Name: En vivo Ca 2 + - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio en neuronas de cuerpos de hongos de abejas durante el aprendizaje olfativo. Este método permite estudiar la actividad neuronal en tiempo real y comprender los mecanismos de memoria en insectos.

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Este trabajo está financiado por la DFG.

Abeja Preparación y posterior relleno <ol><li> Captura recolectores de miel de abeja en la colmena y se enfría en hielo durante la inmovilización. </li><li> Montaje en Plexiglas las cámaras de los tres. Fijar los ojos y el tórax a las paredes de la cámara de grabación con cera de bajo punto de fusión duro. </li><li> Tire de capilares de vidrio como de uso general para la electrofisiología y la ruptura en la punta para obtener un diámetro de la punta de la ca. 10μm. Cobertura en la punta del capilar con pasta de tinte. Pasta de colorante consiste en una mezcla 10:01 de la Fura-2 dextrano y lisina puede arreglar tetrametilrodamina dextrano. </li><li> Para el procedimiento de tinción inmovilizar antenas con minucias o n eicosano. Extraer un pedazo de cutícula sobre el cerebro y las glándulas empuje y la tráquea hacia el lado para permitir el acceso al cuerpo de hongo. </li><li> Se inyecta en los capilares ya sea el soma o región axonal de las neuronas del cuerpo de setas. Esto se puede hacer manos libres o el uso de un micromanipulador. A continuación, restaurar piezas cutícula cápsula de la cabeza y aflojar las antenas. </li><li> Alimentar a las abejas con solución de sacarosa al 30% antes de guardarlos en una caja húmeda por lo menos durante cuatro horas o durante la noche a 20 ° C. </li></ol> En vivo de imágenes <ol><li> Evitar los movimientos de las abejas, por ejemplo con un pequeño pedazo de esponja que se aprieta contra el abdomen y se fija con un clip o una cinta en la cámara de grabación. </li><li> Para evitar el movimiento del cerebro como resultado del bombeo del esófago, el corte de una pequeña incisión en la cutícula por encima del labrum y sacar con cuidado el esófago y sus alrededores estructuras sólidas para ponerlo bajo tensión sin dañar el esófago 4. Cubierta de silicona de dos componentes. </li><li> Hacer agujeros con una aguja e insertar electrodos de alambre para la grabación de la M17. </li><li> Retire la pieza cutícula, la tráquea y las glándulas sobre el cerebro. Chupe heamolymph dentro de la cápsula con la cabeza un pedazo de papel. </li><li> Llene la cápsula de la cabeza con silicona de dos componentes. Es importante que el cerebro está completamente cubierto. </li><li> Abeja en lugar platina del microscopio y coloque una gota de agua en la superficie de la silicona para sumergir el objetivo de inmersión en el microscopio en la gota. Se centran en las neuronas de colores. </li></ol> Olor estimulación y registro de señales Olfatómetro: Nosotros usamos un ordenador controlado, personalizado dispositivo construido estimulación o &quot;olfatómetro&quot;, como se describe anteriormente por Galicia y Vetter 3. Los olores se diluyen en una corriente constante de aire dirigido hacia las antenas. Cualquier estímulo consiste en un impulso de olor 3s de aire saturado de olor a 0,2 ml. El protocolo de estimulación se puede ajustar en el TILLVision software de grabación. Imagen de microscopio y puesta en marcha: utilizamos un microscopio de fluorescencia Zeiss. Las imágenes se graban a 25 ° C con una tasa de muestreo de 5 Hz usando un dispositivo de Till-Fotónica de imagen montado en el microscopio. Señales de calcio se registran a través de un X60, Olympus 0,9 W inmersión objetivo con una cámara CCD Imago (640X480 pixeles, 4X agrupadas en el chip de hasta 160x120 píxeles). Fura-2 se excita con luz monocromática de 380 nm de longitud de onda 340 y para las mediciones radiométrica. La fluorescencia se detecta a través de un espejo dicroico 410 nm y un filtro de 440nm pase largo. Los parámetros para la grabación se encuentra en el software de grabación. Cada medida dura 10 segundos y el tiempo de exposición para las dos longitudes de onda se puede ajustar a la intensidad de la tinción en cada preparación. M17 grabación: El transportador muscular del labio (M17) se registra extracelularmente para monitorear las respuestas conductuales relacionados con el aprendizaje, es decir, por cada 5, 6. Se inyecta un hilo de cobre en el músculo cerca de la partes de la boca. Inyectar electrodo de tierra en el ojo. Los potenciales de los músculos son amplificadas con un encargo de la estructura pre-amplificador, digitalizadas y almacenadas en un ordenador. Inicio del estímulo se desencadena por el olfatómetro. Análisis de Datos <ol><li> Durante el experimento: Las grabaciones de la señal de calcio se introducen en un ordenador y se almacenan. El software de grabación TILLVision permite una inspección inicial de las señales, como el cálculo de la relación entre las longitudes de onda (340nm/380nm) y el cálculo de deltaF (sustracción de la línea de base). </li><li> Procesamiento de imágenes se realiza con la costumbre de los programas escritos en IDL. Calcular la relación de Ca 2 + señales de 340 nm y 380 nm mediciones para cada píxel. Determinar la fluorescencia de fondo (F) por un promedio de más cuadros antes que el estímulo y la resta de la señal radiométrica (deltaF). </li><li> Para definir la región de interés (ROI): Calcular media de fotogramas durante el estímulo y aplicar un filtro de paso bajo (3X3px). Convertir en escala de grises de la escala de colores falsos. Determinar la actividad neuronal en las estructuras de la actividad en forma de manchas en las imágenes en falso color y definir el ROI. </li><li> Calcular la dinámica temporal de las regiones activas de un promedio de los píxeles en el retorno de la inversión sobre todos los marcos, sin ningún tipo de filtro o corrección. </li></ol> Junto con el dextrano Fura-2 llenamos las neuronas con el colorante rodamina dextrano puede arreglar (&quot;mini rubí&quot;). Ambos colorantes tienen el mismo peso molecular, sino que debe ser colocado en las neuronas. Amplio campo de la imagen sólo permite una resolución espacial muy limitada, por lo tanto se recomienda para investigar las estructuras teñidas después del experimento mediante microscopía confocal de barrido. <ol><li> Después de las mediciones fisiológicas, diseccionar el cerebro y fijar. </li><li> Enjuague en PBS y se deshidratan por pasos en el etanol y el salicilato de metilo en claro. </li><li> Por microscopía confocal incrustar en el cerebro salicilato de metilo. </li><li> Nosotros usamos un microscopio Leica TCS SP2. Longitud de onda de excitación es 543nm. </li><li> Podemos escanear el cerebro con un objetivo de inmersión en aire o aceite y comparar las estructuras teñidas con los datos de imagen. </li></ol> Los resultados representativos: Si la coloración y la preparación se ha realizado correctamente, la señal en la escala de colores falsos, por ejemplo, en las neuronas de setas cuerpo alfa lóbulo extrínseca, se vería así en la figura 1. La respuesta conductual (PER) se puede calcular como la frecuencia de pico durante el estímulo menos frecuencia pico antes de que el estímulo (figura 2). Las estructuras teñidas pueden ser investigados con mayor detalle mediante un microscopio confocal (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: Representante de las señales de imágenes de calcio (estimulación con heptanal). R: Toma de imágenes de la región del cerebro de las abejas. B: imagen Raw fluorescentes como se ve a través de una inmersión X20 objetivo en la longitud de onda de excitación 380 nm, la alfa-lóbulo del cuerpo de setas se describe en la púrpura. Se inyectó en el borde ventro-lateral de los lóbulos alfa-para teñir las neuronas extrínsecas. C: Imagen en falso color deriva de la media de la señal, deltaF (340/380), en el estímulo de tres segundos, la alfa-lóbulo se indica en morado, seleccionados ROI delineados en negro. D: Dinámica temporal de la señal de calcio en respuesta a la estimulación olor, señal promedio de la región de interés, como se indica en el C. E: Dinámica temporal de la señal de calcio en respuesta a la estimulación de sacarosa de la ipsilateral y la antena contra-lateral, respectivamente, al retorno de la inversión indicada en C. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> Figura 2: Representante M17 respuesta. Después del acondicionamiento olfativa de la abeja se extiende la probóscide, cuando el olor se presenta sin recompensa. La línea roja indica el estímulo del olor. Recuadro: PER de la abeja. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> Figura 3: pila de imágenes Representante. Después del experimento de imágenes del cerebro se diseccionó. La neurona de la figura 1 se analiza con un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite de X20, la alfa-lóbulo se indica en morado.

