Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

Hola, soy Marcus to del laboratorio de Steven Helm en el Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy le mostraremos un procedimiento para la construcción de una gran biblioteca ambiental de insertos. Ayudándome en el procedimiento de hoy está San Lee, que realizará el empaquetamiento de fagos y la infección de la E. coli huésped de la biblioteca, así como Elise Hawley y Chin Yang, que realizarán la selección de colonias.

Contamos con este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la estructura y el metabolismo de la comunidad microbiana en ambientes marinos y terrestres. Así que comencemos. Este protocolo para la creación de una biblioteca de ADN fo smid comienza después del aislamiento y cizallamiento del ADN genómico de muestras de biomasa, procedimientos que hemos detallado en los artículos adjuntos.

Los siguientes pasos preparan el ADN SHE para la ligadura en el vector SMID PCC uno. El primer paso es reparar los extremos de los fragmentos de ADN y fosforilados. Los cinco extremos primarios, todos los reactivos necesarios para este paso están incluidos en el PCC un kit de producción de biblioteca SMID desde el epicentro para configurar la reacción de reparación final, descongele todos los reactivos en hielo, luego combine el tampón de reparación final DNTP, mezcle un TP de hasta 20 microgramos de ADN insertado a 0,5 microgramos por microlitro mezcla de enzimas y agua Para alcanzar los 80 microlitros, centrifugar brevemente el tubo para que todo el líquido llegue al fondo.

Incube la reacción de reparación final a temperatura ambiente durante 45 minutos a una hora. Luego calentar, inactiva las enzimas a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Durante la incubación de reparación final, puede preparar el gel para el siguiente paso.

Electroforesis en gel de campo pulsado o PFGE, su objetivo es aislar moléculas de ADN que van de 30 a 60. Kilobases PFGE es un método electroforético para resolver estos grandes fragmentos que se unen durante la electroforesis estándar. Para empezar, prepare un gel al 1% con aros de bajo punto de fusión en 150 mililitros de un tampón de funcionamiento XTAE.

Elija peines que le permitan cargar la muestra completa de 80 microlitros de ADN de reparación final más el tampón de carga en uno o dos pocillos. Tenga especial cuidado al manipular el gel como geles agros de bajo punto de fusión. Se rompe muy fácilmente mientras el gel se solidifica.

Prepare la cámara de electroforesis. Agregue 2,2 litros de un XTAE en la cámara y encienda la máquina para hacer circular el tampón de funcionamiento. Ajuste el dispositivo de enfriamiento a 14 grados centígrados y configure la bomba a 70 RPM.

Incluye un marcador PFG de rango medio también de NEB. Para evitar cortar el gel demasiado alto, extruya aros de la jeringa de gel y corte un pequeño tapón del extremo con el bisturí. Coloque el tapón en la parte delantera del pozo y selle con aros fundidos.

Asegúrate de que el tampón de funcionamiento se haya enfriado a 14 grados centígrados antes de cargar el gel. En el primer pozo se cargan cinco microlitros de New England Biolabs Lambda Hindi tres digestores. En el segundo pocillo cargue un microlitro del marcador de tamaño de control Smid diluido en 10 microlitros de agua estéril más tampón de carga.

A continuación, cargue su extremo de mezcla reparada e inactivada por calor más el tampón de carga. Cierre la tapa y programe la máquina. El gel funcionará durante toda la noche o 12 horas.

Cuando el gel termine de funcionar, use una mancha de oro cibernético para visualizar que el ADN diluye el oro cibernético. En 250 mililitros de un XTAE, coloque su gel en la solución y manche durante una hora en la oscuridad cyberg gold es sensible a la luz mientras el gel se mancha. Prepare un baño de agua a 70 grados centígrados y uno a 45 grados centígrados para el paso de extracción del gel que sigue.

El siguiente paso es realizar impuestos especiales y gelificar. Purifique el ADN dentro del rango de tamaño deseado de 30 a 60 kilobases. Lleva el gel manchado junto con un tubo de microsubterfugio vacío, desgarrado y etiquetado y un bisturí estéril al transiluminador de luz azul.

Cubra el transluminador con una envoltura de plástico para evitar la contaminación cruzada de su gel. Amanece las gafas de visualización y enciende la luz azul. Ahora puede ver su ADN genómico reparado y el marcador de tamaño de control FO smid Con el bisturí, extirpe un corte de gel de cinco a siete milímetros de ancho que migró con y ligeramente por encima del marcador de tamaño de control smid.

