La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

Hola, soy Hillary Kemp del laboratorio de Cecilia Owens. Y yo soy Cecilia Owens. Hillary y yo estamos en la división de ciencias básicas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle.

Hoy te vamos a mostrar una técnica para hacer embriones quiméricos de pez cebra, también conocidos como mosaicos genéticos. Este procedimiento nos permite evaluar las bases celulares de la función de los genes durante el desarrollo. Podemos preguntarnos si un gen dado funciona dentro de las células con un fenotipo mutante conocido como función autónoma celular, o dentro de ese entorno celular conocido como no autonomía celular.

Hacemos estos mosaicos mediante el trasplante de células entre embriones mutantes de tipo salvaje en una blastula o en una etapa gastronómica temprana. Posteriormente, evaluamos la función génica mediante la observación del fenotipo y el genotipo de las células derivadas del donante en su entorno de hospedaje. Así que comencemos.

En esta parte del protocolo, se inyecta un tinte de linaje en el embrión donante para que se pueda seguir el destino de las células derivadas del donante después del trasplante. Cualquier variedad de ácidos nucleicos también se puede inyectar usando esta técnica, sin embargo, omita el paso de decoración al inyectar ADN antes de trabajar con los embriones, prepare una placa de inyección insertando un portaobjetos de vidrio en un ángulo de 45 grados a través de la parte más ancha de una placa de Petri. Tres cuartas partes llenas de 1.2%aros en el medio embrionario de estreptococos de la pluma.

Retire la corredera después de que el agro se endurezca para hacer un canal biselado. Llene el comedero con medio embrionario de estreptococos de la pluma. Ahora proceda con la decoración enzimática de embriones en etapa de célula única.

Incubar los embriones en la etapa de una célula durante uno a cinco minutos en 0,5 miligramos por mililitro. Solución Pronase. Vigila de cerca la decoración.

Tan pronto como el corion comience a colapsar visiblemente, sumerja los embriones en el agua del sistema y esto se derrama por todo el corium y los embriones se quedan atrás en la parte inferior de la curva del pico. Y es muy importante que los embriones no salgan a la superficie del agua una vez más, y que la mayoría de ellos se hayan quitado el corion. Hay algunos que se arremolinan en el exterior que no lo hacen.

Si todavía hay algo en su corion, entonces el acto de pipetearlos de esta manera los sacará y luego liberará los embriones para que nunca golpeen la superficie del agua. Es importante manipular los embriones recubiertos con una pipeta que haya sido pulida al fuego para suavizar sus bordes. Transfiera suavemente los frágiles embriones recubiertos de dec al canal de la placa de inyección utilizando una pipeta de vidrio pulido al fuego de diámetro ancho.

Y luego estamos cargando un solo archivo en este canal. Ahora los embriones están listos para ser inyectados con marcador de linaje utilizando un fuego calibrado con precisión, una pipeta de inyección de vidrio estirado y una plataforma de inyección a presión. Vamos a usar un plato lleno de medio embrionario para romper la aguja y un plato lleno de aceite para calibrar la aguja.

Este es solo un aceite mineral de grado de laboratorio estándar regular. Tomamos un par de pinzas de relojero afiladas y luego, mientras miramos a través de los oculares para determinar cuál sería el tamaño correcto, colocamos las pinzas a cada lado de la aguja y luego rompemos suavemente el chip, lo que en realidad no puedo hacer sin mirar para determinar el volumen de tinte o ribonucleótido que se administra. Antes de empezar.

Mida el tamaño del bolo en un plato de aceite mineral. La aguja debe romperse de modo que se administre un bolo de un nanolitro con uno o dos pulsos del microinyector. El volumen del bolo se puede calcular a partir de su diámetro medido por un micrómetro ocular.

Inyecte un nanolitro de una solución de dextrano fluorescente al 3% directamente en el cuerpo de embriones recubiertos entre las etapas de una y cuatro células. Lo que voy a hacer es colocar el embrión justo debajo de la aguja. Voy a clavar la aguja suavemente en el centro de la yema y pisar el pedal.

