Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones

Este procedimiento comienza con la fabricación de un microelectrodo sobre un sustrato de silicona. Se forma una monocapa autoensamblada de polietilenglicol sobre el microelectrodo y el sustrato para evitar el ensuciamiento de los microtúbulos. A continuación, se preparan los microtúbulos marcados con el rumino.

Finalmente, los microtúbulos se modelan en los electrodos mediante electroforesis. Hola, soy John Noel del Laboratorio Nana del Departamento de Física y del Laboratorio de Biomecánica Molecular del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas a y M. Soy Wil Free Teza, del departamento de física y director del Centro de Ciencia y Tecnología de la Universidad de Texas.

Y yo soy Juan Quang, director del Laboratorio de Biomecánica Molecular del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas y la Universidad de Texas. Hoy le mostraremos un procedimiento para fabricar microelectrodos recubiertos con una monocapa autoensamblada que no se ensucia. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la paled de microtubos mediante electroforesis.

Así que comencemos. Para empezar, utiliza un cortador de obleas para cortar las obleas de silicona en trozos de un centímetro por 1,5 centímetros para utilizarlos como sustratos. Ahora limpie los sustratos colocándolos en un vaso de precipitados con suficiente acetona para cubrirlos y sonicar durante cinco minutos sin permitir que los sustratos se sequen.

Enjuáguelos con acetona fresca y luego enjuáguelos inmediatamente nuevamente en isopropanol y use nitrógeno para secarlos. Utilizando fotolitografía de tono positivo estándar o litografía por haz de electrones, fabrique los microelectrodos de oro en los sustratos limpios. Al diseñar la geometría del patrón, mantenga el diámetro de cada patrón de electrodo por debajo de 100 micras Para garantizar la cobertura por el polietilenglicol trimeth oxy seline monocapa autoensamblado o peg Sam, incluya almohadillas de contacto colocadas de 300 a 500 micrómetros del patrón con una línea de un milímetro que conecte la almohadilla con el electrodo.

Después de desarrollar el patrón en la capa de resistencia, use pinzas para rascar una línea en la resistencia desde la almohadilla de contacto hasta el borde del sustrato. Tras la deposición del metal, el arañazo permitirá el contacto eléctrico entre el electrodo y el borde del sustrato. Se utiliza una cámara de deposición, preferiblemente con dos fuentes, para depositar la capa metálica.

Los electrodos se forman por deposición de dos nanómetros de cromo, seguidos de seis nanómetros de oro Sin romper el vacío, se puede utilizar una microbalanza de cristal de cuarzo equipada dentro de la cámara para medir el espesor de las películas durante la deposición. Ahora podemos comenzar a preparar la monocapa autoensamblada en un área bien ventilada, precalentar y hornear a 75 grados centígrados. Prepare la solución de ización añadiendo un mililitro de peg selina a 20 mililitros de tolueno en un vaso de precipitados de vidrio de 250 mililitros.

Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces y luego revolviendo con la pipeta durante 30 segundos. Coloque las muestras de patrones en el vaso de precipitados con el patrón hacia arriba, asegurándose de que estén completamente sumergidas en la solución y espaciadas uniformemente en la parte inferior del vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en el horno y hornee durante 18 a 21 horas mientras se forma el Sam.

Prepare el contraelectrodo depositando un nanómetro de cromo seguido de cuatro nanómetros de oro en un cubreobjetos de vidrio de 22 por 50 milímetros. El contraelectrodo debe ser casi transparente con un tinte gris claro o rosado. Guarde el contraelectrodo con el lado recubierto hacia arriba en una placa de Petri para mantenerlo limpio.

Después de 18 a 21 horas en el horno, retire el vaso de precipitados del horno. El tolueno debería haberse evaporado, dejando las muestras de patrón en un residuo viscoso de clavija clina. Agregue 20 mililitros de tolueno al vaso de precipitados y remoje las muestras durante uno o dos minutos.

