Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

Hola, soy Marcus to del laboratorio de Steven Helm en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostraremos un procedimiento para la construcción de una biblioteca ambiental con insertos grandes. Me asisten en el procedimiento de hoy San Lee, quien realizará el empaquetamiento de fagos y la infección del huésped de la biblioteca e coli, así como Elise Hawley y Chin Yang, quienes realizarán la selección de colonias.

Tenemos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la estructura y el metabolismo de la comunidad microbiana en ambientes marinos y terrestres. Así que comencemos. Este protocolo para crear una biblioteca de ADN fo smid comienza tras el aislamiento y la fragmentación del ADN genómico a partir de muestras de biomasa, procedimientos que hemos detallado en artículos complementarios de JoVE.

Los próximos pasos preparan el ADN SHE para la ligación en el vector SMID PCC uno. El primer paso consiste en reparar los extremos de los fragmentos de ADN SHE y realizar la fosforilación. En los extremos cinco primarios, todos los reactivos necesarios para este paso se incluyen en el kit de producción de la biblioteca PCC uno SMID de Epicenter. Para preparar la reacción de reparación de extremos, descongele todos los reactivos sobre hielo y luego combine el tampón de reparación de extremos, la mezcla de dNTP, la enzima T4 polinucleótido cinasa y hasta 20 microgramos de ADN inserto SHE a 0,5 microgramos por microlitro, además de agua, hasta alcanzar un volumen final de 80 microlitros. Centrifugue brevemente el tubo para reunir todo el líquido en el fondo.

Incube la reacción de reparación de extremos a temperatura ambiente durante 45 minutos hasta una hora. Luego, caliente e inactiva las enzimas a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Durante la incubación de reparación de extremos, puede preparar el gel para el siguiente paso.

La electroforesis en gel con campo pulsado, o PFGE, tiene como objetivo aislar moléculas de ADN que varían entre 30 y 60 kilobases. PFGE es un método electroforético para separar estos fragmentos grandes que migran juntos durante la electroforesis estándar. Para comenzar, prepare un gel al 1 % utilizando agarosa de baja fusión en 150 mililitros de tampón de electroforesis 1X TAE.

Seleccione peines que le permitan cargar toda la muestra de 80 microlitros de ADN con reparación de extremos, más el tampón de carga, en uno o dos pocillos. Tenga especial cuidado al manipular el gel, ya que los geles de agarosa de baja fusión se rompen muy fácilmente durante la solidificación.

Prepare la cámara de electroforesis. Añada 2,2 litros de XTAE al recipiente y encienda la máquina para hacer circular el tampón de corrida. Configure el dispositivo de enfriamiento a 14 grados Celsius y ajuste la bomba a 70 RPM.

Incluya un marcador PFG de rango medio también de NEB. Para evitar cortar demasiado alto el gel, extruya aros de la jeringa de gel y corte un pequeño tapón del extremo con el bisturí. Coloque el tapón al frente del pocillo y selle con aros fundido.

Asegúrese de que el tampón de electroforesis haya enfriado a 14 grados Celsius antes de cargar su gel. En el primer pocillo, cargue cinco microlitros del digestivo Lambda Hindi III de New England Biolabs. En el segundo pocillo, cargue un microlitro del marcador de tamaño de control Smid diluido en 10 microlitros de agua estéril más tampón de carga.

Luego cargue su mezcla reparada en los extremos e inactivada por calor, más tampón de carga. Cierre la tapa y programe la máquina. La electroforesis en gel se realizará durante la noche o 12 horas.

Una vez finalizada la electroforesis, utilice una tinción con cyber gold para visualizar el ADN. Diluya el cyber gold en 250 mililitros de TAE 1X, coloque el gel en la solución y tiña durante una hora en la oscuridad, ya que el cyber gold es sensible a la luz. Mientras el gel se tiñe, prepare un baño de agua a 70 grados Celsius y otro a 45 grados Celsius para el paso posterior de extracción del gel.

El siguiente paso consiste en resecar y purificar en gel el ADN dentro del rango de tamaño deseado, de 30 a 60 kilobases. Lleve su gel teñido junto con un tubo microfuge vacío, rotulado y estéril, así como un escalpelo estéril, al transiluminador de luz azul.

Forre el transiluminador con papel de plástico para evitar la contaminación cruzada de su gel. Póngase las gafas de visualización y encienda la luz azul. Ahora puede ver su ADN genómico con extremos reparados y el marcador de tamaño FO smid. Con el bisturí, excave un trozo de gel de cinco a siete milímetros de ancho que haya migrado junto y ligeramente por encima del marcador de tamaño smid.

