Utilizando el cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, En la Investigación de la Visión

Hola, soy Chris Paglia, director del Laboratorio de Procesamiento de Información Visual en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Boston. Hola, soy Jacque Liu, estudiante de doctorado en el laboratorio del Dr. Paglia. Los esfuerzos de investigación de nuestro laboratorio se centran en comprender los cálculos neuronales que permiten a los animales ver.

Para esta investigación, utilizamos una de las criaturas más antiguas de la Tierra, el cangrejo herradura americano. Ahora bien, estos animales pueden ser fósiles vivientes. Continúan desempeñando un papel indispensable en la investigación biomédica.

No solo su sangre contiene células especiales que los científicos utilizan para detectar toxinas bacterianas en nuestros medicamentos, sino que sus ojos también poseen una red neuronal que ha proporcionado gran conocimiento sobre cómo funciona nuestro sistema visual. La base celular de procesos como la adaptación a la luz y la inhibición lateral se reveló por primera vez en estudios de los ojos laterales compuestos del animal, y por este trabajo pionero, el Dr. Keffer Hartline recibió un Premio Nobel en 1967. La coquina sigue siendo un modelo atractivo para la investigación de la visión porque el animal es grande y resistente para ser un invertebrado, y sus neuronas retinianas son grandes y fácilmente accesibles.

Su sistema visual es compacto y ampliamente estudiado, y su comportamiento visual está bien definido. Además, la estructura y función de los ojos se modulan diariamente por un reloj circadiano en el cerebro del animal. En resumen, el sistema visual de los cangrejos herradura es lo suficientemente simple como para ser comprendido, pero lo suficientemente complejo como para resultar interesante.

En este video, ilustraremos tres paradigmas experimentales para investigar la base neurofisiológica de la visión que pueden realizarse in vivo con este modelo animal clásico. Para la investigación de la visión, estos son el registro del electroretinograma, el registro del nervio óptico y el registro intrarretiniano. Los cangrejos herradura se mantienen en un tanque de agua salada aireada, en una habitación expuesta a un ciclo luz-oscuridad regulado.

Antes de comenzar cualquiera de estas técnicas de grabación, los animales se enfrían en un recipiente con hielo durante aproximadamente 10 minutos y luego se sujetan a una plataforma de madera colocando dos tornillos de acero inoxidable en el pro soma y dos en el soma de los EPI. La plataforma tiene un peso inferior de granito para que se hunda en el agua. El electroretinograma o ERG se utiliza para monitorear la sensibilidad ocular a lo largo del tiempo.

Mide la respuesta eléctrica global de todas las células del ojo. Para producir un destello de luz, las herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, solución de Ringer con gelatina de petróleo, una pipeta, un LED, una cámara de registro, tornillos de acero inoxidable y un hisopo de algodón. Utilizamos una cámara de registro casera para medir el ERG.

El cuerpo está diseñado para contener un depósito de solución salina en contacto con el ojo. La tapa contiene un alambre de cloruro de plata para acoplar la solución conductora a un amplificador y un pequeño orificio dimensionado para alojar un LED antes de la fijación. La cara inferior de la cámara está recubierta con vaselina.

Las cámaras se fijan luego sobre el ojo del cangrejo herradura con dos tornillos llenos de solución salina y tapados. El animal se coloca en una jaula hermética a la luz, dentro de un tanque lleno de agua de mar sobre las branquias. El cable del LED se inserta en la tapa de la cámara.

El electrodo de señal se sujeta al cable de la cámara y el electrodo de referencia a uno de los tornillos implantados, y ambos electrodos se conectan a la etapa de entrada de un amplificador diferencial de alta impedancia para la amplificación de la señal y el filtrado de ruido. Luego, se cierra la jaula para evitar que la luz ambiente alcance al animal. La etapa de entrada se conecta al amplificador y los filtros del amplificador se ajustan para permitir el paso de frecuencias por debajo de aproximadamente 10 hercios.