Utilice el marcador PFG como límite superior para su rebanada. Transfiera la rebanada al tubo rasgado. Puede almacenar las rodajas a menos 20 grados centígrados hasta por un año antes de continuar.

Ahora es el momento de gelificarse. Purifica el ADN de tu rebanada. Pesa el tubo que contiene la rebanada de gel y calcula el peso de la rebanada restando el peso de la lágrima.

A continuación, derrita la rodaja en el baño de agua a 70 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Después de que la rebanada de gel se haya derretido por completo, transfiera el tubo rápidamente al baño de agua a 45 grados centígrados. Tenga en cuenta que un miligramo de gel sólido tiene un volumen de un microlitro después de derretirse.

Añadir una unidad o un microlitro de preparado enzimático Jase por cada 100 microlitros de aros derretidos. Incubar a 45 grados centígrados durante una hora. Luego agregue de dos a cuatro microlitros más y cocine a 45 grados centígrados durante una hora más de calor.

Inactive el gel a 70 grados centígrados durante 10 minutos después del calor. Inactivando la enzima, colocó el tubo en hielo durante 10 minutos y luego centrifugado a máxima velocidad. 13.000 rpm durante 15 minutos para pellet cualquier partícula insoluble.

Teniendo cuidado de no perturbar el pellet. Retira el sobrenadante superior que contiene tu ADN purificado y transfiérelo a un tubo de halcón de 15 mililitros. A continuación, se le añade tres mililitros de agua estéril para lavar y concentrar el ADN.

Transfiera la solución del tubo Falcon de 15 mililitros a la unidad de filtro centrífugo Ancon Ultra cuatro con una membrana ultra celda 10. Coloque la unidad de filtro en un rotor de cubo oscilante utilizando un tubo falcon de 50 mililitros como adaptador y gire a 4.000 GS durante seis a ocho minutos. Centrifugar hasta aproximadamente 100 a 500 microlitros de solución.

Permanezca en el filtro y deseche el flujo a través de él. Luego agregue otros tres mililitros de agua estéril al tubo de halcón vacío. Transfiera la solución al tubo Amon y repita el paso de centrifugación.

Lave el tubo falcon por tercera vez y reduzca el volumen final recogido en el filtro a 50 a 100 microlitros. No tiene que preocuparse por perder la muestra. El filtro retendrá 50 microlitros de líquido incluso después de una centrifugación prolongada.

Transfiera la solución de ADN restante del tubo AmCon a una unidad de filtro centrífugo MicroCon YM 50 prelavada y enjuague el tubo Amon con 50 microlitros adicionales de agua estéril para recuperar toda la centrífuga de ADN. La unidad de filtro centrífugo MicroCon YM 50 en una microcentrífuga a 10.000 GS hasta que el filtro aún esté ligeramente cubierto de líquido. Compruébalo cada minuto.

Si solo queda una pequeña cantidad de líquido en el filtro. Dé la vuelta al filtro y recupere su solución de ADN mediante un segundo paso de centrifugación a 1000 GS durante tres minutos en un tubo de microcentrífuga nuevo. El volumen resultante no debe exceder los 10 a 15 microlitros en total.

De lo contrario, su ADN podría estar demasiado diluido para la ligadura. Compruebe la concentración de la solución de ADN resultante mediante el ensayo NanoDrop o Pico Green. Recuperado y reparado.

El ADN ya está listo para ser ligado al vector de clonación PCC one FO SMID para la ligadura y descongelación de todos los reactivos en hielo. Luego se combinan en el orden que se indica aquí, mezclando después de cada adición. Primero, agregue agua estéril para alcanzar un volumen de reacción de 10 microlitros.

A continuación, 10 x tampón de ligadura de enlace rápido, 10 milimolares A-T-P-P-C-C un vector SMID e insértelo en una proporción de 10 a un molar. Y, por último, el ADN ligasa de enlace rápido. Centrifuga brevemente el tubo para que todo el líquido llegue al fondo.

Golpea el tubo y vuelve a girar. Incubar la reacción de ligadura a temperatura ambiente durante dos horas y calentar la enzima inactiva durante 10 minutos a 70 grados centígrados. En este punto, puede almacenar la reacción de ligadura a menos 20 grados centígrados o continuar con el paso de empaquetado de fagos.

