Name: Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-25T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a fabricar monocapas de polietilenglicol sobre microelectrodos de oro para prevenir biofouling y permitir el patrón de biomoléculas mediante electroforesis. Este método mejora la funcionalidad de dispositivos biomédicos.

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Reconocemos Melissa Grunlan útil para los debates sobre la formación de SAM. Esta investigación fue financiada en parte por la Fundación Robert A. Welch (A-1585).

Preparación de los reactivos Preparar tampón PIPES (80 TUBOS mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, ajustada a pH 6,8 con KOH). Alícuota y almacenar la glucosa oxidasa, catalasa y glucosa a -70 ° C y taxol a -20 ° C de acuerdo con los protocolos existentes. 1,2 alícuotas y la tubulina almacenar a -70 ° C de acuerdo con las instrucciones que se incluyen por el proveedor. Au microelectrodos patrón utilizando la litografía <ol><li> Corte de obleas de silicio en sustratos 1 cm &#39;1,5 cm con un escribano o un cortador de la oblea. Limpia los sustratos, colocándolos en un recipiente con acetona suficiente para cubrirlas y ultrasonidos durante 5 minutos. Sin permitir que el sustrato se seque, lávelos en acetona fresca, y luego enjuagar inmediatamente en nitrógeno con isopropanol y seco. </li><li> Fabricar microelectrodos Au sobre los sustratos limpios usando estándar, de tono positivo fotolitografía o litografía por haz de electrones, dependiendo del tamaño de las características deseadas. 3 En el diseño de la geometría del modelo, mantenga el diámetro de cada patrón de electrodos por debajo de 100 micrones para asegurar la cobertura de la PEG SAM (que se describe en la siguiente sección). Incluyen almohadillas de contacto (~ 300 mm 2) posición 300 a 500 mm del modelo con una línea de 1 mm de conectar el teclado con el electrodo (Fig. 1). Coloque los patrones litográficos cerca de la mitad del sustrato para permitir que el espacio alrededor del patrón para el montaje de la cámara de flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="la figura 1" /></a> Figura 1. Geometría de la muestra. </li><li> Después del desarrollo de la estructura de la capa de resistir, el principio de una línea en la resistencia de la plataforma de contacto con el borde del sustrato con una pinza (Fig. 1). Tras la deposición de metales, el cero se permite el contacto eléctrico entre el electrodo y el borde del sustrato. Una cámara de deposición, de preferencia con dos fuentes, se utiliza para depositar la capa de metal. Los electrodos están formados por la deposición de 2 nm de Cr (de adhesión), seguido de 6 nm de Au, sin romper el vacío. Una microbalanza de cristal de cuarzo equipado dentro de la cámara se puede utilizar para medir el espesor de las películas durante la deposición. </li></ol> Preparar el SAM <ol><li> Precaliente el horno y en un área bien ventilada a 75 ° C. Prepare la solución silanización añadiendo 20 ml de tolueno a un vaso de vidrio de 250 ml. A continuación, añadir 1 ml de PEG-silano (es decir, 5% v / v) para el tolueno con una pipeta de plástico. Mezcle en el PEG-silano y pipeteando arriba y abajo 5 a 10 veces y luego se agita con la pipeta durante 30 segundos. </li><li> Colocar las muestras patrón en el vaso con el lado estampado mirando hacia arriba, asegurándose de que estén completamente sumergidos en la solución de tolueno PEG-silano y se espacian uniformemente en la parte inferior del vaso. Coloque el recipiente en el horno y hornear 18 a 21 horas a 75 ° C. Mientras que el SAM se está formando, preparar el contraelectrodo (ver abajo) y ensamblar los componentes adicionales necesarios para el resto de pasos. </li><li> Después de 18-21 horas en el horno, el tolueno se evapora dejando las muestras patrón de un líquido viscoso PEG-silano residuos. Agregar 20 ml de tolueno en el vaso y tomar las muestras durante 1-2 minutos. Quitar las muestras del vaso y enjuagar con tolueno, a continuación, isopropanol, y finalmente en seco con nitrógeno. En este punto, las muestras deberán mirada limpia y la capa de SAM debe ser invisible a simple vista. SAM preparado de esta forma se pueden utilizar hasta dos días cuando se almacena bajo condiciones de frío seco (25 ° C, humedad moderada). Infructuosos resultados de la formación de SAM en una capa de residuos nublado o desiguales tonos en la superficie. </li></ol> Fabricar el contraelectrodo En la configuración de la cámara de deposición mismo que se utiliza para la deposición de microelectrodos, hacer un contraelectrodo depositando 1 nm de Cr, seguido de 4 nm de Au en un 22 x 50 mm N º 1 y N º 0 cubreobjetos. El contraelectrodo debe ser casi transparente con un tinte de color gris claro o rosa. Guarde el contraelectrodo recubierta de arriba abajo en una placa de Petri para mantenerlo limpio. Tubulina polimeriza en MT <ol><li> Descongele etiqueta tubulina y tubulina rodamina y de inmediato se combinan en una proporción de 1:2 etiquetados con etiqueta para