La preparación estandarizada de un solo suspensiones de células de tejido pulmonar de ratón con el disociador gentleMACS

En este protocolo de vídeo, verá cómo disociar el tejido pulmonar de un ratón adulto utilizando un máximo suave después de la disociación del tejido pulmonar. En presencia de colagenasa d y ADN, las suspensiones de una célula se filtran utilizando una centrífuga de filtro celular de 70 micras y se suspenden para aplicaciones posteriores. Hola, soy Melanie Mlu de Mil Biotech en Alemania.

Hoy les mostraré un procedimiento reproducible y automatizado para la preparación de una suspensión de una sola célula a partir de tejido pulmonar de ratón mediante el uso de la disociación GenX. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para preparar suspensiones unicelulares para la preparación de leucocitos o células endoteliales. Bien, comencemos.

Antes de comenzar el protocolo, algunas soluciones estándar deben estar preparadas y listas. En primer lugar, necesitaremos el búfer de Hebes. En segundo lugar, una solución de colagenasa D que contiene 100 miligramos por mililitro de enzima y tampón hebes.

En tercer lugar, una solución de dase one que contiene 20.000 unidades por mililitro de dase one. Por último, dos soluciones comunes de almacenamiento en búfer. Un tampón PBS típico a pH 7,2 y un tampón PEB derivado de la solución de enjuague AutoMax y la solución madre BSA.

Comenzamos nuestro protocolo con un pulmón disecado derivado de un ratón hembra de biopsia de seis a siete semanas de edad. Asegúrese de que el pulmón esté libre de órganos adyacentes como el corazón y el timo, vasos sanguíneos eferentes y aferentes, tráquea y tejidos conectivos. Enjuague el tejido en una placa de Petri que contenga PBS para eliminar los eritrocitos.

Por lo general, el pulmón de un ratón a esta edad pesa entre 110 y 150 miligramos. Si planea asociar pulmones de animales mayores u otras cepas de ratones, pese el tejido y el tampón. Se puede disociar un máximo de 450 miligramos de tejido por tubo.

Transfiera el tejido pulmonar a un tubo suave de C máx. cargado con 4,9 mililitros de tampón heis. Agregue 100 microlitros de solución de colagenasa D a una concentración final de dos miligramos por mililitro en el tejido pulmonar y tampón. Ahora 10 microlitros dase.

Una solución para más de 150 miligramos de tejido. Agregue 20 microlitros de dase una solución. Asegúrese de que el tubo C esté bien cerrado y colóquelo boca abajo sobre el suave tubo máximo.

Asegúrese de que el tejido esté ubicado entre el rotor y el estator. Seleccione el programa pulmonar y ejecútelo pulsando el botón de inicio cuando finalice el programa. Retire el tubo C del instrumento e incube la muestra durante 30 minutos.

En una incubadora de 37 grados Celsius durante la incubación, el tubo debe girarse con el rotador de tubo de mezcla máxima o girarse manualmente cada cinco minutos. Después de la incubación, regrese el tubo C al asociador de máx. suave y ejecute el segundo programa pulmonar Mientras se ejecuta el programa, prepare un tubo de 50 mililitros para recolectar las células filtradas reemplazando la tapa con un filtro de células de malla de 70 micrómetros. Una vez que finaliza el programa disociado, dependiendo de la distribución del material de muestra en el tubo, es posible que desee centrifugar el tubo brevemente para concentrar el material de la muestra.

Las células disociadas se pueden extraer del tubo pipeteando a través de la tapa sellada del tabique del tubo C. Utilizando una punta de pipeta adecuada de 1000 microlitros, la suspensión celular se aplica al filtro celular para eliminar las partículas o agregados más grandes. Una vez que la solución se haya drenado, lave el colador de celdas agregando cinco mililitros adicionales de temperatura ambiente y tampón para pellets las celdas filtradas.

Centrifugar el tubo de 50 mililitros a 300 GS durante 10 minutos. Ahora aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en el volumen deseado de temperatura ambiente. Tampón PEB.

No decantar el sobrenadante. Ahora puede continuar con su aplicación posterior. La disociación del tejido pulmonar del ratón mediante este procedimiento producirá un alto porcentaje de leucocitos y células endoteliales viables.

Las suspensiones unicelulares derivadas se tiñeron con CD 45 PE como CD 1 46 FITC, o CD 31 FITC, y se analizaron mediante citometría de flujo. Este gráfico muestra el enriquecimiento de células dendríticas utilizando microperlas CD 11 C, un separador minimax y dos columnas MS. Bien. Acabo de mostrarle cómo preparar suspensiones de células individuales a partir de tejido pulmonar de ratón de una manera estandarizada mediante el uso de la disociación de mezcla suave y los tubos C.

Este método permite la disociación eficiente y genérica del tejido. Al realizar este procedimiento, es importante diseccionar adecuadamente el pulmón y procesar el tejido inmediatamente después de la disección. Las suspensiones unicelulares preparadas se pueden utilizar para otros experimentos.

Por ejemplo, el marcaje magnético de las células, y luego la separación de leucocitos o células endoteliales. Está bien, eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.