Una vez inyectado, es importante inyectar en los chorros de yema para que el tinte se transporte a las células. Esta inyección será suficiente para rastrear las células en embriones quiméricos durante varios días de desarrollo. Idealmente, hacemos esto antes de que las células alcancen la etapa de cuatro células, criamos los embriones inyectados a baja densidad en una placa de Petri recubierta llena de embrión fresco de estreptococo de pluma. Medio.

Tenga en cuenta que los embriones inyectados tienden a tener una tasa de desarrollo ligeramente más lenta, incuban los embriones a diferentes temperaturas, 25, 28 y 31 grados centígrados para escalonar su desarrollo y maximizar la ventana de tiempo durante la cual se pueden realizar los trasplantes. El aparato utilizado para el trasplante de células en la blástula del pez cebra consiste en una jeringa Hamilton controlada por accionamiento unida por un grifo de parada de tres vías a un depósito de aceite mineral y a un soporte de micropipeta a través de un tramo de tubo flexible. Elimine todas las burbujas de aire del sistema, ya que arruinarán su capacidad para controlar la succión y la presión.

Utilice un microscopio estereoscópico que tenga una óptica de alta calidad de al menos un aumento DX. Para controlar el posicionamiento del soporte de la micropipeta y la aguja, sugerimos un micromanipulador manual NARA shige. Asegúrese de que esté fijado al banco mediante una base magnética para evitar que las vibraciones se transfieran al trasplante.

Las agujas de trasplante de aguja están hechas de pipetas capilares de vidrio que se estiran hasta un cono suave en un electrodo polar. Consulte el protocolo JoVE del laboratorio de Miriam Goodman para obtener detalles sobre cómo extraer pipetas bajo un microscopio de disección, rompa la punta de la aguja extraída. Para los trasplantes en etapa de blastola, el diámetro exterior de la aguja debe medir aproximadamente de 50 a 60 micras o de 30 a 40 micras para una transferencia en etapa gástrica.

Para que una transferencia de etapa gastro mejore la penetración, primero se debe tirar de una púa afilada en el extremo de la aguja con un microforraje, alisar la punta de la aguja acercándola al filamento de la micro forja. A continuación, gire la aguja para que el borde delantero del bisel pueda entrar en contacto con el filamento. Una vez que el borde delantero de la aguja entre en contacto con el filamento, retíralo rápidamente para crear una púa.

Para evitar dañar las células, la púa debe estar recta y la punta de la aguja no debe curvarse Con el rig y las agujas de trasplante preparados, está listo para hacer embriones quiméricos. Los trasplantes de blástula se utilizan para trasplantar células entre embriones cuando no se requiere información del mapa de destino fino. Con la excepción de las células germinales primordiales, la mayoría de las células generalmente no están comprometidas con un destino en esta etapa.

El mapa de destino de la blástula es tal que podemos distinguir entre las células que van a dar lugar al ectodermo y las células que van a dar lugar al mesodermo. La mesodérmica y la endodérmica se encuentran cerca del margen del embrión en estadio de blastola, mientras que los progenitores dérmicos, que van a dar lugar al sistema nervioso y a la dermis superficial, se encuentran más alejados del margen del embrión. Por lo tanto, cuando trasplantamos células en embriones en etapa de blastola, podemos dirigir esas células al presunto mesodermo o al presunto ectodermo.

Pero no podemos dirigir las células a ninguna región particular del ectodermo o del mesodermo porque no lo sabemos. En la etapa de blástula donde se encuentra el lado dorsal del embrión, prepare las placas de inyección con anticipación haciendo flotar un molde de plástico con filas emparejadas de protuberancias en forma de cuña en una placa de Petri, medio llena de 1.2%aros fundidos en medio embrionario. Una vez que el aros se haya solidificado, retire la plantilla dejando filas de pocillos de forma triangular, cada uno lo suficientemente grande como para contener un embrión.