obtener brillantes MTs. Mezclar pipeteando arriba y abajo varias veces. Polimeriza la tubulina durante 20-40 minutos en un baño de agua caliente a 37 ° C. La longitud de la MT serán mayores para los tiempos de polimerización más. Mientras que la tubulina se polimeriza, preparar un tampón PIPES-taxol mediante la adición de paclitaxel a 20 mm en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón PIPES. Mezclar el taxol y pipeteando arriba y abajo varias veces y agitación, y luego colocar el tubo en el baño se calienta a 37 ° C. Después de la polimerización, se diluye la MTs por 1 / 100 en caliente TUBOS taxol-buffer y el escudo de la luz. MTs preparado de esta manera se alarga más deel tiempo y el paquete, que puede ser reducida por dilución. </li><li> Preparar una mezcla de oxígeno 10 veces más basura (OS) mediante la combinación de 30 ml de tampón TUBOS frío (0-4 ° C), 5 ml de 50% 2-mercaptoetanol, 5 glucosa oxidasa ml, 5 ml de catalasa, glucosa y 5 ml. 2 de la glucosa debe añadirse pasado. Mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo 3-5 veces después de agregar cada componente. Coloque la mezcla de OS en el hielo, sino que se mantendrá vigente por aproximadamente 2 horas. </li><li> Verifique que la polimerización MT fue un éxito y que la MT son estables en varios minutos de excitación de fluorescencia por imágenes de los preparados MTs con 1 mezcla de OS. Para obtener imágenes de los MTs preparado de esta manera, asegúrese de usar una combinación de excitación / emisión de filtro adecuado para la fluorescencia de rodamina. Determinar la dilución de trabajo óptima para los filamentos de imágenes individuales por diluyendo aún más el sistema multilateral de 1 / 10 a 1 / 100 con tampón PIPES y las imágenes con 1 mezcla de OS. </li><li> Preparar una cámara de flujo colocando un grande (22 x 50 mm) y pequeño (22 x 22 mm) cubreobjetos con dos pedazos de cinta de doble cara ponen 2-3 mm. La cinta es fácil de cortar en tiras, colocándolo en un portaobjetos de vidrio y el corte con una cuchilla de afeitar. Introducir unos pocos microlitros de MTs en la celda de flujo utilizando una micropipeta. Para imágenes de gran aumento, mucho trabajo los objetivos de la distancia puede ser necesario para obtener imágenes de la superficie superior de la cámara de flujo. La distancia desde la superficie del cubreobjetos / muestra a la superficie superior de la cámara de flujo se determina por el grosor de la cinta y debe ser 60 a 100 mm. </li></ol> Patrón de MTs mediante electroforesis <ol><li> Preparar una cámara de electroforesis mediante la colocación de dos finas tiras de cinta de doble cara en la muestra patrón, SAM recubiertos de tal manera que el electrodo se encuentra entre las tiras de conexión con la ruta perpendicular a la cinta (Fig. 2). Coloque el contraelectrodo en la cinta de doble cara con la parte de metal que tocan la cinta de tal manera que el borde de los aleros de la muestra el contraelectrodo en alrededor de 3 mm (Fig. 2). Corte varias longitudes de 15 cm de alambre de cobre con aislamiento magnético y tira de 1 cm del aislamiento de los dos extremos. Conecte un cable a la zona expuesta Au del sustrato con una pequeña gota de pintura de plata, mientras que teniendo cuidado de no hacer contacto eléctrico con el contraelectrodo (esto se puede comprobar con un multímetro). Conecte un segundo cable al contraelectrodo con pintura plateada. Cables conectados con la pintura de plata puede ser más seguro para las muestras con cinta adhesiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="la figura 2" /></a> Figura 2. Flujo conjunto de células de un microscopio de fluorescencia invertido. </li><li> Introducir MTs a la dilución deseada utilizando tampón PIPES combinado con el sistema operativo a 1x concentración final. Imagen de 20X y localizar el patrón en la oblea de silicio antes de aplicar un voltaje. Opcionalmente, la cámara de flujo pueden ser sellados con esmalte de uñas para evitar que el flujo de fluidos y la migración de MT en el plano de la cámara de flujo. </li><li> Aplique una tensión de hasta 1 V y observar la migración de las MTs. Voltajes más bajos (hasta cerca de 0.5 V) se puede utilizar si atrapando reversible de MTs se desea, sin embargo esto requiere de sellado de la cámara de flujo para evitar la deriva lateral. Esmalte de uñas que funciona bien para el sellado de los extremos abiertos de la cámara de flujo. Con tensiones superiores a unos 0,7 V, algunos de adhesión MT puede ser visto en el patrón, aunque será débil. Tensiones superiores a alrededor de 0,9 V, la migración de MT será más rápido, y la adhesión será más fuerte. Por encima de alrededor de 1,2 V de la probabilidad de inducción de la electrólisis (formación de burbujas de gas) y también para la destrucción de los microelectrodos se incrementa significativamente. La migración puede ser rastreado mediante el ajuste del plano vertical del foco del microscopio. Si se lleva a cabo correctamente, el MTS se localizan en la superficie de los electrodos. </li></ol>