El siguiente paso es generar fagos bacterianos que funcionarán para introducir su biblioteca FO SMID en e-coli dos o tres días antes de que planee hacer el paso de empaquetado de fagos, rayar la cepa de recubrimiento EPI 300 T provista una cepa de placa resistente en una placa LB lisa e incubar durante la noche a 37 grados Celsius para obtener colonias individuales. Puede sellar esta placa y almacenarla a cuatro grados centígrados para usarla en el futuro. El día antes de las reacciones de envasado, inocule 50 mililitros de caldo Albee más 10 milimolares de sulfato de magnesio con una sola colonia de su plato Epi 300 Shake a 225 RPM y 37 grados Celsius durante la noche.

El día de las reacciones de envasado, inocule caldo fresco de 50 mililitros LB más 10 milimolares de sulfato de magnesio con cinco mililitros del cultivo durante la noche. Cultivo, las bacterias a 37 grados Celsius a un OD 600 de 0,8 a 1,0. No exceda OD 600 de 1.0.

Diluya su muestra antes de medir en el espectrofotómetro para obtener un resultado preciso. Almacene en hielo o a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para continuar o hasta 72 horas. Ahora que las bacterias están listas para la infección, es hora de preparar el deshielo de los fagos.

Las placas máximas que Lambda Packaging extrae en hielo. Usando una trompa por reacción de ligadura, la descongelación tomará entre 10 y 15 minutos. Mientras tanto, enfríe previamente un tubo vacío de 1,5 mililitros en hielo nuevamente usando un tubo por reacción.

Una vez que los extractos de empaque de Lambda se hayan descongelado, transfiéralos inmediatamente a 25 microlitros de cada extracto de empaque al tubo de micro fuga preenfriado de 1,5 mililitros y colóquelo en hielo. Vuelva a colocar el extracto restante del envase a menos 80 grados centígrados. Dejar los extractos de empaque descongelados en hielo durante demasiado tiempo reducirá la eficiencia de la infección.

A continuación, añadir 10 microlitros de la reacción de ligadura a cada 25 microlitros de los extractos descongelados en hielo mezclados pipeteando la solución varias veces sin introducir burbujas de aire. Centrifugar brevemente para consolidar todo el líquido en el fondo de los tubos e incubar las reacciones de envasado en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 90 minutos. Después de 80 minutos de incubación, descongele el extracto de empaque restante en hielo.

Una vez completada la reacción de envasado de 90 minutos, añada los 25 microlitros restantes de extracto de envasado a cada tubo de reacción. Incubar las reacciones durante 90 minutos adicionales a 30 grados centígrados. Después de la segunda incubación, agregue 100 microlitros del tampón de dilución de fagos preparado en cada tubo de empaque y mezcle suavemente y agregue cinco microlitros de cloroformo a cada tubo.

Ahora deberías tener un volumen total de 165 microlitros en el tubo. Un precipitado viscoso puede formarse después de la edición con cloroformo. Evite este precipitado, así como la fase de cloroformo orgánico, al pipetear las partículas de fagos.

En este punto, puede almacenar las partículas de fago empaquetadas a cuatro grados durante varios días si es necesario, pero use fago recién preparado para obtener mejores resultados. Ahora está listo para infectar las células huésped, que ha estado creciendo a lo largo de los pasos de empaquetado del fago con el fago empaquetado. Añada el fago empaquetado a las células huésped resistentes EPI 300 T one OD 600,8 a 1,0 en la proporción de 400 microlitros de células resistentes epi 300 T one por cada 10 microlitros de partículas de fago.

Para evitar el pipeteo del fondo del tubo de fago empaquetado, utilizamos 125 microlitros de las partículas de fago empaquetadas y cinco mililitros de células huésped resistentes epi 300 T una preparadas mezcladas suavemente y luego incubamos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. El siguiente paso es determinar el título del fago empaquetado. Para ello, coloque las bacterias infectadas en un medio para seleccionar las células infectadas.

A continuación, cuenta las colonias resultantes y divídelas por el volumen de fago añadido a las bacterias que has comprimido. El SMID C one contiene un gen de resistencia al cloranfenicol. Por lo tanto, para seleccionar clones infectados, coloque las bacterias en placas LB que contengan cloranfenicol.

Extienda dos veces 50 microlitros y dos veces 10 microlitros del fago infectado con células resistentes EPI 300 T one en cuatro placas separadas y coloque las placas boca abajo en una incubadora a 37 grados centígrados durante 16 a 24 horas, no más de 48 horas hasta que se formen colonias. Mientras tanto, recoseche las células residuales resistentes a EPI 300 T one de la infección de cinco mililitros mediante centrifugación a 3.500 GS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.

