Name: La puerta de enlace para el cerebro: la disección de los ojos de Primates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende a diseccionar la retina de primates no humanos para estudiar la organización retiniana en neurociencia. Este método permite analizar el desarrollo normal y las alteraciones patológicas en modelos de envejecimiento.

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Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico. Estamos muy agradecidos a Frank Ervin, Palmour Roberta y el personal de Laboratorios de Ciencias del Comportamiento fundación con sede en San Cristóbal, de las Indias Occidentales, por su continuo apoyo a nuestro trabajo de primates.

Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos <ol><li> Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. Se recomienda que, poco después del sacrificio de los ojos se inyectan con un fijador justo debajo de la lente y se almacena en el fijador. </li><li> En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado. Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro). </li></ol> Parte 2: Extracción del globo ocular de la cavidad orbital <ol><li> Para facilitar el acceso al globo ocular, se recomienda retirar primero el cerebro. Una vez que el cerebro se ha quitado el hueso órbita de paredes delgadas es evidente. Utilice la gubia ósea para chips lentamente la pared de la órbita. Cortar los músculos oculares con un bisturí y extirpar el tejido conectivo del globo ocular. Corte cuidadosamente el nervio óptico, esto puede ser utilizado en los estudios de microscopía electrónica. El globo del ojo ya debería ser liberado de la cavidad orbital. </li></ol> Parte 3: Disección de la retina de la ojera <ol><li> Coloque el ojo en una placa de Petri con PBS para mantener la retina de secado. Un microscopio de disección o una mesa montada aumento de pie de luz es muy útil en la disección, pero no una necesidad. Retire la córnea mediante la reducción de la esclerótica de cerca en el perímetro de la córnea a nivel de la ora serrata, con un par de tijeras de primavera y quitar la lente con la pinza. </li><li> Use un pincel, pinzas y tijeras de primavera para eliminar la retina de la esclerótica. Esto se hace mediante la separación de la retina de la esclerótica y luego cortar la esclerótica de distancia con las tijeras. Uno debe llevar a cabo este proceso en pequeños incrementos para no dañar o romper el tejido de la retina. La esclerótica no se separa fácilmente del nervio óptico remanente para cortar cuidadosamente la esclerótica alrededor del nervio óptico. </li><li> En este punto de la retina ha conservado su forma curva y tiene que ser aplastada para el muestreo. Antes del aplanamiento de la retina, el humor vítreo, que tiene la consistencia de la gelatina, se puede quitar en un bulto. Para aplanar la retina en una diapositiva, hacer varios cortes radiales con una hoja de bisturí. El humor vítreo residual ahora se puede quitar con papel de filtro ordinario y un pincel. La capa de células ganglionares de la retina se expone en este momento lo que es imprescindible que tenga cuidado al retirar el humor vítreo. Si el nervio óptico está todavía unido en el disco óptico, quite el nervio óptico sin necesidad de digitalizar la retina, utilizando un bisturí y un par de tijeras de primavera. Esta es ahora una retina plana de montaje (Figura 1) y la fóvea debe ser evidente que una mancha oscura en la dirección temporal / ventral de la papila óptica. </li></ol> Parte 4: Muestreo <ol><li> Hay una serie de opciones para el muestreo de la retina. Aquí vamos a describir la preparación y toma de muestras flatmount isodentric. En ambos procedimientos flatmount la retina con la capa de fibra óptica fuera de la diapositiva. Si la intención es examinar la capa de células ganglionares de la retina en la preparación flatmount, es necesario quitar uno o blanquear el epitelio pigmentado. Para quitar el epitelio pigmentado utilizar un pincel ligeramente para eliminar parte de esta capa, lo que tiende a dañar la capa de fotorreceptores. Blanqueo implica sumergir la retina en una solución de permanganato de potasio (0,25%) durante 1 hora, lavar en agua destilada, y la limpieza en ácido oxálico (5%) durante 5 minutos 2. </li><li> Si la intención es analizar la distribución de células y la morfología de cada capa en toda la retina, entonces le sugerimos muestreo isométrica de la retina. La retina se debe flatmounted en un portaobjetos y se mantiene húmeda, con PBS. Para el muestreo isométrica cortar pequeños trozos de tejido equidistante de la papila óptica en las direcciones nasal, temporal, superior e inferior (Figura 1). No es necesario para blanquear el epitelio pigmentado en esta preparación. Estas piezas ahora se puede seccionar en el plano coronal con un criostato, vibratome o ultramicrotomo en función de la pregunta de investigación. Para la sección criostato, las piezas deben ser crioprotegieron en sacarosa al 30% durante la noche y se congeló en el contexto de un medio de montaje en hielo seco. Por otra parte, las muestras se pueden incrustar en agar y en rodajas en una vibratome. El criostato y preparaciones vibratome fiable dará secciones tan delgadas como 4 m. Si las secciones más finas son necesarias (por ejemplo, para la preparación del microscopio electrónico), es necesario preparar las muestras para el ultramicrotomo. Para ello, las secciones deben ser después de la fijada en tetróxido de osmio durante 1 hora bajo el fumehood. Esto es seguido por deshidratación en una serie gradual de etanol (50, 70, 95, 95, 100, 100%) y el 100% de óxido de propileno. El tejidose incrusta en Epon (incrustar-812 Kit de incorporación). </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: En nuestro laboratorio, que habitualmente realizan técnicas de inmunohistoquímica sobre retinas cryosectioned (Figura 2). En este caso estamos interesados ​​en la isodensidades de los receptores cannabinoides (CB1) en la retina del primate. También examinamos los efectos de la exposición prenatal al alcohol en el sistema visual de los primates. Con este fin, estamos interesados ​​en la densidad celular y el espesor de la capa en la fóvea y en la retina periférica. Para lograr esto, integrar las piezas de la retina en Epon, el tramo a 700 nm en un ultramicrotomo, y se tiñen con azul de toluidina al 1% (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1 Retina Flatmount. Cortes radiales se utilizan para aplanar la retina. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2 inmunotinción. Criosección de la retina periférica immunostained de CB1 en las células ganglionares de la retina están fuertemente marcadas con un etiquetado en las capas nucleares interna y externa. El espesor de esta sección es de 14 metros y se tiñeron en la diapositiva. RG - capa ganglionares de la retina; IP - capa plexiforme interna, IN - capa nuclear interna, OP - capa externa plexiforme; ON - la capa nuclear externa. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="la figura 3" /> Figura 3 Fovea. Corte a través de la fóvea que se incrustó en Epon y en rodajas en una ultramicrotrome a 700 nm. La capa de fotorreceptores (PR) para alinear las secciones. Tenga en cuenta que toda la extensión de los fotorreceptores se pueden identificar lo que indica un ángulo adecuado en el plano coronal. Mediciones de densidad se tomaron a 300 m, 500 m, y 800 m del centro de la fosa foveal utilizando el sistema de imagen Bioquant. RG - capa ganglionares de la retina; IP - capa plexiforme interna, IN - capa nuclear interna, OP - capa externa plexiforme; ON - la capa nuclear externa, barra de escala = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

