Name: Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Aprende a inducir diferenciación lactogénica en células epiteliales mamarias HC11 de ratón mediante la formación de mammospheres. Este protocolo permite cuantificar la diferenciación usando microscopía de contraste de fase.

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Fondos de el Congreso de Investigación Médica Dirigida subvención del Fondo (DAMD17-01-0264) a ML Cutler y militar de Estados Unidos Instituto de Cáncer de ML Cutler apoyó el trabajo.

<ol><li> El HC11 células fueron cultivadas hasta confluencia durante 6 días en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, insulina 5μg/ml, HEPES 10 mM, el factor de 10ng/ml crecimiento epidérmico (EGF) la debida competencia. </li><li> Las células fueron lavadas con PBS y se mantiene en los medios de crecimiento sin EGF durante 24 horas. </li><li> Para inducir la diferenciación lactogénica las células fueron incubadas en medio de diferenciación, es decir, RPMI con dexametasona (10 -6 M), insulina (5 mg / ml) y la prolactina (5 mg / ml) se refiere a disminuir a medida. </li><li> En el momento indicado post-DIP Además, mammospheres fueron fotografiados y se enumeran por microscopía de contraste de fase con una Olympus IX71 microscopio con cámara digital. </li></ol> Los resultados representativos: Ampliación de potencia bajo de lo normal monocapas de células epiteliales mamarias y mammospheres múltiples, así como la ampliación de potencia de alta de un mammosphere solo se muestran en la Figura 1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> Figura 1. Mammospheres. (A) Normal monocapas de células epiteliales mamarias debe mostrarse como una capa plana de células confluentes. (B) Después de 3-5 días de estimulación DIP mammospheres aparecen múltiples. Fotografía tomada 5 días post DIP adición. (C) Mayor aumento de un solo campo que contiene mammospheres menos 5 días después de la DIP adición.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Para que esta técnica tenga éxito y sea de la mejor calidad, las células epiteliales se debe mantener en la confluencia antes de ser inducido con hormonas lactogénica. Puede haber situaciones en las que se mammospheres numerosas, lo que hace difícil la cuantificación. Por lo tanto, a efectos cuantitativos, es mejor para fotografiar el mammospheres en un punto de tiempo cuando el número de mammospheres es capaz de ser contados. Si bien existen diversos marcadores moleculares para determinar e...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

células epiteliales mamarias de ratón forma mammospheres durante la diferenciación lactogénica

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A medida fenotípica comúnmente utilizado para determinar el grado de diferenciación en lactogénica mamario de ratón cultivos de células epiteliales es la formación de estructuras en forma de cúpula de la célula conocida como mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. La línea celular HC11 ha sido empleado como un sistema modelo para el estudio de la regulación de la diferenciación mamaria lactogénica tanto<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. El HC11 células se diferencian y sintetizar las proteínas de la leche en respuesta al tratamiento con hormonas lactogénica. Tras el crecimiento de la HC11 ratón las células epiteliales mamarias a la confluencia, la diferenciación lactogénica fue inducida por la adición de una combinación de hormonas lactogénica incluyendo la dexametasona, insulina y prolactina, que se refiere a disminuir a medida. El HC11 células inducidas a diferenciarse fueron fotografiados, a veces hasta 120 horas después de la inducción de la diferenciación y el número de mammospheres que aparecieron en cada cultura se enumeran. El tamaño de la mammospheres individuo se correlaciona con el grado de diferenciación y esto se muestra en las imágenes de la diferenciación de las células.

HC11 diferenciación lactogénica se caracteriza por la formación de estructuras abovedadas conocida como mammospheres. Las estructuras se pueden enumerar por microscopía de contraste de fases para ayudar en la cuantificación de la diferenciación lactogénica.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

Una medida fenotípica comúnmente utilizada para determinar el grado de diferenciación lactogénica en cultivos de células epiteliales mamarias de ratón es la formación de...