Utilice el marcador PFG como límite superior para su corte. Transfiera el corte al tubo rasgado. Puede almacenar los cortes a menos 20 grados Celsius durante hasta un año antes de continuar.

Ahora es el momento de hacer la electroforesis en gel. Purifique el ADN de su fracción. Pese el tubo que contiene su fracción de gel y calcule el peso de la fracción restando el peso del tubo vacío.

A continuación, derrita la porción de gel en el baño de agua a 70 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Una vez que la porción de gel se haya derretido completamente, transfiera rápidamente el tubo al baño de agua a 45 grados Celsius. Tenga en cuenta que un miligramo de gel sólido tiene un volumen de un microlitro después de derretirse.

Añada una unidad o un microlitro de preparación de enzima Jase por cada 100 microlitros de aros fundido. Incube a 45 grados Celsius durante una hora. Luego añada de dos a cuatro microlitros más de les e incube a 45 grados Celsius durante una hora más de calor.

Inactive el gel a 70 grados Celsius durante 10 minutos después del calor. Para inactivar la enzima, coloque el tubo en hielo durante 10 minutos y luego centrifugue a velocidad máxima, 13.000 RPM durante 15 minutos para formar un precipitado con cualquier partícula insoluble.

Teniendo cuidado de no perturbar el precipitado. Retire el sobrenadante superior que contiene el ADN purificado y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, dilúyalo con tres mililitros de agua estéril para lavar y concentrar el ADN.

Transfiera la solución desde el tubo cónico de 15 mililitros al dispositivo de filtro centrífugo Ancon Ultra cuatro con una membrana ultra cel 10. Coloque la unidad de filtro en un rotor de cubeta oscilante utilizando un tubo cónico de 50 mililitros como adaptador y centrifugue a 4.000 ×g durante seis a ocho minutos. Centrifugue hasta obtener aproximadamente entre 100 y 500 microlitros de solución.

Quede en el filtro y deseche el flujo que pasa. Luego agregue otros tres mililitros de agua estéril al tubo falcon vacío. Transfiera la solución al tubo Amon y repita el paso de centrifugación.

Lave el tubo Falcon por tercera vez y reduzca el volumen final recogido en el filtro a entre 50 y 100 microlitros. No es necesario preocuparse por la pérdida de la muestra. El filtro retendrá 50 microlitros de líquido incluso después de una centrifugación prolongada.

Transfiera la solución de ADN restante desde el tubo AmCon a una unidad de filtro centrífugo MicroCon YM 50 previamente lavada y enjuague el tubo Amon con 50 microlitros adicionales de agua estéril para recuperar todo el ADN mediante centrifugación. Coloque la unidad de filtro centrífugo MicroCon YM 50 en una microcentrífuga a 10.000 ×g hasta que el filtro aún esté ligeramente cubierto con líquido. Revise cada minuto.

Si solo queda una pequeña cantidad de líquido en el filtro, invierta el filtro y recupere su solución de ADN mediante un segundo paso de centrifugación a 1000 GS durante tres minutos en un tubo microcentrífugo nuevo. El volumen resultante no debe superar los 10 a 15 microlitros en total.

De lo contrario, su ADN podría estar demasiado diluido para la ligación. Verifique la concentración de la solución de ADN resultante mediante NanoDrop o ensayo con Pico Green. Recuperado y reparado.

El ADN ya está listo para ser ligado al vector de clonación PCC one FO SMID. Para la ligación, descongele todos los reactivos en hielo. Luego, combínelos en el orden indicado aquí, mezclando después de cada adición. Primero, agregue agua estéril para alcanzar un volumen de reacción de 10 microlitros.

Luego, 10 x tampón de ligación rápida, A-T-P-P-C-C 10 milimolar, un vector SMID y el inserto en una proporción molar de 10 a 1. Y finalmente, ADN ligasa rápida. Centrifugar brevemente el tubo para reunir todo el líquido en el fondo.

Toque el tubo y centrifugue nuevamente. Incube la reacción de ligación a temperatura ambiente durante dos horas e inactivar la enzima por calor durante 10 minutos a 70 grados Celsius. En este punto, puede almacenar la reacción de ligación a menos 20 grados Celsius o proceder al paso de empaquetamiento del fago.