La preparación de la retina como un wholemount permite el análisis de la topografía y la distribución espacial de cualquiera de la capa de células ganglionares y las células endoteliales de los vasos sanguíneos de la retina 3. La cuantificación de la densidad de las células en la periferia de la retina de los primates se logra fácilmente. Sin embargo, en las regiones perifoveal y foveal, el apilamiento de múltiples capas en la capa de células ganglionares obstruye la cuantificación. Para evitar este sesgo pot...

<table><tbody><tr><td>Escalpelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas para escalpelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Cualquier tipo de tijeras quirúrgicas es suficiente</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de pelo de camello o marta</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la puerta de enlace para el cerebro: la disección de los ojos de primates

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

El sistema visual en el ser humano se considera la puerta de entrada a todo el mundo y desempeña un papel principal en la gran cantidad de procesos sensoriales, perceptivos y cognitivos. Por lo tanto, no es sorprendente que la calidad de la visión está ligada a la calidad de vida. A pesar de la investigación clínica y básica general sobre las causas de los trastornos visuales, muchas formas de discapacidad visual, como la retinitis pigmentosa y la degeneración macular, la falta de tratamientos efectivos. Los primates no humanos tienen más características generales del desarrollo del ojo a la de los seres humanos. No sólo tienen una anatomía vascular similar, pero entre los otros mamíferos, los primates tienen la característica única de tener una región en la retina temporal especializados de alta agudeza visual, la fóvea<sup&gt; 1</sup&gt;. A continuación se describe una técnica general para la disección de la retina de primates para proporcionar tejidos para histología, inmunohistoquímica, microdisección láser captura, así como la luz y microscopía electrónica. Con el uso extendido de los primates no humanos, como un modelo de traducción, nuestra esperanza es que una mejor comprensión de la retina se proporciona una visión de enfoques eficaces para atenuar o revertir los efectos negativos de los trastornos visuales en la calidad de vida de las personas afectadas.

Los primates no humanos es una importante especie de traslación para nuestra comprensión del desarrollo y el envejecimiento. La organización anatómica de la retina de primates pueden proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos.

La puerta de enlace para el cerebro: la disección de los ojos de Primates

El sistema visual en los seres humanos se considera la puerta de entrada al mundo y desempeña un papel fundamental en la plétora de procesos sensoriales, perceptuales y cognitivos...