Retire las muestras del vaso de precipitados y enjuáguelas con tolueno, luego con isopropanol y finalmente séquelas con nitrógeno. En este punto, las muestras deben verse limpias y la capa Sam debe ser invisible a simple vista. Los Sam's preparados de esta manera se pueden usar hasta por dos días cuando se almacenan en condiciones frescas y secas.

La formación fallida de Sam da como resultado una capa de residuos turbia o de tonos desiguales en la superficie. Con el Sams preparado, ahora podemos comenzar la polimerización de la tubulina en microtúbulos. Comience por descongelar la tubulina no marcada y la tubulina r domine, e inmediatamente combínelas en una proporción de dos a uno sin etiquetar para obtener microtúbulos brillantes.

Mézclalos bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. A continuación, polimerice la tubulina durante 20 a 40 minutos en un baño de agua caliente a 37 grados centígrados mientras la tubulina se polimeriza. Prepare un tampón de Taxol para tuberías mezclando 20 micromolares de Taxol con tampón para tuberías.

Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y en vórtice, y luego coloque el tubo en el baño caliente a 37 grados centígrados. Después de la polimerización, diluya los microtúbulos en tampón Taxol de tubería tibia y protéjalos de la luz. Verifique que la polimerización de los microtúbulos haya sido exitosa y que los microtúbulos sean estables bajo varios minutos de excitación por fluorescencia.

Mediante la obtención de imágenes de los microtúbulos preparados con una mezcla de eliminación de oxígeno con polimerización de la tubulina en microtúbulos completos. Comencemos a modelar el MTS con electroforesis. Para comenzar, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara en tiras delgadas colocándolo en un portaobjetos de vidrio y, con una cuchilla de afeitar, coloque dos tiras de cinta adhesiva de doble cara a través de la muestra recubierta de Sam estampada, de modo que el electrodo quede entre las tiras con la ruta de conexión perpendicular a la cinta.

Coloque el contraelectrodo en la cinta de doble cara con el lado metálico tocando la cinta de modo que el borde de la muestra sobresalga del contraelectrodo unos tres milímetros. Corte varios tramos de 15 centímetros de alambre magnético de cobre aislado y pele un centímetro del aislamiento de ambos extremos. Use una pequeña gota de pintura plateada para conectar un cable al área dorada expuesta del sustrato mientras tiene cuidado de evitar el contacto eléctrico con el contraelectrodo.

Ahora use pintura plateada para conectar un segundo cable al mostrador. Los cables de los electrodos unidos con pintura plateada se pueden asegurar aún más a las muestras con cinta adhesiva. A continuación, con una pipeta, introduzca los microtúbulos en la imagen de dilución deseada con un aumento de 20x y localice el patrón en la oblea de silicio antes de aplicar un voltaje.

Debido a la profundidad de la cámara de flujo, es posible que se necesiten objetivos de larga distancia de trabajo para obtener imágenes de la superficie superior de la cámara de flujo. La distancia desde la superficie de la muestra hasta la superficie superior de la cámara de flujo está determinada por el grosor de la cinta y debe ser de alrededor de 60 a 100 micrómetros. Aplique un voltaje de hasta un voltio y observe la migración de los microtúbulos.

Si se desea el atrapamiento reversible de los microtúbulos. Use esmalte de uñas para sellar la cámara de flujo para evitar la deriva lateral y use voltajes más bajos de hasta aproximadamente 0.5 voltios. La migración se puede rastrear ajustando el plano vertical de enfoque del microscopio con los voltajes aplicados alrededor de 0,9 a 1,2 voltios, los microtúbulos se localizan en las superficies de los electrodos.

Un voltaje más alto hará que la migración sea más rápida y la adhesión más fuerte, pero un voltaje excesivo inducirá la electrólisis y la despolimerización. Microtúbulos, Acabamos de mostrarle cómo preparar microelectrodos recubiertos de Sam para el patrón de MT porque el recubrimiento SAM evita la absorción microtubárica en los microelectrodos. Este procedimiento también se puede utilizar para el modelado reversible de microtúbulos.

Además, este proceso no se limita solo a los microtúbulos, sino que también se puede utilizar para modelar biomoléculas en general. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.