Name: Generación de humanos CD40 activado por células B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Aprende a generar células B humanas activadas por CD40 a partir de PBMC mediante estimulación con ligando de CD40 e interleucina-4. Este método permite expandir células con potente capacidad presentadora de antígenos para estudios inmunológicos.

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El protocolo para la generación de las células B CD40-activado a partir de PBMC se divide en dos partes: la parte A demuestra la preparación de ligando de CD40 que expresa NIH/3T3 células, que se utilizará como células alimentadoras obligado placa. La parte B describe la actual CD40-B cultura. A. Preparación de las células de alimentación (tCD40L NIH/3T3) El NIH/3T3 tCD40L es un adherente línea murina de células de fibroblastos, que nunca debe ser totalmente confluente. Las células son por lo tanto, dividido dos veces por semana. El cultivo de más de más de 6 semanas no es recomendable. <ol><li> Quitar medio de edad de la cultura de primaria con una pipeta estéril y lavar las células con 10 ml de PBS 1x. Aspirar el PBS después del lavado. </li><li> Agregar 4 ml de tripsina / EDTA en un matraz de 75 cm 2 durante 5-10 minutos a 37 ° C. Use suaves golpecitos para separar las células. </li><li> Agregar 10 ml de medio de tipo salvaje y giro suave. </li><li> La transferencia de la suspensión de células en un tubo de 50 ml con una pipeta estéril y el giro de las células hacia abajo a 225 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de tipo salvaje. Cuente el número de células de una parte alícuota de la suspensión celular y preparar tres tubos de 50 ml con el número adecuado de células: <ol><li> 1,5 x 10 6 células por subcultivo </li><li> 0,2 x 10 6 células / pocillo de irradiación utilizadas para el cultivo de células CD40-B </li><li> resto de congelar (si es necesario). </li></ol></li><li> Giro de las células hacia abajo a 225 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante. <ol><li> Para subcultivo: resuspender 1,5 x 10 6 células en 10 ml de medio de tipo salvaje en un 75 cm 2 frasco de cultivo celular (densidad celular de 1,5 x 10 5 células / ml), añadir G-418 [0,7 mg / ml] e incubar las células en 37 ° C con 5% de CO 2. Dividir las células dos veces por semana. </li><li> Para el cultivo de células CD40-B: Es necesario 1,2 x 10 6 células por uno de 6 pocillos. Resuspender las células en el medio silvestre, con una densidad de 0,1 x 10 6 células / ml e irradiar a los 78 Gy. Placa de 2 ml de la suspensión celular en cada pocillo y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Utilice esta platos preparados para la estimulación de células B cuando tCD40L NIH/3T3 células adherentes (por lo menos 4 horas: comprobar el cumplimiento con el microscopio, no espere más de 24 horas para empezar la estimulación de células B). (Continuar con B.) </li></ol></li></ol> B. CD 40-B de cultivo celular I. Preparación de PBMCs de CD40-estimulación (día 0): Tenga en cuenta: antes de continuar asegurarse de que las células alimentadoras son adherentes. Siempre agregue nuevas soluciones de interleucina-4 y la ciclosporina A para el medio de cultivo inmediatamente antes del uso. <ol><li> Tome PBMCs, ya sea fresco o descongelado adecuadamente. Resuspender PBMCs dos veces en 50 ml de PBS 1x para lavar y centrifugar por primera vez a 265 g durante 7 min y una segunda vez a 190 xg durante 7 min para eliminar otras células. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 20 ml de PBS. Determinar el número de células en una parte alícuota de la suspensión celular. </li><li> Decantar la cantidad necesaria de células en 225 g durante 5 min. Para una placa de 6 pocillos 4 x 10 6 células / así se necesitan, por lo tanto 24 x 10 6 células por placa. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el PBMC a 1 x 10 6 células / ml en CD40-B medio de cultivo fresco suplementado con 50 U / mL de IL-4 como un factor de crecimiento y 0,63 ciclosporina mg / ml A para prevenir la extensión de las células T (Teniendo en cuenta las concentraciones se refieren a un medio de cultivo ml!). </li><li> Eliminar el sobrenadante de 6 y placa pre-incubadas con tCD40L NIH/3T3 células. </li><li> Lave el adherente tCD40L NIH/3T3 células con 2 ml de PBS por el primer pozo y en una segunda fase con 2 ml de CD40-B medio de lavado. </li><li> Suavemente agregar 4 ml de la suspensión de PBMC (1 x 10 6 células / ml) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. </li><li> Se incuban las células a 37 º C con CO2 al 5%. </li><li> El día 7, reculture las células (Continúe con 3.2.). </li></ol> II. Nueva puesta en cultivo de células CD40-B (día 7, y después cada 3-4 días): <ol><li> Racimos de la cosecha de células B CD40-de 6 y placa resuspendiendo con una pipeta de 10 ml y la piscina que en un tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 225 xg durante 7 minutos y sustituir por completo el sobrenadante con CD40-B medio de lavado. Al contar la cantidad de células de una parte alícuota, girar las células hacia abajo a 225 xg durante 5 minutos. Resuspender las células CD40-B CD40-B en el medio de cultivo a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Añadir nuevas soluciones de interleucina-4 en una concentración de 50 U / mL y 0,63 mg / ml de ciclosporina A en el medio. </li><li> Eliminar el sobrenadante de una placa de 6 pocillos pre-incubadas con tCD40L NIH/3T3 células. </li><li> Lave las células adherentes con 2 ml de PBS por pocillo primera y en una segunda fase con 2 ml de CD40-B medio de lavado. </li><li&gt; Suavemente agregar 4 ml (1 x 10 6 células / ml) de suspensión CD40-B a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Las células de la subcultura de nuevo cada 3-4 días para terminar con las células humanas de alta pureza B CD40-activa después de un total de 14 días. </li></ol> C. Solución de problemas - ¿Qué pasa si las células CD40-B no crecen? <ol><li> ¿Ha revisado para la expresión del ligando CD40 de células alimentadoras? </li><li> La placa con destino células alimentadoras utiliza para la estimulación no debe ser mayor de 24 horas? </li><li> Es una contaminación por micoplasma es posible? </li><li> Era la solución de interleuquina-4 utilizado para la suplementación recién descongelado y tuvo la actividad biológica apropiada? </li><li> Se añade la ciclosporina A en la concentración correcta? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">haga clic aquí</a> para una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" /> Figura 2. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">haga clic aquí</a> para una versión ampliada de la figura 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