Añadir un mililitro de LB con un 20% de glicerol al tubo de resus. Suspenda el pellet de celda y el cuatrimestre a 100 microlitros cada uno en tubos de viales criogénicos de dos mililitros, congele inmediatamente y almacene a menos 80 grados Celsius. Para su uso posterior en el paso de selección de colonias al día siguiente, cuente el número de clones en las cuatro placas de la incubadora de 37 grados centígrados y determine el título del fago empaquetado, que utilizará en el siguiente paso.

El stock de glicerol resistente EPI 300 T one congelado contiene células transducidas con todos los diferentes plásmidos de su biblioteca. A continuación, distribuya una cantidad adecuada en función del título viral y el tamaño de la placa de cada pizca. Clonar en un cuadrado de 2 45 por 2 45 milímetros.

Placas de bioensayo de LB con cloranfenicol utilizando perlas de vidrio. También agregue una pequeña cantidad de caldo LB al plato para esparcir sus células de manera uniforme. Tenga en cuenta que la preparación de la reserva de glicerol también concentra sus células aproximadamente cinco veces.

Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas en los días de recolección de colonias, preparar 96 o 3 placas de 84 pocillos llenas de 200 microlitros o 70 microlitros por pocillo de caldo LB. Suplementado con 12,5 microgramos de cloranfenicol por mililitro de caldo para la selección de antibióticos y 10% de glicerol para la congelación. Utilizamos el sistema automatizado de llenado de tres placas qfi para este paso.

El siguiente paso es recoger las colonias de sus placas preparadas de LB CHLORAMPFENICOL en sus placas preparadas de 96 o 3 84 pocillos para congelar. Para este paso, estamos utilizando el robot de selección de clones qix two, de acuerdo con el manual del usuario, para crear un entorno estéril alrededor del área de recolección de clones. Encienda la luz ultravioleta durante 30 minutos mientras la luz ultravioleta está encendida.

Prepare 500 mililitros de lejía al 1%, 500 mililitros de agua desionizada estéril y 500 mililitros de etanol al 80%. Cuando la luz ultravioleta se apague, llene las bandejas como está etiquetada de atrás hacia adelante. Rellene con un 1% de lejía, luego agua desionizada en autoclave y un 80% de etanol en la bandeja frontal.

Asegúrese de que estén llenos, ya que las agujas de recogida no se pueden lavar correctamente sin suficiente solución de lavado. Después de configurar los parámetros para una selección óptima, retire las tapas de las placas bacterianas y las placas de 96 o 3 84 pocillos llenas de LB y colóquelas entre los postes de las púas Q. Las placas del área de trabajo deben estar apretadas contra la esquina delantera derecha para que no puedan moverse durante la recolección.

A continuación, cierre el panel frontal. Una vez que se establecen todos los parámetros, puede comenzar el procedimiento de selección. Cuando se haya completado toda la recolección, enjuague los cepillos y las bandejas con agua desionizada y colóquelos en el banco para que se sequen.

Limpie cualquier derrame que pueda haber ocurrido y limpie el interior del CICS con etanol al 80%. Asegúrese de que todas las placas de glicerol estén etiquetadas y colóquelas en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas para cultivar un cultivo de cada colonia seleccionada. Deje una nota en la incubadora que contenga la fecha, el número de placas incubadas, la hora de incubación, la hora de extracción y sus iniciales.

Después de la incubación, tienes tu biblioteca. Cada pocillo contiene un cultivo de un clon bacteriano que contiene el PCC ligado a una pieza de ADN puro de su muestra inicial. Congele las placas a menos 80 grados centígrados para almacenarlas a largo plazo y felicítese por un trabajo bien hecho.

El protocolo presentado describe el procedimiento de cómo generar una biblioteca smid ambiental para capturar el contenido genético de una comunidad microbiana en un hábitat determinado. Este protocolo debe crear una biblioteca SMID, que sea representativa del contenido genético del entorno muestreado, y debe permitir al lector optimizar los pasos críticos. Si la cantidad de clones de FO smid obtenidos al final de todo el procedimiento es demasiado baja.

Acabamos de mostrarte cómo construir la biblioteca FO SMID a partir de ADN genómico derivado de una muestra de agua marina. Al realizar este procedimiento, es importante comenzar con ADN genómico de alta calidad. Tenga todas sus placas y reactivos listos antes de comenzar y planifique suficiente tiempo para este proceso de varios pasos.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.