Generación de humanos CD40 activado por células B

Hola, mi nombre es Alexander Shiku Van Hagen. Soy miembro del Laboratorio de Inmunología y de Inmunología del Trasplante en el Hospital Universitario de Colonia. En este video, les mostraremos cómo podemos generar células B humanas activadas por CD40 a partir de células mononucleares de sangre periférica.

Uno de los principales intereses de nuestro laboratorio es el estudio de las funciones independientes de los anticuerpos de las células B. Más allá de su papel como productoras de anticuerpos, las células B tienen una función importante como células presentadoras de antígenos tanto en condiciones fisiológicas como en enfermedades autoinmunes. Tras la activación, las células B pueden adquirir potentes capacidades de presentación de antígenos y estimulación inmunológica, especialmente cuando se activan a través de CD40.

CD 40. Las células B activadas presentan varias ventajas en comparación con las células dendríticas. Pueden expandirse fácilmente a un costo relativamente bajo a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica, incluso de pacientes con cáncer.

Ahora nuestra estudiante de doctorado, Tanya Leic, y nuestra técnica LER, les darán una introducción paso a paso sobre cómo generar células B humanas activadas por CD40 a partir de sangre periférica. Hola, mi nombre es Tanya Livi. Soy estudiante de doctorado y quiero demostrarles cómo generar células B humanas activadas por CD40.

Este procedimiento fue optimizado en nuestro laboratorio. Los pasos principales son, en primer lugar, la preparación de células alimentadoras. Para ello, utilizamos células N IH 33 transfectadas con el ligando humano CD 40, las cuales se irradian con 78 gray y se siembran en placas de seis pocillos.

En segundo lugar, iniciamos el cultivo de células B activadas por CD40 humanas a partir de PBMC purificados, que se tratan con interleucina humana 4 y ciclosporina A; luego, estas células se siembran sobre células FEEDER en placas de seis pocillos. Este procedimiento se repite el día 7 y posteriormente cada tres o cuatro días hasta el día 14 del cultivo celular. Para obtener células B activadas por CD40 humanas altamente puras, comenzamos la generación de células B activadas por CD40 con PBMC humanos recién purificados o adecuadamente conservados.

Primero, lavamos los PBMC dos veces, por lo tanto re suspendemos las células en 50 mililitros de PBS. Centrifugamos los PBMC durante siete minutos a 1300 RPM, lo que corresponde a 260 5G. Esta operación, el sobrenadante y el gránulo, se suspenden nuevamente en 50 mililitros de PBS y se centrifugan de nuevo durante siete minutos a 1100 RPM, lo que corresponde a 190 G. Este paso, el sobrenadante nuevamente, se utiliza para la determinación del recuento celular reus.

Suspenda los PBMC en 20 mililitros de PBS y mezcle bien las células mediante vortex, luego determine el recuento celular. Centrifugue la cantidad necesaria de PBMC para el cultivo de células B CD40 durante cinco minutos a 1200 RPM, lo que equivale a 220,5 × g. Utilizando una placa de seis pocillos, necesitará cuatro veces 10 a la seis células por pocillo más 24 veces 10 a la seis células por placa.

Luego, re suspenda los PBMC a una concentración de un millón de células por mililitro en medio de cultivo CD40B. Suplemente la suspensión celular con IL-4 humana fresca a una concentración de 50 unidades por mililitro para estimulación y con ciclosporina A a una concentración de 0,63 microgramos por mililitro para inhibir el crecimiento de linfocitos T. Ahora, la suspensión de PBMC está lista para la estimulación con el ligando CD40.

Hasta donde sabemos, actualmente no existe un ligando de CD40 SOMAL con grado funcional de buenas prácticas de fabricación (GMP) disponible. Por lo tanto, utilizamos células NIH 3T3 transfectadas con ligando de CD40 humano para estimular la supervivencia, diferenciación y proliferación celular, ya que la línea celular NIH 3T3 puede sobrevivir en cultivo durante varios meses. La pérdida de expresión del ligando de CD40 debe descartarse regularmente mediante citometría de flujo.

El ligando CD40 transfectado, NIH 3T3, es una línea celular adherente que se cultiva a 37 grados con 5 %CO₂ en medio de selección, suplementado con G418 en una concentración de 0,7 miligramos por mililitro. Esta línea celular de fibroblastos adherentes nunca debe llegar a ser completamente confluyente y debe dividirse dos veces por semana. Para dividir las células adherentes, aspire el medio, lave una vez con 10 mililitros de PBS agitando suavemente. Aspire nuevamente el medio y añada cuatro mililitros de tripsina-EDTA en un matraz de 75 centímetros cuadrados.