A. Preparación de los medios de comunicación: <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Alimentador de medio celular de tipo salvaje </td><td colspan="2"> Alimentador de selección de células medianas </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración </td><td> Reactivo </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> DMEM-Cam / F12 </td><td></td><td> DMEM-Cam / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 365 mg / ml </td><td> L-Glutamina </td><td> 365 mg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / ml </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B medio de lavado </td><td colspan="2"> CD40-B medio de cultivo </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración </td><td> Reactivo </td><td> Concentración </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutamina </td><td> 584 mg / ml </td><td> L-Glutamina </td><td> 584 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mM </td><td> HEPES </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh transferrina </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> La insulina rh </td><td> 5 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Otros reactivos: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de orden </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> PAA </td><td> Ningún gato: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> No gato H15-011 </td></tr><tr><td> AB-suero humano </td><td> Invitrogen </td><td> Gato No 34005100 </td></tr><tr><td> holo-transferrina humana </td><td> Sigma </td><td> Gato No T0665 </td></tr><tr><td> La insulina humana </td><td> Sigma </td><td> Gato No I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Seleccione Delta </td><td> Arte No 7395800 </td></tr><tr><td> La interleucina-4 humana recombinante </td><td> Immunotools </td><td> Gato No 11130045 </td></tr><tr><td> La ciclosporina A </td><td> Novartis </td><td> No NDC 0078-0109-01 gato </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Gato No DE14-802C </td></tr><tr><td> Tampón HEPES </td><td> PAA </td><td> No gato S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 Sulfato </td><td> PAA </td><td> No gato P02-012 </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA (10 veces) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. Otros materiales: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de orden </td></tr><tr></tr><tr><td> Puntas de pipeta estériles </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 y placa </td><td> NUNC </td><td> Gato No 140675 </td></tr><tr><td> Tubo cónico de 50 ml </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Gato No 352070 </td></tr><tr><td> Frasco de cultivo de tejidos </td><td> SARSTEDT </td><td> Gato No 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

