </td><td> 62.8 </td><td> 28.7 </td><td> 26 </td><td> 1.104 </td></tr><tr><td> O9184-4-2 </td><td> 65.3 </td><td> 29.5 </td><td> 24 </td><td> 1.229 </td></tr><tr><td> N459-1-14-2 </td><td> 68.2 </td><td> 31.6 </td><td> 26 </td><td> 1.215 </td></tr><tr><td> PROMEDIO </td><td> 66.38 </td><td> 31.32 </td><td> 26.8 </td><td> 1.171 </td></tr><tr><td> ETS DEV </td><td> 3.38 </td><td> 4.33 </td><td> 4.17 </td><td> 0.052 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Bruto mediciones morfológicas del hemisferio derecho de 5 meses de edad monos verdes <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig1.jpg" alt="la figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig2.jpg" alt="la figura 1.5" /> Figura 1. Esquemas de los planos coronal utilizado para bloquear el cerebro. Este es un ejemplo de un cerebro adulto vervet externalizados. Ejemplo del procedimiento de bloqueo. Las líneas verticales aquí están espaciados a 1 cm, por lo general producen siete bloques de la corona de cada hemisferio. <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig3.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Los bloques de tejido cerebral en el espacio estereotáxico. Cada bloque se producen aproximadamente 200 secciones tomadas a 50 micras. Con este esquema de muestreo de más de 1200 secciones a través de la corteza será tomado, y un adicional de 400 a 500 del cerebelo en rodajas en el plano coronal.

<ol><li>Gallagher, M., Rapp, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+animal+models+to+study+the+effects+of+aging+on+cognition.+Annu+Rev+Psychol+48%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48.</a> , 339-370 (1997).</li>
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<li>Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+consumption+of+beverage+alcohol+by+vervet+monkeys%3A+population+screening%2C+descriptive+behavior+and+biochemical+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures.</a> Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).</li>
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<li>Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+dopamine+transporter+densities+in+alcohol-preferring+vervet+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys.</a> Neuroreport. 7, 457-462 (1996).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El San Cristóbal mono verde (Chlorocebus aethiops sabeus) es un primate del viejo mundo con patrones similares y las tasas de desarrollo del cerebro cortical y subcortical a la de los seres humanos. Esta especie ha sido utilizada para modelar complejos trastornos de la conducta humana como un comportamiento ansioso, hipertensión 8, 9 hemisferectomía, la enfermedad de Parkinson 10, la enfermedad de Alzhemier de 11, y el abuso del alcohol 12. Más recientemente, esta esp...

<table><tbody><tr><td>Escalpelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas para escalpelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Cualquier tijera quirúrgica es suficiente</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla para corte de tejidos</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

El uso de primates no humanos proporciona un excelente modelo de traslación para nuestra comprensión de los procesos de desarrollo y el envejecimiento en los seres humanos<sup&gt; 1-6</sup&gt;. Además, el uso de primates no humanos, recientemente ha dado la oportunidad de modelo natural complejo trastornos psiquiátricos como el abuso de alcohol<sup&gt; 7</sup&gt;. A continuación se describe una técnica para bloquear el cerebro en el plano coronal del mono verde (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;) En el cráneo intacto en el espacio estereotáxico. El método descrito aquí proporciona un plano estándar de la sección entre los bloques y los temas y minimiza las secciones parciales entre los bloques. Seccionar un bloque de tejido en el plano coronal también facilita la delimitación de un área de interés. Este método proporciona bloques de tamaño manejable desde un solo hemisferio de los monos verdes se obtienen más de 1200 secciones en corte a 50 micras. Además mediante el bloqueo del cerebro en bloques de 1 cm, que facilita la penetración de la sacarosa para cyroprotection y permite que el bloque a cortar en un criostato estándar.

Los primates no humanos es una importante especie de traslación para nuestra comprensión del proceso normal del cerebro. La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos.

La disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica

El uso de primates no humanos proporciona un excelente modelo traslacional para nuestra comprensión de los procesos de desarrollo y envejecimiento en los seres humanos1-6. En ...

