En vivo Ca ^{2 +} - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

Las abejas pueden ser acondicionadas en una paradigma de aprendizaje olfativo apetito (PER acondicionado). Utilizando los olores como estímulo, hemos establecido un método en el que el comportamiento se registra al mismo tiempo imágenes de calcio se utiliza para medir la actividad de olor evoca en las neuronas del cuerpo de setas

Este procedimiento comienza con la fijación de la abeja en una cámara de registro. Se extrae un trozo de cutícula de la cápsula de la cabeza para teñir estructuras seleccionadas en el cerebro. Las señales de calcio en las neuronas teñidas se registran in vivo utilizando una configuración de imágenes de campo amplio.

Durante la toma de imágenes, la abeja puede ser estimulada con olores o entrega de sacarosa a la antena. De esta manera, la abeja puede ser condicionada para extender la probóscide en respuesta a un olor. La respuesta de extensión de la probóscide se monitorea mediante registros de electromiograma del músculo M 17.

Después del experimento de imagen, se disecciona el cerebro para una investigación más detallada de las estructuras teñidas utilizando un microscopio confocal. Hola, soy Melanie del laboratorio de rdo Mansel. Hola, soy Anya también del Laboratorio Mansel.

Hoy le mostraremos un procedimiento para obtener imágenes de calcio in vivo y el cuerpo del hongo de abeja. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la codificación olfativa y la plasticidad relacionada con el aprendizaje en el cerebro de las abejas melíferas. Así que comencemos.

Comience atrapando una abeja recolectora en la entrada de la colmena y luego inmovilícela enfriándola en hielo. A continuación, monta la abeja en una cámara de grabación de plexiglás. Use cera dura de bajo punto de fusión para fijar los ojos y el tórax a la pared.

Todos rompen un capilar de vidrio en la punta para obtener un diámetro de 10 micras. Cubra la punta del capilar con una pasta d que consiste en una mezcla de 10 a uno de URA, dos dextrinas y dextrina Rodin fijable. El capilar preparado se utilizará para la tinción.

Para comenzar el procedimiento de tinción, primero inmovilice las antenas con un koane. Abra la cápsula de la cabeza por encima del cerebro quitando un trozo de cutícula y empujando las glándulas y la tráquea hacia los lados, permitiendo el acceso al cuerpo del hongo. Use un pedazo de papel para absorber el hemo linfa dentro de la cápsula de la cabeza.

Para teñir las neuronas del cuerpo de los hongos, inyecte el capilar en el soma o en la región dendrítica de las neuronas. A continuación, vuelva a colocar la cutícula en la cápsula de la cabeza y afloje la antena. Finalmente, alimente a la abeja con una solución de sacarosa al 30% y guárdela en una caja de espuma de poliestireno cubierta con un paño de cocina húmedo durante al menos cuatro horas o toda la noche a 20 grados centígrados.

Una vez completada la preparación B, podemos comenzar la obtención de imágenes in vivo. Para comenzar, use una esponja que esté conectada a la cámara de registro para evitar que la abeja se mueva, presionándola contra el abdomen. Ahora fije las antenas de la abeja con un ioane para evitar que el cerebro se mueva debido al bombeo del esófago.

Haga una pequeña incisión en la cutícula por encima del labrum y extraiga con cuidado el esófago y las estructuras sólidas circundantes y cúbralas con silicona de dos componentes. A continuación, utilice una aguja para hacer agujeros para la inserción de los electrodos de alambre que se utilizan para registrar electrogramas del músculo transportador del labio. Retire la pieza de la cutícula, la tráquea y las glándulas por encima del cerebro.

Use un pedazo de papel para absorber el hemo dentro de la cápsula de la cabeza para registrar electrogramas de M 17. Inyecte un alambre de cobre en el músculo cerca de las partes de la boca. Inyecte un electrodo de tierra en el ojo.

Ahora llene la cápsula de la cabeza con silicona de dos componentes. Asegúrate de que el cerebro esté completamente cubierto. Coloque la abeja en la platina del microscopio y coloque una gota de agua en la superficie de la silicona.

Sumerja el objetivo de inmersión del microscopio en la gota y luego concéntrese en las neuronas de etapa. Una vez completada la preparación para la obtención de imágenes in vivo, ahora podemos describir la estimulación de olores y el registro de señales. Para entregar estímulos de olor a la abeja, utilizamos un olfatómetro hecho a medida controlado por computadora para diluir los odorantes en una corriente de aire constante.

Dirigida a la antena, la estimulación del olor consiste en un pulso de tres segundos de aire saturado de olor. Para las imágenes de calcio, utilizamos una configuración de imágenes fotónicas til montada en un microscopio fluorescente zes para registrar imágenes a temperatura ambiente con una frecuencia de muestreo de cinco hercios. Las señales de calcio se registran a través de un objetivo de inmersión Olympus X 60 de 0,9 W con cámara CCD Ango, cada medición dura 10 segundos.

Los potenciales musculares se amplifican con un amplificador de hierba y se registran y digitalizan con un convertidor digital analógico. Las grabaciones de M 17 se utilizan para monitorear las respuestas conductuales relacionadas con el aprendizaje con la grabación de señales completada, ahora podemos pasar al análisis morfológico y la reconstrucción. Porque ambos tintes utilizados durante el relleno tienen el mismo peso molecular.

Están ubicados en las neuronas. Las imágenes de campo amplio tienen una resolución espacial limitada, por lo que utilizamos microscopía de barrido confocal para investigar las estructuras teñidas. Después del experimento, primero diseccione el cerebro y fíjelo durante la noche en formaldehído al 4% a cuatro grados centígrados al día siguiente, enjuáguelo en PBS y luego deshidrítelo en pasos de etanol 10 minutos en 50% 70% 90% 99% y dos veces 10 minutos en 100% Coloque el cerebro en un portaobjetos ranurado con una gota de cubierta de salicilato de metilo, Deslícelo y luego colóquelo en la platina del microscopio de un microscopio de barrido confocal.

Escanee el cerebro con una lente de objetivo aéreo y un zoom digital de 1,1 a 1,2 en secciones ópticas de cuatro micrómetros. Aquí vemos la respuesta de las neuronas extrínsecas del cuerpo del hongo a la estimulación del olor de las antenas registrada a través de un objetivo de 60x y visualizada en falsos colores. El cuadrado rojo de la izquierda representa la persistencia del estímulo odoroso.

Después del experimento, se disecciona el cerebro y se investigan las estructuras de la tinción con mayor detalle utilizando un microscopio confocal con un aumento de 20x. Así que acabamos de mostrarte cómo obtener imágenes de las neuronas del cuerpo de los hongos en la abeja melífera durante el aprendizaje olfativo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los experimentos con tintes sensibles a la luz deben realizarse en la oscuridad.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos. Adiós.