El siguiente paso consiste en generar fagos bacterianos que funcionarán para introducir su biblioteca FO SMID en E. coli. De dos a tres días antes de planificar el paso de empaquetamiento del fago, siembre en un plato LB común la cepa de EPI 300 T resistente a la placa proporcionada y cultívelo durante la noche a 37 grados Celsius para obtener colonias aisladas. Puede sellar este plato y almacenarlo a cuatro grados Celsius para uso futuro. El día anterior a las reacciones de empaquetamiento, inocule 50 mililitros de caldo Albee más sulfato de magnesio 10 milimolar con una colonia aislada de su placa Epi 300. Agite a 225 RPM y 37 grados Celsius durante la noche.

El día de las reacciones de empaquetamiento, inocule 50 mililitros frescos de caldo LB con 10 milimolar de sulfato de magnesio con cinco mililitros de la cultura de la noche anterior. Incube las bacterias a 37 grados Celsius hasta alcanzar una DO600 de 0,8 a 1,0. No sobrepase una DO600 de 1,0.

Diluya su muestra antes de medirla en el espectrofotómetro para obtener un resultado preciso. Almacénela en hielo o a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para continuar o hasta 72 horas. Ahora que las bacterias están listas para la infección, es momento de preparar el descongelado del fago.

Los extractos de embalaje máximos de Lambda se mantienen en hielo. Utilizando un tubo por cada reacción de ligación, la descongelación tardará aproximadamente de 10 a 15 minutos. Mientras tanto, enfríe previamente un tubo vacío de 1,5 mililitros en hielo, utilizando nuevamente un tubo por cada reacción.

Una vez que los extractos de empaquetamiento de Lambda se hayan descongelado, transfiera inmediatamente 25 microlitros de cada extracto de empaquetamiento al tubo microfuga de 1,5 mililitros previamente enfriado y colóquelo en hielo. Devuelva el extracto de empaquetamiento restante a menos 80 grados Celsius. Dejar los extractos de empaquetamiento descongelados en hielo durante demasiado tiempo reducirá la eficiencia de infección.

A continuación, agregue 10 microlitros de la reacción de ligación a cada 25 microlitros de los extractos descongelados sobre hielo, mezclando mediante pipeteo varias veces sin introducir burbujas de aire. Centrifugue brevemente para reunir todo el líquido en el fondo de los tubos e incube las reacciones de empaquetamiento en un baño de agua a 30 grados Celsius durante 90 minutos. Después de 80 minutos de incubación, descongele el extracto de empaquetamiento restante sobre hielo.

Una vez completada la reacción de empaquetamiento de 90 minutos, agregue los 25 microlitros restantes del extracto de empaquetamiento a cada tubo de reacción. Incube las reacciones durante 90 minutos adicionales a 30 grados Celsius. Después de la segunda incubación, agregue 100 microlitros del tampón de dilución de fagos preparado a cada tubo de empaquetamiento y mezcle suavemente; luego añada cinco microlitros de cloroformo a cada tubo.

Ahora debería tener un volumen total de 165 microlitros en el tubo. Puede formarse un precipitado viscoso tras la adición de cloroformo. Evite este precipitado, así como la fase orgánica de cloroformo, al pipetear las partículas fágicas.

En este momento, puede almacenar las partículas de fago empaquetadas a cuatro grados durante varios días si es necesario, pero utilice fagos recién preparados para obtener los mejores resultados. Ahora está listo para infectar las células huésped, que ha estado cultivando durante los pasos de empaquetamiento del fago, con el fago empaquetado. Añada el fago empaquetado a células huésped resistentes EPI 300 T1 con una DO600 de 0,8 a 1,0, en una proporción de 400 microlitros de células resistentes EPI 300 T1 por cada 10 microlitros de partículas de fago.

Para evitar la pipetación de cualquier cloroformo del fondo del tubo de fagos empaquetados, se utilizan 125 microlitros de partículas de fago empaquetadas y cinco mililitros de células huésped resistentes epi 300 T1 preparadas, mezcladas suavemente y luego incubadas a 37 grados Celsius durante 30 minutos. El siguiente paso consiste en determinar la titulación del fago empaquetado. Esto se realiza sembrando las bacterias infectadas en un medio para seleccionar las células infectadas.

Luego cuente las colonias resultantes y divida por el volumen de fagos añadido a las bacterias que sembró. El C one SMID contiene un gen de resistencia a cloranfenicol. Por lo tanto, para seleccionar clones infectados, siembre las bacterias en placas de LB que contengan cloranfenicol.

Extienda dos veces 50 microlitros y dos veces 10 microlitros de las células resistentes a EPI 300 T1 infectadas con fago en cuatro placas separadas y coloque las placas boca abajo en un incubador a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas, no más de 48 horas, hasta que se formen colonias. Mientras tanto, recoja las células resistentes a EPI 300 T1 residuales del cultivo de cinco mililitros por centrifugación a 3.500 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Deseche el sobrenadante.