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

En esta presentación se han seguido todos los pasos necesarios para investigar en las señales de calcio in vivo en la abeja melífera. Hemos aplicado esta técnica a las neuronas del cuerpo de hongos, pero las imágenes se puede realizar en todas las neuronas que puede ser una técnica de tinción establecida. Nos hemos centrado en las neuronas de la vía olfativa de la abeja de la miel. Los experimentos son realizados en un cuarto oscuro. La puesta en marcha se ilumina con una luz de onda larga que...

<table><tbody><tr><td>Cera dura de bajo punto de fusión Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 dextrano sal potásica, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>Proteger de la luz.</td></tr><tr><td>dextrano tetrametilrodamina 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>Proteger de la luz.</td></tr><tr><td>n-eicosano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo Kwik Sil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>Configuración de imagen</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo ca 2 + - imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

En vivo y semi-vivo en la preparación para obtener imágenes de calcio se ha desarrollado en nuestro laboratorio por Joerges, Kuttner y Galicia más de diez años, para medir la actividad olor evoca en el lóbulo antenal 1. A partir de entonces, ha sido constantemente perfeccionado y aplicado a neuropiles diferente en el cerebro de las abejas. Aquí se describe la preparación se utilizan actualmente en el laboratorio para medir la actividad en las neuronas del cuerpo de setas, junto con un dextrano colorante sensible al calcio (Fura-2). Nos retrógrada mancha de hongo neuronas del cuerpo mediante la inyección de contraste en sus axones o región soma. Nos centramos en la reducción de la invasión, para lograr una preparación en la que todavía es posible entrenar a las abejas con PER acondicionado. Somos capaces de controlar y cuantificar la respuesta de comportamiento mediante el registro electro-myograms del músculo que controla el PER (M17) 2. Después del experimento fisiológico las estructuras proyectadas se investigan con mayor detalle mediante microscopía confocal de barrido para hacer frente a la identidad de las neuronas.