A partir de ahí, la señal asciende al osciloscopio para su visualización y a una tarjeta de adquisición de datos para análisis y almacenamiento en computadora; utilizamos un programa personalizado escrito en LabVIEW para entregar estímulos luminosos desde el LED y para registrar la señal del ERG. El LED se activa con un pulso de 100 milisegundos de cinco voltios cada 10 minutos. A la izquierda se muestra la forma de onda del ERG correspondiente a cada destello de luz, y a la derecha se grafica la amplitud pico a pico de las formas de onda sucesivas para rastrear los cambios en la sensibilidad ocular a lo largo del tiempo.

Con las grabaciones de ERG, se pueden estudiar los efectos de la adaptación a la luz y la modulación neural circadiana. El ojo transmite mensajes visuales al cerebro y las respuestas de potenciales de acción de las fibras de su nervio óptico. Los mensajes codificados pueden estudiarse mediante grabaciones extracelulares de fibras nerviosas individuales.

Los mensajes del reloj circadiano retroalimentados al ojo también pueden estudiarse mediante este método. Las herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, solución de Ringer, tijeras, una cámara de registro, pinzas curvas, una sonda de aguja fina, un escalpelo romo, tijeras quirúrgicas y un electrodo seccional. Las cámaras de registro diseñadas con una lengüeta para acomodar el nervio permiten que 20 mililitros de sangre sean drenados del caballo mediante la inserción de una aguja de calibre 16 entre los músculos de la bisagra y hasta el corazón.

La exsanguinación no es necesaria, pero facilita la disección del nervio óptico con el animal sujeto a la plataforma. La ubicación del nervio óptico se estima trazando una línea ligeramente curva en el carpo entre los ojos lateral y medio. Luego se realiza un orificio circular en el carpo con un refin.

El orificio tiene el mismo diámetro que la base de la cámara. El centro del orificio se encuentra aproximadamente dos centímetros por delante del ojo lateral y ligeramente por encima de la línea, de modo que el nervio discurre a lo largo de la porción ventral de la cámara. Se elimina el tejido conectivo que recubre hasta que sea visible una longitud completa del nervio, y el nervio expuesto se libera del tejido circundante y subyacente. Un hilo se pasa alrededor del nervio y se introduce en la cámara a través de la abertura semicircular en la base.

A través de esta misma abertura, el nervio se guía suavemente hacia la cámara tirando del hilo. A medida que el nervio entra en la cámara, la base se empuja hacia el orificio para minimizar el estiramiento del nervio. Luego, la cámara se fija con dos tornillos y se llena con solución de Ringer.

Después de la fijación de la cámara, el animal se coloca en una jaula de marea luminosa dentro de un tanque lleno de agua de mar sobre las branquias. El interior de la cámara se visualiza bajo un estereoscopio y se coloca algodón alrededor de la abertura inferior para evitar la filtración de sangre hacia el interior y de ringer hacia el exterior de la cámara. La cámara se vuelve a llenar con solución de Ringer fresca.

Se elimina el tejido residual con tijeras y pinzas finas. Se realiza un pequeño corte en la vaina que encapsula el nervio y se separa el nervio de la vaina mediante una sonda de aguja fina. La vaina se va desenrollando y eliminando gradualmente mediante cortes a lo largo del nervio.

Un pequeño haz de fibras se separa entonces del nervio utilizando la sonda y se corta en el extremo más alejado del ojo para la grabación de fibras aferentes y en el extremo más cercano al ojo para la grabación de fibras eferentes. Utilizamos un electrodo de sección con sistema AM lleno con solución Springer para la grabación, que está conectado mediante tubos a una jeringa Gilman para succionar. La punta del electrodo se fabrica calentando y puliendo el extremo de una capilar de vidrio borosilicatado de un milímetro de diámetro; una conexión A y C proporciona la derivación de señal, y la derivación de referencia es un hilo de cloruro de plata enrollado alrededor del electrodo para reducir el ruido.