Este procedimiento comienza con una cabeza de mono bien perfundida. Tras la eliminación del cráneo, la cabeza se coloca en el marco estereotáxico y se realizan una serie de cortes coronales estereotáxicos con el brazo manipulador; luego se extrae el cerebro, se mide y se protege mediante criopreservación. Hola, soy el Dr. Mark Burke del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal.Soy la Dra. Shaheen Zur, también del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Soy el Dr. Mo Petto, director del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hoy les mostraremos un procedimiento para bloquear el cerebro de primates no humanos en el espacio estereotáctico.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar diversos aspectos de la organización cerebral en el desarrollo normal y en respuesta a alteraciones durante el desarrollo. Comencemos. Este protocolo comienza tras la eutanasia, fijación y decapitación de un mono vervet.Antes de la extracción del cerebro, se debe preparar el marco estereotáxico. Primero es necesario encontrar las coordenadas del plano interoral cero de Horsley-Clark o el punto medio teórico entre las orejas. Para medir este plano, coloque las barras auditivas de forma equitativa en el aparato.Luego, coloque una hoja de bisturí en el brazo del manipulador estereotáxico y mida el punto medio entre las barras auriculares. A continuación, prepare la cabeza para colocarla en el marco estereotáxico. Utilice rgo óseo y un bisturí para retirar la mandíbula inferior.En este punto, desprenda cualquier resto de calvario durante estos pasos. Tenga cuidado de no eliminar los huesos temporales, ya que necesitará los conductos auditivos intactos para fijar la cabeza en el marco estereotáxico. Utilizando fórceps y tijeras, corte con cuidado la duramadre visible del cerebro expuesto.Ahora el cráneo está listo para colocarse en el manipulador estereotáxico. Para comenzar el bloqueo estereotáxico del cerebro, coloque la cabeza en el marco, ajuste la paleta ocular y las barras auriculares como lo haría para una cirugía estereotáxica. Coloque el manipulador estereotáxico en el eje predeterminado anterior, posterior o AP.Para comenzar a bloquear el cerebro, coloque el manipulador en el lado extremo izquierdo o derecho del cerebro y baje la cuchilla para realizar el primer corte. La cuchilla estará perpendicular a la línea media del cerebro, cortando en el plano coronal.Eleve la cuchilla para despejar completamente la superficie del cerebro. Luego, muévala medialmente hasta que se superponga ligeramente al primer corte y baje la cuchilla nuevamente. Continúe realizando cortes superpuestos hasta llegar al borde opuesto del cerebro.Esto completa el primer bloque coronal. Mueva el manipulador un centímetro hacia adelante o hacia atrás a lo largo del eje AP y realice otra serie de cortes en el plano coronal paralelos a los anteriores. Continúe de esta manera hasta que haya bloqueado todo el cerebro.Ahora que ha terminado de cortar, es momento de extraer el cerebro del cráneo. Primero, saque la cabeza del marco. Intente sujetar el cerebro suavemente acunándolo en la palma de su mano para evitar que se mueva dentro del cráneo y se dañe.Coloque su dedo meñique sobre los lóbulos frontales para evitar que la superficie del cerebro se seque. Humedezca un trozo de gasa con PBS y colóquelo sobre el cerebro. Sujete firmemente la cabeza por el cráneo y desprenda los huesos occipital y temporal restantes junto con la columna vertebral.Esto expone las caras basal y lateral del cerebro. Ahora retire la duramadre restante. Por último, retire el hueso nasal y cualquier hueso frontal residual, lo que permitirá el acceso a los bulbos olfatorios.Es importante retirar el hueso frontal. Por último, porque al eliminar la base del cráneo, el cerebro se mueve ligeramente y los bordes irregulares del hueso frontal podrían dañar los lóbulos frontales.Retire cuidadosamente cualquier resto de duramadre, levante suavemente la parte frontal del cerebro, deslice el escalpelo por debajo del cerebro y suéltelo del cráneo. Permanecerá unido como una cebolla cortada por el tallo, ya que la hoja de corte no llega completamente hasta el lado ventral. Hay varias mediciones útiles que puede realizar antes de congelar el cerebro.Primero, se puede utilizar un calibre para medir el eje AP del cerebro. A continuación, determine su densidad específica y pese el cerebro. Luego, mida el volumen mediante el desplazamiento de agua en una probeta graduada.Ahora tiene la densidad, masa dividida por volumen. Ahora que ha realizado mediciones en todo el cerebro, es momento de liberar los bloques individuales de tejido de donde están adheridos en el lado ventral del cerebro y prepararlos para su congelación. Tome una cuchilla para seccionar tejidos y extienda cada corte a través del lado ventral del cerebro, liberando así los bloques.Un calibrador puede utilizarse para medir los AE medial, lateral y anteroposterior. Los bloques cerebrales ya están listos para ser crioprotegidos y congelados. Acabamos de mostrarle cómo bloquear un cerebro de primate no humano en el espacio estereotáxico.Al realizar este procedimiento, es importante retraer completamente la hoja antes de realizar cualquier movimiento medial lateral con un manipulador estereotáxico. Además, al eliminar los huesos del cerebro, tenga cuidado de no dañar la corteza con los ER. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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