Este procedimiento comienza con una cabeza de mono bien perfundida. Tras la extracción del cerebro, se extraen y conectan los globos oculares. A continuación, se elimina el tejido circundante, y se retiran cuidadosamente la córnea, el cristalino, la esclerótica y el humor vítreo, liberando así la retina.La retina se coloca plana sobre un portaobjetos de vidrio y se elimina el humor vítreo restante. Luego se toman muestras de Iso Dentrix y se protegen mediante criopreservación. Hola, soy el Dr. Mark Burke del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal.Hola, soy la Dra. Shaheen Zur, también del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hola, soy el Dr. Tito, director del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hoy les mostraremos un procedimiento para diseccionar una retina de primate no humano.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar diversos aspectos de la organización retiniana en el desarrollo normal y en respuesta a intrusiones durante el desarrollo. Así que comencemos. Inicie este protocolo con la cabeza de primate, que previamente ha perfundido.Bueno, con un fijador como el paraformaldehído, la retina que se va a disecar aquí se obtiene de un mono vervet. Para asegurar la preservación del ojo, se puede inyectar un fijador como el paraformaldehído justo debajo del cristalino. La cabeza debe almacenarse en fijador o PBS antes de proceder a extraer los bulbos oculares para obtener un acceso más fácil al globo ocular.Primero, retire el cerebro. Para ver este procedimiento, consulte nuestro reciente artículo de JoVE sobre la disección del cerebro de primates no humanos en el espacio estereotáxico. Una vez retirado el cerebro, el hueso delgado de la órbita es claramente visible.Utilice fórceps óseos para desgastar lentamente la pared de la órbita. Use un escalpelo para cortar los músculos oculares y eliminar el tejido conectivo del globo ocular. Finalmente, corte cuidadosamente el nervio óptico para liberar el globo ocular de la cavidad orbitaria.Ahora que el globo ocular está liberado, se puede extraer la retina. Para retirar la retina, primero coloque el ojo en una placa de Petri llena de PBS para evitar que la retina se seque. Comience por retirar la córnea. Utilice un par de tijeras de resorte y corte la esclerótica cerca del perímetro de la córnea, al nivel de la ora serrata.Utilizando pinzas, retire el cristalino. Finalmente, para separar la retina de la esclerótica, use un pincel, pinzas y tijeras de resorte.Se pare la retina de la esclerótica y luego corte la esclerótica con las tijeras. Este proceso debe realizarse en pequeños incrementos para evitar dañar o rasgar el tejido retiniano. La esclerótica no se separa fácilmente del nervio óptico remanente.Corte cuidadosamente la esclerótica alrededor del nervio óptico. La retina mantiene su forma curva. Retire el humor vítreo, de consistencia gelatinosa, de una sola pieza.La retina ya está lista para ser montada y muestreada. Para aplanar la retina sobre un portaobjetos, realice varios cortes radiales con una hoja de bisturí. Utilice papel de filtro común y un pincel para eliminar el humor vítreo residual.Es fundamental ser cuidadoso al realizar este paso, ya que expone la capa de células ganglionares de la retina. Verifique si el nervio óptico aún está unido en el disco óptico. Utilice una hoja de bisturí y un par de tijeras de resorte para eliminar el nervio óptico sin desgarrar la retina.Ahora monte plana la retina sobre una portaobjetos de vidrio de dos por tres pulgadas con la capa de células ganglionares de la retina orientada lejos del portaobjetos. La fóvea es ahora evidente como una zona oscura en la dirección ventral temporal respecto al disco óptico. Para examinar la capa de células ganglionares de la retina, puede ser necesario eliminar o blanquear el epitelio pigmentado.Utilice un pincel para eliminar ligeramente algo del epitelio pigmentado. Tenga en cuenta que este método tiende a dañar la capa de fotorreceptores. Examinar la distribución celular y la morfología de cada capa en toda la retina requiere un muestreo isométrico de la retina.Comience montando en plano la retina sobre un portaobjetos y agregue PBS para mantener la retina húmeda. Luego, corte pequeños fragmentos de tejido equidistantes del disco óptico en las direcciones nasal, temporal, superior e inferior. Estos fragmentos ahora pueden seccionarse en el plano coronal con un criostato, vibrátomo o ultramicrotomo.Dependiendo de la pregunta de investigación. Para el corte en criostato, los fragmentos deben ser crioprotegidos en sacarosa al 30 % en tampón fosfato durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de la incubación nocturna, congele los fragmentos de retina en un medio de montaje sobre hielo seco.Utilice el criostato para obtener secciones de hasta cuatro micrones de grosor. En nuestro laboratorio, realizamos rutinariamente inmunohistoquímica en secciones criostáticas de retina. En este caso, estamos interesados en la iso densidad de los receptores cannabinoideos en la retina de primates.También examinamos los efectos de la exposición prenatal al etanol en el sistema visual de primates. Con este fin, nos interesa la densidad celular y el grosor de las capas en la fóvea y en la retina periférica. Para lograrlo, incluimos fragmentos de retina en epón y realizamos cortes de 700 nanómetros en un ultramicrotomo, teñidos con azul de toluidina al 1%.Acabamos de mostrarle cómo diseccionar una retina de primate. Al realizar este procedimiento, es importante recordar no dañar las células ganglionares retinianas, la capa celular o las capas de fotorreceptores. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

Los primates no humanos es una importante especie de traslación para nuestra comprensión del proceso normal del cerebro. La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos.

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