Name: De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende el aislamiento y purificación de islotes pancreáticos humanos mediante gradiente de Ficoll para trasplante clínico. Este método automatizado garantiza alta calidad y viabilidad celular en cultivos de tejido.

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Con el apoyo de la fundación de la Universidad de Illinois en Chicago, así como células de los islotes del Centro de Recursos NIH (RFA-05-003 RR), la Fundación Christopher, la Fundación Efroymson, y la Fundación Tellabs.

1. La purificación de los islotes <ol><li> Para iniciar el procedimiento de purificación de islotes, la carga de la bolsa de COBE, pinza de todos los tubos, excepto el tubo verde, y establecer la velocidad a 1.500 y la súper a 0. </li><li> En la capilla establecer los vasos de la bomba y el gradiente y conectar la tubería de recogida en el tubo verde. </li><li> Ahora la carga de la Ficoll 1,100 puede comenzar: push &quot;giro&quot; a continuación, añadir 110 ml de Ficoll 1.100 en el vaso delante, y arrancar la bomba para cargar la bolsa de COBE. A medida que el Ficoll se ha cargado, pulse súper a cabo, parar la bomba, despinzar la cabeza de la bomba y ajustar la velocidad de súper y 100. </li><li> Cuando el Ficoll alcanza el vaso y todo el aire es expulsado de la tubería, re-clamp en el cabezal de la bomba. Ajustar la velocidad de giro de 3.000, y la velocidad de súper a 0. </li><li> Ahora se preparan para cargar los gradientes vertiendo el gradiente pesada en el vaso principal. Ligeramente la liberación de la abrazadera entre los dos vasos para eliminar el aire. A continuación, vierta el gradiente de luz en el vaso de la espalda. </li><li> Encienda el agitador magnético, pulse &quot;giro&quot; en la máquina de COBE, quitar la pinza del tubo que conecta los dos vasos, y verificar visualmente que los gradientes pesadas y ligeras se están mezclando. </li><li> Una vez que los gradientes inició la mezcla, a su vez en la centrífuga. Espere un minuto, y vuelva a encender la bomba para cargar los gradientes de mezcla. </li><li> Para cargar el tejido que el gradiente de agotarse en el vaso delante, pero no lo suficientemente baja como para permitir la entrada de aire en el tubo de carga, entonces reclamp el tubo que conecta los vasos y el tejido de carga. </li><li> Continúe agregando el resto de los tejidos. Luego lave el tubo que contenía el tejido con 50 ml de solución de lavado, y lo utilizan para lavar el vaso principal. </li><li> Como el último de los tejidos entra en la bolsa, al mismo tiempo detener la bomba, despinzar en el cabezal de la bomba y pinza de la línea por encima de la bolsa. Siguen centrifugar durante 5 minutos. </li><li> Mientras continúa la centrifugación, traer los 12 tubos de recogida de la capota y aflojar la gorra. Conecte el tubo de recogida en el tubo de color amarillo, y coloque la punta de recogida estéril en un tubo cónico. Luego despinzar el tubo de color amarillo, y la abrazadera del tubo verde. </li><li> Cuando el giro termina, levante lentamente Superout a 100. Recoger 150 ml en el tubo 1. A continuación, recoger 30 ml en tubos de 2-12 (200-230 ml). </li><li> Una vez que la colección está completa, pulse &quot;STOP&quot; en el COBE. Ahora que ha terminado la purificación, los islotes pueden ser evaluados y culta. </li></ol> 2. Muestreo y la cultura <ol><li> Después de recoger las fracciones purificadas islotes, extraer una muestra de cada uno de los 12 tubos de recogida y se tiñen con ditizona. La tinción se muestran cuales son las capas contienen islotes de alta pureza frente a las capas con islotes de baja pureza. </li><li> Obtener tejido de alta pureza y baja y la piscina cada conjunto. </li><li> Giro y lavar dos veces. Tras el segundo lavado, llevar el volumen de cada una de 250 ml con medio de lavado final. </li><li> Para evaluar las fracciones agrupadas comenzar por tomar dos muestras de 1 ml desde lo alto de las fracciones en común y un 1 ml de muestra de la baja. Transfiera cada muestra de 1 ml en un tubo cónico que contiene 9 ml de solución de lavado. </li><li> A continuación, transferir 1 ml de cada tubo de 15 ml a un plato de conteo. Examinar y contar las células en el microscopio. </li><li> Después de contar las células de calcular el número de frascos necesarios para la cultura de los islotes mediante la siguiente fórmula: (EIN total / pureza de los islotes en decimal) / (30000 EIN por frasco). Por ejemplo, 100.000 islotes con un 90% de pureza se cultivan en cuatro frascos. </li><li> La transferencia de los islotes para T175 frascos y la cultura en un 37 ˚ C y 5% de CO 2 incubadora. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

A pesar de importantes avances en las técnicas de aislamiento de islotes humanos, el rendimiento de los islotes siguen siendo muy variable e impredecible. Purificación del tejido pancreático digieren es crucial para recuperar una masa suficiente isla después de la digestión enzimática con éxito para el trasplante. El método de purificación de la UIC se recomienda debido a una recuperación superior de los islotes de alta pureza se demostró mediante el uso de este método. Por otra parte, hasta 50 ml de tejido digerido se ...