<ol><li>Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html</a> (2009).</li>
<li>Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Microlithography%2C+Micromachining%2C+and+Microfabrication%3A+Microlithography%22">Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography</a>. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La migración de MT es fácil de visualizar mediante microscopía de fluorescencia debido a su brillo y la fluorescencia de fondo bajo. El método es aplicable en general a los patrones de biomoléculas, ya que sólo se requiere que las biomoléculas ser inducidos a realizar un cargo neto por el ajuste adecuado del pH. Electroósmosis se evita en esta configuración, porque no hay superficies cargadas, tales como las paredes de sílice utilizado en electroforesis capilar. Varias modificaciones de este...

No. 1 de vidrio de borosilicato cubreobjetos (22 x 50 mm) fueron adquiridos de VWR. Pulido grado electrónico de tipo p &lt;111&gt; obleas de silicio fueron adquiridos de Addison Engineering, Inc. de alta pureza pintura de plata fue obtenida de Structure Probe, Inc. (Catálogo # 5001 AB). Aislado de cobre fino calibre imán (~ 0,08 mm (0,003 pulgadas) de diámetro) se puede obtener de las compañías de componentes electrónicos.

antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de biomoléculas patrones

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Se presenta un procedimiento para la formación de un poli (etilenglicol) (PEG) trimetoxisilano auto-ensambladas monocapa (SAM) en un substrato de silicio con microelectrodos de oro. El PEG-SAM se forma en una etapa de montaje simple y evita incrustaciones en las superficies de silicio y oro. El SAM se utiliza para microelectrodos abrigo estampado con el estándar, de tono positivo litografía. El uso de los microtúbulos como ejemplo, se aplica un voltaje de DC para inducir la migración electroforética al electrodo SAM recubiertos de una manera reversible. Una cámara de flujo se utiliza para obtener imágenes de la migración y los patrones de electroforesis de microtúbulos<em&gt; In situ</em&gt; Mediante microscopía de epifluorescencia. Este método es generalmente aplicable a los patrones de biomoléculas, ya que emplea la electroforesis para inmovilizar las moléculas objetivo y por lo tanto no requiere de interacciones moleculares específicas. Además, evita los problemas encontrados al intentar patrón de las moléculas de SAM directamente utilizando técnicas litográficas. La compatibilidad con litografía por haz de electrones permite a este método que se utilizará para las biomoléculas patrón en la nanoescala.

Se presenta un procedimiento para la formación de un poli (etilenglicol) auto-ensambladas monocapa (PEG-SAM) en un substrato de silicio con microelectrodos de oro. El PEG-SAM se forma en un solo paso y evita la contaminación biológica en las superficies de silicio y oro. Electroforesis se utiliza para modelar biomoléculas a la nanoescala.

Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones

Presentamos un procedimiento para formar una monocapa autoensamblada (SAM) de trimetoxisilano de poli(etilenglicol) (PEG) sobre un sustrato de silicio con oro...

Este procedimiento comienza fabricando un microelectrodo sobre un sustrato de silicona. Se forma una bicapa autosamblada de polietilenglicol sobre el microelectrodo y el sustrato para evitar la contaminación de los microtúbulos. Luego se preparan microtúbulos marcados con rumina.Finalmente, los microtubúlos se distribuyen sobre los electrodos tratados mediante electroforesis. Hola, soy John Noel del Laboratorio Nana del Departamento de Física y del Laboratorio de Biomecánica Molecular del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Texas A&M. Soy Wil free Teza del Departamento de Física y director del Centro de Ciencia y Tecnología Habilidad en la Universidad Texas A&M.Y soy Juan Quang, director del Laboratorio de Biomecánica Molecular del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para fabricar microelectrodos recubiertos con una monocapa autoensamblada no adherente. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el plegamiento de microtúbulos mediante electroforesis.Así que comencemos. Para empezar, utilice un cortador de obleas o lápiz óptico para cortar obleas de silicio en trozos de un centímetro por 1,5 centímetros que servirán como sustratos. A continuación, limpie los sustratos colocándolos en un vaso de precipitados con suficiente acetona para cubrirlos y someta a ultrasonidos durante cinco minutos sin permitir que los sustratos se sequen.Lávelos con acetona fresca y luego enjuáguenlos inmediatamente con isopropanol y séquelos con nitrógeno. Mediante litografía fotónica de tono positivo estándar o litografía por haz de electrones, fabrique los microelectrodos de oro sobre los sustratos limpios. Al diseñar la geometría del patrón, mantenga el diámetro de cada patrón de electrodo por debajo de 100 micrones. Para asegurar la cobertura mediante la monocapa autoensamblada de trimetoxisilano de polietilenglicol o peg Sam, incluya pads de contacto posicionados entre 300 y 500 micrómetros del patrón, con una línea de un milímetro que conecte el pad con el electrodo.Después del desarrollo del patrón en la capa de resistencia, utilice pinzas para rayar una línea en la resistencia desde el pad de contacto hasta el borde del sustrato. Durante la deposición del metal, el rayón permitirá el contacto eléctrico entre el electrodo y el borde del sustrato. Se utiliza una cámara de deposición, preferiblemente con dos fuentes, para depositar la capa metálica.Los electrodos se forman mediante la deposición de dos nanómetros de cromo, seguidos de seis nanómetros de oro. Sin romper el vacío, se puede utilizar un microbalance de cristal de cuarzo equipado dentro de la cámara para medir el espesor de las películas durante la deposición. Ahora podemos comenzar a preparar la monocapa autoensamblada en un área bien ventilada, precalentar un horno a 75 grados Celsius. Prepare la solución de silanización añadiendo un mililitro de peg silano a 20 mililitros de tolueno en un vaso de precipitados de vidrio de 250 mililitros.Mezcle bien pipeteando de arriba abajo de cinco a 10 veces y luego agite con la pipeta durante 30 segundos. Coloque las muestras de patrón en el vaso de precipitados con el lado del patrón hacia arriba, asegurándose de que queden completamente sumergidas en la solución y espaciadas uniformemente a lo largo del fondo del vaso. Coloque el vaso en el horno y hornee durante 18 a 21 horas mientras se forma el Sam.Prepare el electrodo contador depositando un nanómetro de cromo seguido de cuatro nanómetros de oro sobre un cubreobjetos de vidrio de 22 por 50 milímetros. El electrodo contador debe ser casi transparente con un tinte gris claro o rosado. Guarde el electrodo contador con la cara recubierta hacia arriba en una placa de Petri para mantenerlo limpio.Después de 18 a 21 horas en el horno, retire el vaso de precipitados del horno. El tolueno debería haberse evaporado, dejando las muestras del patrón en un residuo viscoso de peg cline. Añada 20 mililitros de tolueno al vaso de precipitados y remoje las muestras durante uno a dos minutos.Retire las muestras del vaso de precipitados y enjuáguelas con tolueno, luego con isopropanol y finalmente séquelas con nitrógeno. En