generación de humanos cd40 activado por células b

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activa las células B (CD40-células B) se han identificado como una fuente alternativa de presentadoras de antígeno inmuno-estimulantes de las células (APC) para la inmunoterapia del cáncer 1-3. Comparación con las células dendríticas (CDs), la mejor caracterizada APC, las células CD40-B tienen varias propiedades diferentes biológicos y técnicos. Al igual que en los países en desarrollo, las células B muestran un incremento en la expresión de MHC y moléculas co-estimulantes (Fig.1b), muestran una gran capacidad migratoria y la presentación de antígenos presentes de manera eficiente a las células T, después de la estimulación con el ligando interleucina-4 y CD40 (CD40L). Sin embargo, en contraste con los países en desarrollo inmaduro o maduro, las células CD40-B expresan la tríada de los ganglios linfáticos completa mensajeras que consta de CD62L, CCR7/CXCR4, y la función leucocitaria antígeno-1 (LFA1, CD11a/CD18), necesarios para la recalada de los órganos linfoides secundarios (Fig. 1A) 3. Las células CD40-B se puede generar sin problemas de cantidades muy pequeñas de sangre periférica, que puede ser ampliado in vitro a cantidades muy grandes de muy pura CD40-células B (&gt; 10 9 células por paciente) de donantes sanos, así como el cáncer pacientes (Fig. 1c, d) 1,4. En este protocolo se demuestra cómo obtener completamente activados CD40-células B a partir de PBMC humanos. Moléculas clave para el cultivo de células son CD40 ligando, la interleucina-4 (IL-4) y ciclosporina A (CsA), que se renuevan en un ciclo de día y la cultura 4.3. Para fines de laboratorio CD40-estimulación es proporcionado por NIH/3T3 células que expresan el ligando CD40 humano recombinante (tCD40L NIH/3T3) 5. Para evitar la contaminación con células no transfectadas, la expresión del ligando de CD40 humano en los transfectantes tiene que ser revisado regularmente (Fig. 2). Después de 14 días CD40-B consisten en cultivos celulares de más del 95% de pureza células B y la expansión de células B CD40-más de 65 días es con frecuencia posible sin ningún tipo de pérdida de la función 1, 4. Las células CD40-B de manera eficiente recoger, procesar y 6 presentan antígenos a las células T. No sólo naϊve principal, sino también ampliar las células T de memoria 7,8. CD40-activa las células B puede ser usado para estudiar la activación de células B, diferenciación y función. Además, representan una herramienta prometedora para la vacunación terapéutica o preventiva contra los tumores 9.

En este video se presenta la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Generación y ampliación de los derechos humanos CD40-activa las células B (CD40-B) a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) por la estimulación con el ligando CD40 y la interleucina-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

Las células B activadas por CD40 (células B-CD40) han sido identificadas como una fuente alternativa de células presentadoras de antígenos (APC) inmunoestimuladoras para el cáncer ...

Hola, mi nombre es Alexander Shiku Van Hagen. Soy miembro del Laboratorio de Inmunología y de Inmunología del Trasplante en el Hospital Universitario de Colonia. En este video, les mostraremos cómo podemos generar células B humanas activadas por CD40 a partir de células mononucleares de sangre periférica.Uno de los principales intereses de nuestro laboratorio es el estudio de las funciones independientes de los anticuerpos de las células B. Más allá de su papel como productoras de anticuerpos, las células B tienen una función importante como células presentadoras de antígenos tanto en condiciones fisiológicas como en enfermedades autoinmunes. Tras la activación, las células B pueden adquirir potentes capacidades de presentación de antígenos y estimulación inmunológica, especialmente cuando se activan a través de CD40.CD 40. Las células B activadas presentan varias ventajas en comparación con las células dendríticas. Pueden expandirse fácilmente a un costo relativamente bajo a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica, incluso de pacientes con cáncer.Ahora nuestra estudiante de doctorado, Tanya Leic, y nuestra técnica LER, les darán una introducción paso a paso sobre cómo g

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Un sistema eficiente de la estructura y análisis de la función de un gen en...

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

Este video muestra un ensayo in vitro para generar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfoides comunes (CLPs). Al cocultivar CLPs purificadas con células alimentadoras irradiadas con γ en presencia de ligando (FL) de tirosina quinasa-3 similar a Fms, las CLP se diferencian en pDC no adherentes, cuya presencia se confirma mediante citometría de flujo.

Generación in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfoides comunes

Este video muestra un ensayo para generar células T CD8αβ+ derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) específicas de antígeno tumoral. Las iPSC específicas del antígeno tumoral se cultivan en una monocapa de células estromales y se diferencian en células progenitoras hematopoyéticas (HPC). Las HPC se diferencian en linfocitos T CD4+ CD8+ doble positivo mediante un medio de diferenciación. A continuación, estas células se estimulan para generar células T monopositivas que expresan...

Generación de células T CD8 positivas individuales a partir de células madre pluripotentes inducidas

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Utilizando sistemas de cultivo de múltiples pasos, Divulgamos un in vitro células B al modelo de diferenciación de la célula de plasma.

En Vitro modelo de diferenciación de células de memoria humana Normal B a células plasmáticas duradero

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Aprende a generar células B humanas activadas por CD40 a partir de PBMC mediante estimulación con ligando de CD40 e interleucina-4. Este método permite expandir células con potente capacidad presentadora de antígenos para estudios inmunológicos.

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