Añada un mililitro de LB con glicerol al 20 % al tubo de resuspensión. Suspender el botón celular y distribuir en alícuotas de 100 microlitros cada una en tubos criogénicos de dos mililitros, congelar inmediatamente y almacenar a menos 80 grados Celsius. Para su uso posterior en el paso de selección de colonias al día siguiente, cuente el número de clones en las cuatro placas en el incubador a 37 grados Celsius y determine la titulación del fago empaquetado, que utilizará en el siguiente paso.

El stock resistente de glicerol congelado de EPI 300 T uno contiene células transducidas con todos los plásmidos diferentes de su biblioteca. A continuación, siembre una cantidad adecuada según el título viral y el tamaño de la placa de cada smid. Clone en un cuadrado de 2,45 por 2,45 milímetros.

Placas de bioensayo de LB con cloranfenicol utilizando perlas de vidrio. Añada también una pequeña cantidad de caldo LB a la placa para distribuir sus células de manera uniforme. Tenga en cuenta que la preparación del stock de glicerol concentra adicionalmente sus células aproximadamente cinco veces.

Incubar a 37 grados Celsius durante 24 horas en los días de selección de colonias; preparar 96 placas de 84 pocillos o 3 placas de 84 pocillos, llenas con 200 microlitros o 70 microlitros por pocillo de caldo LB. Suplementado con 12,5 microgramos de cloranfenicol por mililitro de caldo para selección con antibiótico y 10 % de glicerol para congelación. Utilizamos el sistema automatizado de llenado de placas qfi tres para este paso.

El siguiente paso consiste en seleccionar colonias de sus placas LB CLORAMFENICOL preparadas y transferirlas a sus placas de 96 o 384 pocillos preparadas para congelación. Para este paso, estamos utilizando el robot de selección de clones qix two, de acuerdo con el manual del usuario, para crear un entorno estéril alrededor del área de selección de clones. Encienda la luz ultravioleta durante 30 minutos mientras la luz UV esté encendida.

Prepare 500 mililitros de lejía al 1%, 500 mililitros de agua desionizada estéril y 500 mililitros de etanol al 80%. Cuando se apague la luz UV, llene las bandejas según la etiqueta, de atrás hacia adelante. Llene con lejía al 1%, luego con agua desionizada autoclavada y con etanol al 80% en la bandeja delantera.

Asegúrese de que estén llenos, ya que las agujas de selección no se pueden lavar adecuadamente sin una solución de lavado suficiente. Después de configurar los parámetros para una selección óptima, retire las tapas de sus placas bacterianas y de las placas de 96 o 384 pocillos llenas con LB, y colóquelas entre los postes del Q Picks. Las placas de la zona de trabajo deben estar ajustadas contra la esquina frontal derecha para que no se muevan durante la selección.

Luego cierre el panel frontal. Una vez que todos los parámetros estén configurados, puede comenzar el procedimiento de selección. Cuando se haya completado toda la selección, enjuague los cepillos y bandejas con agua desionizada y colóquelos sobre el banco para que sequen.

Limpie cualquier derrame que pueda haber ocurrido y limpie el interior del CICS con etanol al 80 %. Asegúrese de que todas las placas de stock de glicerol estén etiquetadas y colóquelas en el incubador a 37 grados Celsius durante 24 horas para cultivar una colonia a partir de cada una seleccionada. Deje una nota en el incubador que incluya la fecha, el número de placas incubadas, la hora de incubación, la hora de retirada y sus iniciales.

Después de la incubación, tendrá su biblioteca. Cada pocillo contiene un cultivo de un clon bacteriano que posee el PCC con un fragmento de ADN insertado proveniente de su muestra inicial. Congele las placas a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo y felicítese por un trabajo bien hecho.

El protocolo presentado describe el procedimiento para generar una biblioteca ambiental de SMID con el fin de capturar el contenido genético de una comunidad microbiana en un hábitat determinado. Este protocolo debe crear una biblioteca de SMID representativa del contenido genético del ambiente muestreado y debe permitir al lector optimizar los pasos críticos. Si la cantidad de clones de FO SMID obtenidos al final de todo el procedimiento es demasiado baja.

Acabamos de mostrarle cómo construir la biblioteca FO SMID a partir de ADN genómico derivado de una muestra de agua marina. Al realizar este procedimiento, es importante comenzar con ADN genómico de alta calidad. Tenga listas todas sus placas y reactivos antes de comenzar y planifique tiempo suficiente para este proceso de múltiples pasos.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.