Llene el molde de trasplante con medio embrionario para estreptococos en pluma y cargue los embriones en etapa de blástula individualmente en cada pocillo con una pipeta de vidrio pulido al fuego. Ahora transfiere los embriones a los pozos de trasplante inicialmente para que se acuesten de lado. Organice los embriones de manera que los embriones del donante se coloquen en una columna y los embriones del huésped se coloquen en la columna adyacente.

Coloque la placa en el escenario de modo que cuando la aguja de trasplante ingrese a un embrión, la aguja empuje el embrión contra la pared posterior de su pocillo. Con el micromanipulador, baje la aguja de trasplante en el plato en un ángulo bastante pronunciado. Lo ideal es que la aguja de trasplante entre en el embrión en un ángulo aproximado de 45 grados.

Una vez que la punta de la aguja esté por debajo de la superficie del medio embrionario, extraiga una pequeña cantidad de medio embrionario en la aguja girando el accionamiento micrométrico que controla la jeringa Hamilton. Para un control más preciso, la interfaz entre el aceite mineral y el medio embrionario debe permanecer en la parte delgada y cónica de la aguja, no demasiado cerca del extremo. Coloque suavemente el embrión donado con la aguja y luego retire la aguja e introduzca el capuchón de blástula del embrión en la posición deseada.

Un golpe rápido y fuerte penetrará en el embrión sin hacer que ruede. Extraiga las células del donante lenta y cuidadosamente en la aguja para evitar cizallar las células. Evite introducir la yema en la aguja después de haber absorbido el número deseado de células.

Invierta ligeramente la presión para detener la succión y retire la aguja del embrión huésped y coloque el embrión huésped en su posición. Al mover la placa de trasplante, se pueden hacer pequeños ajustes en la posición del embrión huésped girándolo suavemente con la aguja de trasplante, siempre que se tenga cuidado de no tocar la yema. Al expulsar las células del donante en el embrión huésped, evite introducirlas en el embrión, ya que esto dañará y matará las células del donante de un solo donante. El embrión se puede trasplantar a varios huéspedes después de que se hayan completado las transferencias de células.

Transfiera los pares de hospederos donantes a los pocillos recubiertos de una placa de 24 pocillos para que continúen desarrollándose. La única excepción a la regla de que las células no están comprometidas con destinos particulares en la etapa de blástula son las células germinales primordiales. Las células germinales primordiales se especifican muy temprano en el desarrollo y están comprometidas con su destino de estado de célula germinal primordial.

Desde una etapa muy temprana, las células germinales primordiales se encuentran cerca del margen de una blástula y un embrión en etapa gástrica. Entonces, si el objetivo del experimento de trasplante es trasplantar células germinales primordiales, entonces es muy importante de dónde provienen las células en el embrión donante y no importa a dónde van en el embrión huésped. Así que la regla es que para las células somáticas, es importante a dónde van en el embrión huésped que determinará su destino.

En el caso de las células germinales primordiales, es importante su procedencia en el embrión donante, ya que su destino ya está determinado. Si el objetivo es trasplantar células germinales primordiales, entonces las células deben ser recogidas del margen de la esperanza del embrión donante, y están situadas justo cerca del margen del embrión en cuatro pequeños grupos de cada una de las tres o cuatro células en esta hoja, esta etapa de lanza o etapa alta de desarrollo. Y hay que recogerlos con mucho cuidado para no empezar a chupar la yema accidentalmente.

Bien, y eso es lo que he hecho allí, y ahora me estoy moviendo a un embrión huésped. Ahora, las células germinales primordiales se afinarán en la región de la cresta genital del embrión en el que se encuentren. Por lo tanto, no hay necesidad de trasplantar estas células germinales primordiales al margen al que llegarán por sí mismas.

Así que solo estoy trasplantando, devolviéndolos a cualquier lugar viejo en el postembrión. La clave para los trasplantes de células germinales, que es todo lo contrario a cualquier otro tipo de trasplante, es que importa de dónde provienen las células del donante. El trasplante de células a un huésped en etapa gastrointestinal permite al experimentador aprovechar el mapa del destino del pez cebra cebra que emerge cuando el escudo embrionario se hace visible.