Las abejas pueden ser acondicionadas en una paradigma de aprendizaje olfativo apetito (PER acondicionado). Utilizando los olores como estímulo, hemos establecido un método en el que el comportamiento se registra al mismo tiempo imágenes de calcio se utiliza para medir la actividad de olor evoca en las neuronas del cuerpo de setas<em&gt; In vivo</em&gt;.

En vivo Ca 2 + - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

La preparación in vivo y semi-in vivo para la imagen de calcio fue desarrollada en nuestro laboratorio por Joerges, Küttner y Galizia hace más de diez años, para...

Este procedimiento comienza fijando la abeja en una cámara de registro. Se elimina un trozo de cutícula del capullo cefálico para teñir estructuras seleccionadas del cerebro. Las señales de calcio en las neuronas teñidas se registran in vivo utilizando un sistema de imagen de campo amplio.Durante la imagen, se puede estimular a la abeja con olores o con la administración de sacarosa a la antena. De este modo, se puede condicionar a la abeja para que extienda el probóscide en respuesta a un olor. La respuesta de extensión del probóscide se monitorea mediante grabaciones de electromiograma del músculo M 17.Después del experimento de imagen, el cerebro se disecciona para una investigación más detallada de las estructuras teñidas utilizando un microscopio confocal. Hola, soy Melanie del Laboratorio de rdo Mansel. Hola, soy Anya también del Laboratorio Mansel.Hoy les mostraremos un procedimiento para la imagen de calcio in vivo y el cuerpo fúngico de la abeja melífera. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la codificación olfativa y la plasticidad relacionada con el aprendizaje en el cerebro de la abeja melífera. Así que comencemos.Comience capturando una ab

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Investigación

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Biología

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de...

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

Este video describe las imágenes de calcio in vivo en neuronas de Drosophila usando GCaMP. El clip de protocolo presentado muestra cómo registrar los cambios en la fluorescencia de GCaMP de las neuronas del cuerpo del hongo durante un experimento de acondicionamiento olfativo.

Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

Este video muestra un método para obtener imágenes de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en moscas. Describe los pasos para preparar las moscas para la microscopía, realizar el acondicionamiento olfativo y visualizar la afluencia de calcio inducida por el olor.

in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Este video muestra un protocolo detallado de inmunotinción para visualizar defectos fenotípicos en los cuerpos de hongos de cerebros de Drosophila mutantes. El protocolo consiste en el uso de anticuerpos contra Fas2, una proteína implicada en la guía axonal que facilita el correcto desarrollo morfológico y funcional del cuerpo del hongo.

Visualización de neuronas del cuerpo de hongo en cerebros de Drosophila mediante inmunotinción

Simultáneas grabaciones extracelulares de largo plazo a partir de dos neuropiles cerebrales diferentes o dos extensiones anatómicas diferentes se establecieron en las abejas. Estas grabaciones permiten la investigación de los aspectos temporales de procesamiento neuronal a través de diferentes áreas cerebrales en la única neurona, así como a nivel de conjunto en un animal de comportarse.

Grabaciones simultáneas a largo plazo en dos etapas de procesamiento neuronal en Behaving abejas

Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Para probar los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la fosfolipasa C (PLC) en las diferentes regiones del cerebro de la abeja, presentamos un ensayo bioquímico para medir la actividad de la PLC en esas regiones. Este análisis podrían ser útil para comparar la actividad de la PLC entre los tejidos, así como entre las abejas exhibe diferentes comportamientos.

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Un obstáculo importante para el estudio de la actividad celular durante los procesos cognitivos, como el aprendizaje y la memoria, es el uso de anestésicos para la preparación de imágenes in vivo . La anestesia afecta la memoria a corto plazo y la cognición en múltiples modelos, incluida Drosophila. Este estudio presenta un método único para preparar Drosophila adulta para imágenes in vivo sin anestesia.

In vivo Imágenes de la actividad neuronal en moscas adultas de Drosophila no anestesiadas

Presentamos protocolos de imágenes de calcio para una neurona olfativa larvaria de Drosophila , utilizando un adhesivo tisular tópico para la inmovilización. Este método mejora la estabilidad, facilitando experimentos confiables in vivo y ex vivo . Los scripts R personalizados analizan las señales de calcio, proporcionando una plataforma eficiente para la investigación neurofisiológica detallada.

Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio

Aprende a realizar imágenes de calcio en neuronas de cuerpos de hongos de abejas durante el aprendizaje olfativo. Este método permite estudiar la actividad neuronal en tiempo real y comprender los mecanismos de memoria en insectos.

En vivo Ca ^{2 +} - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

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