<table><tbody><tr><td>Centrífuga</td><td>equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de Células Cobe 2991</td><td>equipo</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>purificación de islotes</td></tr><tr><td>Microscopio invertido MZ6 TLBD4.1</td><td>equipo</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular con cuadrícula de 2 mm</td><td>equipo desechable</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>conteo de islotes</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>equipo</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa COBE</td><td>equipo desechable</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultivo T175</td><td>equipo desechable</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de la Universidad de Wisconsin (UW)</td><td>reactivo</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>reactivo</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Medio M199 (solución de lavado)</td><td>reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Solución final de lavado/medio de cultivo</td><td>reactivo</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ditizona</td><td>reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

de páncreas humano de aislamiento islet: parte ii: purificación y cultura de los islotes

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Gestión de la diabetes tipo 1 es una carga, tanto para el individuo y la sociedad, con un costo de más de 100 millones de dólares anuales. A pesar del uso generalizado de la monitorización de la glucosa y las nuevas formulaciones de insulina, muchas personas aún se desarrollan devastadoras complicaciones secundarias. El trasplante de islotes pancreáticos puede restaurar un control casi normal a la glucosa en pacientes diabéticos<sup&gt; 1</sup&gt;, Sin el riesgo de episodios hipoglucémicos graves que se asocian a la terapia intensiva de insulina. Proporcionar la masa suficiente de islotes es importante para el trasplante de islotes exitosos. Sin embargo, las características del donante, la obtención de órganos y la preservación de afectar el resultado de aislamiento<sup&gt; 2</sup&gt;. En la Universidad de Illinois en Chicago (UIC), hemos desarrollado un protocolo de éxito en el aislamiento con un gradiente de depuración mejorada<sup&gt; 3</sup&gt;. El programa se inició en enero de 2004 y más de 300 aislamientos se realizaron hasta noviembre de 2008. El páncreas se enviaron en soluciones de preservación en frío (UW de la Universidad de Wisconsin o HTK, histidina-triptófano-cetoglutarato)<sup&gt; 7.4</sup&gt; Para el Laboratorio de aislamiento de células en la UIC para el aislamiento de los islotes. Islotes pancreáticos fueron aislados usando el método de la UIC, que es una versión modificada del método descrito originalmente por Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Como se describe en la Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático, páncreas humano fue recortado, canulado, perfundidos, y digeridas. Después de la recolección y al menos 30 minutos de incubación en la solución UW, el tejido se ha cargado en el separador de células (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) para la purificación<sup&gt; 3</sup&gt;. Tras la purificación, el rendimiento de los islotes (expresados ​​como equivalentes de los islotes, IEQ), el volumen de tejido, y la pureza se determinó de acuerdo con los métodos estándar<sup&gt; 9</sup&gt;. Islotes aislados se cultivaron en los medios de comunicación CMRL-1066 (Mediatech, Herndon, VA), suplementado con 1,5% de albúmina humana, el 0,1% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 1 ml de ciprofloxacino, 5 ml de HEPES 1M, y 14,5 ml de Bicarbonato de Sodio 7.5% en frascos T175 a 37 ° C durante la noche antes de la cultura islotes fueron trasplantados o utilizados para investigaciones.

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes), utilizando un método modificado automatizado.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

El manejo de la diabetes tipo 1 representa una carga considerable, tanto para el individuo como para la sociedad, con un coste anual superior a los 100 mil millones de dólares. A pesar del uso generalizado de...

En este video, se somete a una purificación mediante gradiente de Ficoll un tejido pancreático que previamente ha sido aislado y digerido, lo que permitirá obtener una fracción purificada de islotes pancreáticos que finalmente podrán cultivarse en frascos de cultivo de tejidos hasta el trasplante. Hola, soy American Chief del Programa de Islotes Humanos del Departamento de Cirugía de la Universidad de Illinois en Chicago. Hola, mi nombre es Barbara Barbero y también pertenezco al Programa de Islotes Humanos.Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento de islotes pancreáticos humanos. Utilizamos este procedimiento en nuestra instalación para obtener islotes humanos de alta calidad con fines clínicos. Comencemos.Para iniciar el procedimiento de purificación con ojal, sujete con la abrazadera de la bolsa COBE todos los tubos excepto el verde y ajuste la velocidad a 1500 y la salida de super a cero dentro de la cabina. Configure la bomba y los vasos graduados para el gradiente y conecte el tubo de recolección al tubo verde. Ahora puede comenzar la carga del llamado FI, presione girar.Luego agregue 110 mililitros de FI. Pase al matraz frontal e inicie la bomba para cargar la

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Biología

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Este protocolo proporciona una guía paso a paso para la adquisición de un páncreas porcino para el aislamiento y la purificación de los islotes.

Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Aprende el aislamiento y purificación de islotes pancreáticos humanos mediante gradiente de Ficoll para trasplante clínico. Este método automatizado garantiza alta calidad y viabilidad celular en cultivos de tejido.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

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