Es posible distinguir diferentes tipos de tejidos, así como los dominios dentro del presunto sistema nervioso central. Cuando se transfieren células entre embriones en la etapa de gastro list, existen algunas variaciones en el protocolo, pero el procedimiento general es similar al trabajo con blastos para montar gastros. Primero unte una tira vertical de metilcelulosa en la depresión de un portaobjetos de depresión de vidrio, luego inñe con una cantidad generosa de medios de embrión de estreptococo de pluma utilizando una transferencia de pipeta pulida al fuego.

Un donante y tres anfitriones de la etapa de escudo para el deslizamiento de la depresión. Seleccione embriones de donantes que sean un poco más jóvenes que los huéspedes. Se requiere una nueva herramienta para manipular el pegamento gastros, los extremos de una longitud corta de dos libras de hilo de pescar de prueba en el extremo de un tubo capilar.

Haciendo así un pequeño bucle. Use el lazo para enrollar suavemente los embriones del donante y del huésped en la parte superior de la tira de metilcelulosa y mételos en la metilcelulosa hasta que estén seguros. Ródelos a su posición de modo que la región objetivo esté en la parte superior.

Ya que durante el trasplante, la aguja entrará en el embrión tangencialmente para entregar las células del donante sin dañar el macho. Los trasplantes en estadio gastro se realizan mejor en un microscopio compuesto en estadio fijo. Utilice los controles del micromanipulador para enfocar la punta de la aguja de trasplante.

Coloque el soporte de la micropipeta y la aguja en un ángulo bastante poco profundo para que la aguja esté lo más cerca de la horizontal que permita el borde de la depresión en el portaobjetos. A continuación, perfore el embrión donante. Si se monta correctamente, no rodará cuando entre la aguja de trasplante a menos que el embrión sea demasiado viejo para permitir que la aguja penetre fácilmente.

Para evitar perforar el embrión, la aguja debe entrar en el embrión en un plano focal que sea ligeramente más profundo que el de la EDL. Una vez perforadas, se puede extraer un gran número de células del donante para hasta tres inyecciones de células huésped. Al extraer las células, evite succionar la yema moviendo la aguja a medida que las células se absorben si lo desea.

Se pueden recolectar embriones adicionales para obtener más células usando la misma aguja antes de expulsar las células en el huésped, durante la eyección de células en el embrión huésped expulsar las células mientras la aguja se extrae a través del área objetivo en lugar de depositar las células en un solo grupo. Esto aumentará la probabilidad de que las células del donante contribuyan al tejido deseado. Una vez que se completen las transferencias de células, coloque todo el portaobjetos en una placa de Petri e inñéguelo con cuidado con el embrión de estreptococo de la pluma. Medio.

Durante las próximas horas, la metilcelulosa se disolverá liberando los embriones. El número de células transferidas depende del objetivo específico del experimento. Las células de un solo donante se pueden trasplantar a tres o cuatro huéspedes la mañana después del trasplante.

Los huéspedes se pueden examinar para determinar si la selección de células del donante fue exitosa. El trasplante exitoso de células germinales primordiales de la edad de la blástula da como resultado células marcadas con fluorescencia, colocadas ventralmente cerca de la unión entre el ylk y la extensión del ylk. Así que acabamos de mostrarte cómo hacer trasplantes en etapa de gástrula y blástula.

Al realizar esta técnica, es importante elegir el tipo correcto de método de trasplante para el tejido objetivo al que espera dirigirse con sus células. Por lo tanto, el trasplante en etapa de blástula es suficiente para determinar las células que van a la dermis y no al ectodermo. Y también se puede utilizar esta técnica para dirigirse a las células germinales primordiales.

Si desea hacer un mapeo más fino, es mejor utilizar un trasplante de edad gastrosiva en el que ya se haya determinado el lado dorsal. Y así, con esta técnica, puede dirigir las células a varias partes del sistema nervioso, en particular, el prosencéfalo, el mesencéfalo, el cerebro posterior y la médula espinal. Así que eso es todo.

Muchas gracias por mirar y mucha suerte con todos tus experimentos.