Name: Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Aprenda a construir una biblioteca fosmídica ambiental de gran inserto a partir de ADN genómico de muestras marinas. Este método permite capturar la diversidad genética microbiana para estudios de secuenciación y análisis funcional.

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Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. MT SL y con el apoyo de becas del Centro de TULA financiado por la Fundación para la Diversidad Microbiana y Evolución (CMDE). MT también recibió el apoyo de becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

El procedimiento se describe cómo generar más eficiente una biblioteca fosmid gran inserción con el ADN genómico derivado de una muestra de las aguas costeras. Aguas arriba de extracción de ADN genómico se describe en un protocolo separado [3]. A medida que la producción fosmid-biblioteca es un proceso de varios pasos, el plan de al menos dos a tres semanas de tiempo para el procedimiento completo, incluyendo todos los pasos cuatro que se presentan. La extracción de ADN genómico es el paso m...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Paso II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de producción de biblioteca de fósmidos CopyControl&amp;#8482;</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>suficiente para generar 9-10 bibliotecas de fósmidos</td></tr><tr><td>Agarosa SeaPlaque</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>placa calefactora con agitación</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>buffer de electroforesis 1,0X TAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en campo pulsado CHEF Mapper XA, incluyendo módulo de refrigeración y bomba de velocidad variable</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestión de ADN-&amp;#955; con HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>Marcaje PFG MidRange I</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 10.000X</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>envoltura plástica para microondas</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transiluminador Safe Imager</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Preparación GELase para digerir geles de agarosa</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>bisturí</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>agua libre de nucleasas</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 ensayos*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>calentador digital de bloque seco</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>baño de agua</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>rotor de centrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>tubos microcentrífugos, 1,7 mL, transparentes</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>tubos centrífugos de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Paso III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>caldo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>buffer de dilución de fagos</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>viales criogénicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Paso IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos con tapa</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>placa de 384 pocillos con tapa</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 100 mm de diámetro x 15 mm de alto</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 150 mm de diámetro x 15 mm de alto</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>caldo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>perlas de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>lejía</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>tubos centrífugos de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>seleccionador de colonias QPix</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>cabezal de selección (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

inserte grandes ambiental genómica producción biblioteca

Large Insert Environmental Genomic Library Production

La gran mayoría de los microbios en la naturaleza en la actualidad siguen siendo inaccesibles para los métodos de cultivo tradicionales. Durante la última década, la cultura independiente de la genómica ambiental (<em&gt; Ie</em&gt; Metagenómica) enfoques han surgido, lo que permite a los investigadores a cerrar esta brecha mediante la captura de cultivo el contenido genético de las comunidades indígenas microbiana directa del medio ambiente. Para este fin, las bibliotecas de ADN genómico se construyen usando estándares, aunque ingeniosa técnicas de laboratorio de clonación. A continuación se describe la construcción de una biblioteca genómica insertar grandes fosmid medio ambiente con el ADN derivados de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada de hipoxia. Este protocolo está directamente relacionado con una serie de protocolos de conexión incluyendo el muestreo de las aguas costeras marinas [1], la filtración de grandes volúmenes de biomasa microbiana [2] y la extracción del ADN y el protocolo de purificación [3]. Al principio, el ADN genómico de alta calidad final reparado con la creación de 5-fosforilados extremos romos. Final de reparar el ADN se somete a electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para la selección del tamaño y la extracción de gel se realiza para recuperar los fragmentos de ADN entre 30 y 60 mil pares de bases (Kb) de longitud. ADN tamaño seleccionado se purifica lejos de la matriz de gel PFGE y se ligó con la fosfatasa tratados con extremo romo fosmid CopyControl vector PCC1 (EPICENTRO<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Concatemers lineal de PCC1 y el ADN se inserta posteriormente headfull empaquetados en partículas de fago lambda por terminasa, con posterior infección de resistentes a los fagos<em&gt; E. coli</em&gt; Células. Clones con éxito transducidas se recuperan en placas de agar LB con los antibióticos de selección y se archivan en formato de 384 pocillos placa utilizando una colonia automatizado recoger robot (Qpix2, GENETIX). El protocolo ha sido elaborada a partir de varias fuentes, incluyendo el kit de Producción CopyControl Fosmid Biblioteca de EPICENTRO y los trabajos publicados por varios grupos de investigación [4-7]. Cada paso se presenta con las mejores prácticas en la mente. Siempre que sea posible se destacan las sutilezas de la ejecución para mejorar la calidad y la eficiencia general de la producción de la biblioteca. Todo el proceso de producción de la biblioteca y recoger fosmid colonia automatizado toma por lo menos 70-10 días, ya que hay muchos pasos de incubación incluidos. Sin embargo, hay varios posibles puntos de parada que se mencionan en el protocolo.

Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

La gran mayoría de los microbios de la naturaleza siguen siendo inaccesibles para los métodos de cultivo tradicionales. Durante la última década, los métodos independientes del cultivo...

Hola, soy Marcus to del laboratorio de Steven Helm en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostraremos un procedimiento para la construcción de una biblioteca ambiental con insertos grandes. Me asisten en el procedimiento de hoy San Lee, quien realizará el empaquetamiento de fagos y la infección del huésped de la biblioteca e coli, así como Elise Hawley y Chin Yang, quienes realizarán la selección de colonias.Tenemos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la estructura y el metabolismo de la comunidad microbiana en ambientes marinos y terrestres. Así que comencemos. Este protocolo para crear una biblioteca de ADN fo smid comienza tras el aislamiento y la fragmentación del ADN genómico a partir de muestras de biomasa, procedimientos que hemos detallado en artículos complementarios de JoVE.Los próximos pasos preparan el ADN SHE para la ligación en el vector SMID PCC uno. El primer paso consiste en reparar los extremos de los fragmentos de ADN SHE y realizar la fosforilación. En los extremos cinco primarios, todos los reactivos necesarios para este paso se incluyen en el kit de producción de la biblioteca PCC

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Aquí se describe un método para la preparación de los dos pares de solo lectura y final Illumina Sec-mRNA bibliotecas genómicas para el análisis de expresión genética basado en la amplificación del ARN T7 lineal. Este protocolo requiere solamente 10 nanogramos de ARN total a partir bibliotecas y genera muy consistente que representa transcripciones conjunto.

Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total

El ensayo del reportero genético es una herramienta bien establecida y poderosa para diseccionar la relación entre las secuencias de ADN y sus actividades reguladoras de genes. El acoplamiento de los elementos reguladores candidatos a genes reporteros que llevan etiquetas de secuencia identificativa permite la paralelización masiva de estos ensayos.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Métodos para la generación de bibliotecas de gRNA a gran escala deben ser simple, eficiente y rentable. Se describe un protocolo para la producción de bibliotecas de gRNA basado en la digestión enzimática del ADN diana. Este método, CORALINA (gRNA integral generación de biblioteca a través de la actividad de nucleasa controlados) presenta una alternativa a la síntesis de oligonucleótidos de encargo costosos.

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

Usando un vector binario pBIBAC-GW hace generar plantas transgénicas con inserciones intactas de solo-copia, un proceso fácil. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector a través del proceso de generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y prueba de las plantas para la integridad y copiar el número de los insertos.

Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Este protocolo detalla un enfoque integral para el cultivo, la secuenciación y el ensamblaje del genoma híbrido de novo de las bacterias urinarias. Proporciona un procedimiento reproducible para la generación de secuencias completas y circulares del genoma útiles en el estudio de elementos genéticos cromosómicos y extracromosómicos que contribuyen a la colonización urinaria, la patogénesis y la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos.

Ensamblaje híbrido del genoma de novo para la generación de genomas completos de bacterias urinarias utilizando tecnologías de secuenciación de lectura corta y larga

La mutagénesis insercional es una herramienta esencial en genética avanzada para identificar elementos genómicos funcionales. Aquí, describimos el Cribado basado en la inserción para elementos funcionales y transcripciones (InSET), un método para detectar sitios de integración de lentivirus dentro de una biblioteca de células de mutagénesis de inserción basada en lentivirus.

Identificación de sitios de integración de lentivirus funcionalmente relevantes en una biblioteca de células de mutagénesis insercional

Este protocolo proporciona un método para la optimización global sistemática de biosensores codificados genéticamente a través de la generación y evaluación de bibliotecas genéticas asistidas por automatización. Esto se combina con metodologías de diseño de experimentos para agilizar la experimentación y permitir la selección de componentes genéticos para ajustar los biosensores a resultados de diseño específicos.

Muestreo eficiente del espacio de diseño de biosensores codificados genéticamente habilitado con un diseño de experimentos y flujo de trabajo de automatización

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Aprenda a construir una biblioteca fosmídica ambiental de gran inserto a partir de ADN genómico de muestras marinas. Este método permite capturar la diversidad genética microbiana para estudios de secuenciación y análisis funcional.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

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