La punta del electrodo se coloca en la cámara de registro y el extremo cortado del haz nervioso se introduce en la punta de vidrio mediante succión. Los cables de señal y de referencia se conectan al cabezal de un amplificador diferencial para la amplificación de la señal y el filtrado de ruido. La salida del amplificador se transmite a un osciloscopio para visualización y a una tarjeta de adquisición de datos para análisis y almacenamiento por computadora.

Utilizamos un programa personalizado escrito en LabVIEW para controlar los estímulos luminosos y un discriminador digital de picos para registrar trenes de picos. Se emplea un conducto de luz de fibra óptica para la iluminación de una sola célula, mientras que una pantalla de video controlada por computadora se utiliza para la estimulación con patrones junto con grabaciones del nervio óptico, permitiendo estudiar la transmisión de señales entre los ojos y el cerebro a nivel intrarretiniano. El registro consiste en insertar un microelectrodo directamente en las células del ojo y registrar las fluctuaciones del voltaje intracelular inducidas por la luz.

Las herramientas necesarias para este procedimiento incluyen un destornillador, una plataforma lucida en forma de L. Los orificios roscados alojan un microelectrodo sobre el electrodo de vidrio, tornillos de acero inoxidable, pinzas y un escalpelo fino. Después de preparar el cangrejo, se fija un soporte estable, una plataforma de madera, una placa lucida con orificios roscados preestablecidos al carpo con dos tornillos laterales y uno superior.

El animal se coloca en una jaula hermética a la luz dentro de un tanque lleno de agua de mar sobre las branquias. Un microposicionador motorizado se fija firmemente a la cuchilla con tornillos y el brazo del posicionador se alinea sobre el ojo. Se preparan una serie de micropipetas de vidrio a partir de vidrio de silicato con un diámetro externo de un milímetro, y las puntas se rellenan por acción capilar.

Colocando las pipetas en un vial con solución de cloruro de potasio tres molar durante unos minutos, se llena manualmente el resto de la pipeta con la solución salina e inserta en un porta-electrodo micrométrico previamente lleno con solución para prevenir la formación de burbujas. Luego, el porta-electrodo se inserta en la etapa de cabezal de un amplificador intracelular sujeto al microposicionador. Se expone una sección de la retina cortando cuidadosamente una pequeña sección cuadrada de la córnea dorsal.

Con el escalpelo, se coloca una gota de solución de Ringer sobre el tejido expuesto para evitar que se seque, y se avanza la micropipeta hacia la retina. Cuando la punta de la pipeta toca la solución, se activa el modo de inyección de corriente del amplificador intracelular y se mide la impedancia de la micropipeta; se descartan aquellas micropipetas cuya impedancia no esté comprendida entre 20 y 70 megaohmios. Las que presentan una impedancia dentro de este rango se avanzan en pasos de tamaño micrométrico hacia la retina y se introducen en las células mediante la vibración electrónica de la punta; simultáneamente, se aplican estímulos luminosos para penetrar células mediante un conducto de fibra óptica o una pantalla de video.

En el ojo del cangrejo herradura pueden encontrarse tres tipos de células: células ulares, células excéntricas y células pigmentarias. Las células ulares presentan una gran respuesta despolarizante a la luz, las células excéntricas muestran una serie de potenciales de acción superpuestos a una respuesta despolarizante, y las células pigmentarias no presentan ninguna respuesta a la luz. La respuesta se observa en un osciloscopio y se registra en una computadora mediante grabaciones intrarretinianas. Puede estudiarse la base celular de la visión.

Para concluir, hemos mostrado cómo realizar grabaciones de electroretinograma, grabaciones del nervio óptico y grabaciones intrarretinianas en cangrejos herradura in vivo. Estos métodos son ampliamente utilizados y proporcionan información única sobre los mecanismos neuronales del procesamiento de la información visual en cangrejos herradura. No solo son sencillos de aplicar en un laboratorio de investigación, sino que también pueden incorporarse fácilmente en un laboratorio docente de neurofisiología visual.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.