Hola, soy Bethany Morrison del laboratorio de la Dra. Mary Lou Cutler en el Departamento de Patología de la Universidad de Servicios Uniformados de las Ciencias de la Salud. Hoy les mostraremos un procedimiento para el desarrollo de mamósferas a partir de células epiteliales mamarias de ratón HC 11. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la diferenciación lactante.Así que comencemos. Para iniciar este protocolo, las células HC 11 se cultivan hasta alcanzar confluencia durante seis días en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 5 microgramos por mililitro de insulina, 10 micromolar de Heiss y 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico (EGF), para establecer competencia.Estas células han sido ampliamente utilizadas por los laboratorios de Nancy Hines y Bernard Groner para estudiar la regulación de la diferenciación génica en la cabina de cultivo celular. A continuación, las células se lavan con PBS y se mantienen en medio de crecimiento sin EGF durante 24 horas. Tras esta incubación, las células se incuban en medio de diferenciación compuesto por RPMI suplementado con dexametasona, insulina y prolactina para inducir la diferenciación lactógena tras la incubación.En el medio de diferenciación, se utiliza un microscopio Olympus IX 71 equipado con una cámara digital para fotografiar y enumerar las esferas de mamo. Mediante microscopía de contraste de fases, las esferas de mamo se fotografían y cuentan varias veces durante las 120 horas posteriores a la inducción. Esta imagen muestra una ampliación de baja potencia de una memoria normal.Las células de monocapa de células epiteliales deben mantenerse confluentes durante aproximadamente tres días antes de la estimulación con hormonas genéticas. A continuación se muestra un vistazo a las nuevas esferas mamarias formadas tres días después de la inducción, con un aumento de baja potencia. Comienzan a aparecer como pequeñas estructuras en forma de cúpula distribuidas aleatoriamente entre las células epiteliales.Nuevamente con bajo aumento. Aquí se observa múltiples mamósferas que se han desarrollado cinco días después de la inducción. Las mamósferas han continuado creciendo tanto en tamaño como en número; aquí, con alto aumento, puede observarse claramente la característica burbuja o forma de cúpula de la mamósfera.Acabamos de mostrarle cómo inducir células epiteliales de memoria, para que formen esferoides mamarios, que se utilizan como marcadores de diferenciación glandular. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en confluencia antes de la inducción, porque durante este tiempo las células producen proteínas de matriz con las que necesitan interactuar para estar completamente preparadas para responder a las hormonas glandulares. También es importante recordar eliminar el EGF del medio antes del tratamiento, porque el EGF inhibirá el proceso de diferenciación.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.

Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

Este video describe el aislamiento de células madre cancerosas de líneas celulares de cáncer de mama. Cultivamos estas células madre cancerosas para generar mamósferas primarias para evaluar la autorrenovación y calcular la eficiencia de formación de esferas, lo que permite la comparación entre diferentes densidades de siembra.

Generación de mamósferas primarias: una técnica para determinar la potencia celular

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Los ensayos de mama flotante pueden investigar el subconjunto de células de cáncer de mama similares a las células madre que sobreviven en condiciones de suspensión y muestran una tumorigénesis mejorada cuando se implantan en ratones.  Este protocolo proporciona una medida in vitro conveniente de la capacidad de formación de esferas, un indicador de la tumorigénesis in vivo, al tiempo que facilita el análisis del panorama transcripcional asociado al tallo.

Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Describimos técnicas para la inducción de diferenciación de dos líneas epiteliales mamarias, HC11 y EpH4. Mientras que ambos requieren suero de ternero fetal, insulina y prolactina para producir proteínas de la leche, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en mamesferas en cultivo tridimensional. Estos modelos complementarios son útiles para estudios de transducción de señales de diferenciación y neoplasia.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Aquí, describimos la implementación e interpretación de los resultados de un ensayo cuantitativo de autorenovación de la mamismo in vitro.

Cuantificación de la auto-renovación en las culturas de la maméfera de la muriña

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Este protocolo describe el método para establecer el ensayo de formación de la mamosfera para estudiar el cáncer inducido por inhibidor de la apoptosis 5 (Api5) en células epiteliales mamarias no tumorígenas. Los lisados recogidos de mamósferas de generación primaria se analizan en busca de diferentes marcadores de tallo para evaluar la inducción de propiedades similares a las de células madre.

El ensayo de mamosera revela el tallo inducido por Api5 en líneas celulares epiteliales mamarias no tumorígenas

Aprende a inducir diferenciación lactogénica en células epiteliales mamarias HC11 de ratón mediante la formación de mammospheres. Este protocolo permite cuantificar la diferenciación usando microscopía de contraste de fase.

Células epiteliales mamarias de ratón forma Mammospheres durante la diferenciación lactogénica

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