Incube el matraz durante cinco a 10 minutos a 37 grados en la incubadora. Saque el matraz nuevamente. Utilice golpes suaves para desprender las células del plástico.

Luego, agregue 10 mililitros del medio de tipo silvestre, agite suavemente y transfiera las células a un tubo de 50 mililitros. Centrifugue las células NA83T3 durante cinco minutos a 1200 RPM, lo que equivale a 125 ×g. Suspender cuidadosamente las células sedimentadas en medio de tipo silvestre de 10 milimolar.

Determine el número de células para el subcultivo N IH tres tres y re suspenda 1,5 veces 10 a la seis células alimentadoras en 10 mililitros de medio tipo silvestre. Trasfiera las células a un matraz de 75 centímetros cuadrados y agregue G 4 1 8 en una concentración de 0,7 miligramos por mililitro para seleccionar las células transfectadas que portan resistencia a la neomicina. Por último, incube las células alimentadoras a 37 grados en 5%CO2 para la estimulación de CD 40 B.

Tome el resto de las células NI 8 3 3 y, de forma letal, irradíelas con 78 grados para detener su proliferación. Diluya las células alimentadoras irradiadas en medio tipo alambre con una densidad celular de 0,1 veces 10⁶ células por mililitro, agregando dos mililitros por pocillo en una placa de seis pocillos. Deje que las células en las placas de seis pocillos se vuelvan nuevamente adherentes antes de usarlas como células alimentadoras, incubándolas durante 24 horas a 37 grados y 5 %CO₂ para la estimulación de linfocitos B con ligando CD40.

Compruebe bajo el microscopio si las células alimentadoras sembradas un día antes están adheridas. Si las células alimentadoras están adheridas, retire el SUP natin de cada pocillo y lávelas rápidamente dos veces. Primero, lave cada pocillo con dos mililitros de PBS y luego con dos mililitros.

Medio de lavado CD40 B para la estimulación en la suspensión de PBMC. Prepárese poco antes con una densidad celular de uno por diez a la seis células por mililitro respecto a las células alimentadoras. Para ello, transfiera suavemente cuatro mililitros de la suspensión celular a cada uno.

Incubar bien la placa a 37 grados en 5%CO2 el día siete. Las células B CD40 pueden ser subcultivadas en la primera subcultura de CD40. Las células B activadas el día siete y en subcultivos posteriores cada tres a cuatro días.

Recoger suavemente las células agrupadas de las seis placas de 12 mediante resuspensión, suspendiéndolas con una pipeta de 10 mililitros. Recoger los linfocitos B CD40 en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar los linfocitos B CD40 durante siete minutos a 1200 RPM, lo que corresponde a 220,5 ×g, completamente.

Cambie el medio por medio de lavado CD40 B y determine el recuento celular de los linfocitos B activados CD40. Re suspenda las células B CD40 a una concentración de un millón de células por mililitro en medio de cultivo B CD40.

Luego nuevamente, suplemente la suspensión celular con interleucina humana cuatro fresca en una concentración de 50 unidades por mililitro y ciclosporina A en una concentración de 0,63 microgramos por mililitro para estimulación. Uc, células alimentadoras irradiadas preparadas un día antes. Por supuesto, las células alimentadoras irradiadas deben volver a verificarse para adherencia bajo el microscopio directamente antes del uso.

Si son adherentes, lave las células alimentadoras rápidamente dos veces: una vez con PBS y la otra vez con medio de lavado CD40 B, luego agregue cuidadosamente cuatro mililitros del suspensión de CD40 B ajustada a un millón de células por mililitro en cada pocillo de la placa de seis pocillos. El subcultivo se repite de forma idéntica tras tres a cuatro días, dos veces por semana, hasta obtener agrupaciones celulares de linfocitos B humanos altamente puros activados mediante CD40 en el día 14 del cultivo.

En este momento, las células B CD40 expresan moléculas coestimuladoras como CD80, CD86, CD83, moléculas de MHC y la llamada tríada de homing a ganglios linfáticos CD62 ligando, CCR7 y LFA1, que pueden verificarse mediante Fox durante la generación para fines de solución de problemas. Consulte la versión textual de este protocolo. Esperamos que en el futuro, las células B activadas con CD40 sirvan como una herramienta importante para la inmunoterapia contra el cáncer.

Buena suerte con sus experimentos.