este punto, las muestras deben verse limpias y la capa de Sam debe ser invisible a simple vista. Las muestras preparadas de esta manera son utilizables hasta por dos días si se almacenan en condiciones frías y secas.Una formación fallida de Sam da como resultado un residuo turbio o con tono desigual que recubre la superficie. Con los Sam preparados, ahora podemos comenzar la polimerización de tubulina en microtúbulos. Comience descongelando la tubulina sin marcar y la tubulina con marcaje r, y combínelas inmediatamente en una proporción de dos a uno, sin marcar respecto a marcada, para obtener microtúbulos brillantes.Mézclelos bien pipeteando arriba y abajo varias veces. A continuación, polimerice la tubulina durante 20 a 40 minutos en un baño de agua caliente a 37 grados Celsius mientras la tubulina se está polimerizando. Prepare un tampón pipes Taxol mezclando 20 micromolar de Taxol con tampón pipee.Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y vortexeando, luego coloque el tubo en el baño calentado a 37 grados Celsius. Después de la polimerización, diluya los microtúbulos en tampón de Taxol tibio y protéjalos de la luz. Verifique que la polimerización de microtúbulos haya sido exitosa y que los microtúbulos sean estables bajo varios minutos de excitación de fluorescencia.Mediante la obtención de imágenes de los microtúbulos preparados con una mezcla eliminadora de oxígeno tras completarse la polimerización de la tubulina en microtúbulos. Comencemos a configurar el MTS mediante electroforesis. Para empezar, corte una tira de cinta adhesiva doble cara en tiras delgadas colocándola sobre un portaobjetos y utilizando una cuchilla de afeitar para cortar; coloque dos tiras de cinta adhesiva doble cara sobre la muestra recubierta con Sam y configurada, de modo que el electrodo quede entre las tiras y el camino de conexión corra perpendicularmente a la cinta.Coloque el electrodo contador sobre la cinta adhesiva de doble cara con el lado metálico en contacto con la cinta, de modo que el borde de la muestra sobresalga del electrodo contador aproximadamente tres milímetros. Corte varios trozos de alambre magneto de cobre aislado de 15 centímetros de longitud y retire un centímetro del aislamiento en ambos extremos. Utilice una pequeña gota de pintura de plata para fijar un alambre al área de oro expuesta del sustrato, teniendo cuidado de evitar el contacto eléctrico con el electrodo contador.Ahora use pintura de plata para conectar un segundo cable al electrodo contador. Los cables del electrodo fijados con pintura de plata pueden asegurarse aún más a las muestras con cinta adhesiva. A continuación, utilizando una pipeta, introduzca los microtúbulos a la dilución deseada, observe la imagen a 20 x de magnificación y localice el patrón en la oblea de silicio antes de aplicar un voltaje.Debido a la profundidad de la cámara de flujo, puede ser necesario utilizar objetivos de larga distancia de trabajo para observar la superficie superior de la cámara. La distancia entre la superficie de la muestra y la superficie superior de la cámara de flujo está determinada por el grosor de la cinta y debe ser de aproximadamente 60 a 100 micrómetros. Aplique un voltaje de hasta un voltio y observe la migración de los microtúbulos.Si se desea un atrapamiento reversible de los microtúbulos, use esmalte de uñas para sellar la cámara de flujo y evitar la deriva lateral, y utilice voltajes más bajos, hasta aproximadamente 0,5 voltios. La migración se puede rastrear ajustando el plano vertical de enfoque del microscopio con voltajes aplicados de alrededor de 0,9 a 1,2 voltios, momento en el cual los microtúbulos se localizan en las superficies de los electrodos.Un voltaje más alto hará que la migración sea más rápida y la adhesión más fuerte, pero un voltaje excesivo inducirá electrolisis y despolimerización. Microtúbulos, acaban de mostrarle cómo preparar microelectrodos recubiertos con SAM para el patrón de MT porque el recubrimiento de SAM evita la absorción de microtúbulos en los microelectrodos. Este procedimiento también puede utilizarse para el patrón reversible de microtúbulos.Además, este proceso no se limita solo a los microtúbulos, sino que también puede utilizarse para configurar biomoléculas en general. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

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